Die Autoren möchte besonders den folgenden Personen für ihre technischen und intellektuellen Beiträge zur Entwicklung dieser Methoden im Laufe der Jahre danken: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science und PTI Research) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), und Mary Waugh (Dartmouth Medical School). Sie würden auch gerne die Bowdoin Klasse von 2006 aus den jährlichen Kurse in Forschung Methoden und Anwendungen der Durchflusszytometrie, die die Daten in Abbildung 2 dargestellt generiert danken. Durchflusszytometrie wurde am Roswell Park Cancer Institute Durchflusszytometrie Laboratory, die zum Teil durch Geräte Zuschüsse aus dem NIH Gemeinsame Instrument Programm wurde durchgeführt, und erhält Unterstützung von der Core-Stipendium (5 P30 CA016056-29) von der NationalCancer Institute der Roswell Park Cancer Institute und an der Abramson Cancer Center Durchflusszytometrie und Zellsortierung Ressource Laboratory der University of Pennsylvania, die zum Teil von Geräten Zuschüsse aus dem NIH Gemeinsame Instrument Program wurde gegründet und erhält Unterstützung von NIH # 2P30 CA016520 vom National Cancer Institute. Die Arbeit in den Abbildungen 3 und 5 gezeigt wurde teilweise auch durch SBIR Zuschuss EB00228 unterstützt von den National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) verliehen PTI Research, Inc.

Ein. Allgemeine Membrane Markierung mit PKH26 Handy-Tracking Dye (Ref. 25; Abbildung 1) <ol><li> Verwenden Sie sterile Technik für Schritte von 1,1 bis 1,9. Planen ~ 10 7 humanen peripheren mononukleären Blutzellen oder Lymphozyten (hPBMC, HPBL) unter Verwendung des Labors Standardmethode unter Zusatz eines endgültigen 300 xg Spin die Thrombozytenfunktion Kontamination zu minimieren. Resuspendieren Zellen bei 10 7 / ml in HBSS +1% BSA und auf Eis stellen, Reservierung eines 500 ul Aliquot (5x10 6 Zellen) für den Einsatz in Schritt 2. </li><li> Ort 5x10 6 Zellen (500 ul) in einem 12 x 75 mm konische Polypropylen-Röhrchen. Waschen Sie einmal mit 3,5 ml HBSS. Vorsichtig den Überstand aspirieren, so dass nicht mehr als 15-25 ul von Restflüssigkeit, aber dabei nicht um Zellen zu entfernen. Dieses Röhrchen eine 2x Zellsuspension in Schritt 1,4 vorzubereiten. </li><li> Während der Zelle Waschen in Schritt 1.2, 0,5 ml Verdünnungspuffer C Kennzeichnung Fahrzeugs (von der PKH26GL kit) zu einem 12 x 75 mm konischen Polypropylen-Röhrchen. Dieses Röhrchen zu prepsind ein 2x PKH26 Lösung in Schritt 1.5. </li><li> 0,5 ml Verdünnungspuffer C Kennzeichnung Fahrzeugs zu der gewaschenen Zellpellet aus Schritt 1.2 und aspirieren und abzugeben 3-4 mal, um eine einzelne Zellsuspension (2x Zellen) erhalten. Vermeiden Sie Blasenbildung und übermäßige Vermischung, die die Lebensfähigkeit der Zellen und Recovery reduzieren kann. </li><li> Unmittelbar nach der Herstellung der 2x Zellsuspension in Schritt 1,4, bereiten Sie einen 2x (4 uM) Farbstofflösung durch Zugabe von 2,0 ul von 1,0 mM PKH26 Farbstoff Lager in Ethanol (aus dem PKH26GL Kit) zur Diluent C Rohr in Schritt 1,3 und Vortex vorbereitet verteilen gleichmäßig. </li><li> Unmittelbar nach der Herstellung der 2x Farbstofflösung in Schritt 1,5, schnell pipettieren 2x Zellsuspension aus Schritt 1.4 in den 2x Farbstofflösung und gleichzeitig absaugen und verzichten 3-4 mal vollständig zerstreuen Zellen in Farbstoff nicht tun sollten:. Hinzuzufügen 1,0 mM Farbstoff direkt an Zellen; gießen 2x Zellen in 2x Farbstoff; oder fügen 2x Zellen Farbstoff 2x unter Vortexen. Da Färbung ist fast augenblicklich, wie Methoden weniger Ertrageinheitliche Intensitäten als die empfohlene Methode (Abbildung 2). </li><li> Nach 1 min, 1,0 ml hitzeinaktiviertes Serum oder HBSS + 5% BSA an Farbstoffaufnahme in die Zellmembranen zu stoppen. Andernfalls ausreichend Protein zu verwenden riskiert die Bildung von Farbstoff-Aggregaten, die mit Zellen können Pellet während der Waschschritte und unbeabsichtigte Kennzeichnung von anderen Zellen in einem Experiment. Wenn Medium mit 10% hitzeinaktiviertem Serum (CM) oder HBSS 1% BSA ist als Stop-Reagenz verwendet werden, durchzuführen Anfärben in einem 15 ml konischen Polypropylen-Röhrchen hinzu und mindestens 5,0 ml Stoppreagenz zur Adsorption aller versichern unincorporated Farbstoff. </li><li> Zentrifugieren Sie die markierten Zellen für 5 min @ ~ 400 x g. Vorsichtig den Überstand aspirieren, ohne Zellen. Waschen des Pellets zweimal mit 4 ml HBSS CM oder 1% BSA, Dispergieren des Pellet gut vor erneuter Zentrifugation. Zur Übertragung von Farbstoff auf Rohrwänden adsorbiert minimieren und Reinigungswirkung, übertragen die Zellen in ein frisches Polypropylenröhrchen nach dem first Resuspension. Hinweis: ausreichend gefärbten Zellen wird eine deutliche rosa Schimmer im Pellet aufweisen. </li><li> Resuspendieren der gewaschenen Zellpellet in 1,0 ml HBSS +1% BSA. Zählen Sie die Zellen, zu bestimmen Erholung der Zellen, und die Lautstärke um eine Endkonzentration von 10 7 / ml geben. Bei sorgfältiger Aspiration, sollte die Erholung der Zellen ≥ 85% betragen. Wenn die Erholung der Zellen &lt;70%, die Ursache ermitteln, bevor Sie fortfahren. Ziehen Sie eine 150 ul Aliquot (1.5x10 6 Zellen) und auf Eis für den Einsatz in Schritt 2. </li></ol> 2. Vorbereitung der Instrumente und Assay-Setup Controls (Tabelle 1) <ol><li> Aliquot 50 ul (5x10 5) ungefärbter Zellen aus der Zellsuspension im Schritt 1.1 in jedem von fünf 1,8 ml Eppendorf-Röhrchen gespeichert: 1, 3, 4, 5 und 7. Aliquot 50 ul (5x10 5) des PKH26 pos Zellen aus Schritt 1.9 in jede der drei Röhren: 2, 6 und 8. </li><li> Fügen Sie 10 ul IgG-Block (100 ug / Rohr IgG; siehe Tabelle der Reagenzien), um Tubes 1-8und 10 min bei Raumtemperatur (20-25 ° C) inkubiert. </li><li> Hinzufügen eines sättigenden Menge des Antikörpers (e) in Tabelle 1 bis Rohre 4, 5, 7 gezeigt, und 8 und inkubieren alle Proben (Tubes 1-8) 30 min lang bei Umgebungstemperatur und vor Licht geschützt. </li><li> 1,5 ml HBSS 1% BSA auf allen Proben, Pellet die Zellen durch Zentrifugation (5 Min. bei 400 × g) und wäscht einmal mit 1,5 ml HBSS 1% BSA, bei sorgfältiger Aspiration zu vermeiden Zellverlust. </li><li> Resuspendieren jede Probe in 500 ul HBSS +1% BSA. Wenn für Proben auf Ihrem Durchflusszytometer analysiert werden benötigt, um ein 12 x 75 mm Rundbodengefäß übertragen. Fügen Sie 10 ul von 100 ug / ml 7-AAD täglichen Arbeitszeit Lager (siehe Tabelle der Reagenzien), um Rohre 3, 6, 7 und 8, wie in Tabelle 1 angegeben. Inkubieren auf Eis für 30 min vor der im Durchflußzytometer setup und Färbung Überprüfung (Schritt 3) zu verwenden. </li></ol> 3. Durchflusszytometer Setup und Färbung Verification <ol><li> Stellen Sie sicher, dass der Fluss cytometer einwandfrei funktioniert, mit der Labor etablierten Verfahren für die tägliche Qualitätskontrolle. Überprüfen, dass Signale, kann ohne weiteres in jedem spektralen Fenster verwendet werden detektiert werden, und daß Detektorreaktionen linear proportional zur Intensität in dem Fenster für die Proliferation Überwachung 14 verwendet werden signalisieren. </li><li> Erwerben FSC vs SSC Daten für Rohr 1 mittels linearer Anzeige Waage. Passen eines jeden Detektors, so dass die Amplifikation Lymphozytenpopulation in dem unteren linken Quadranten des Dot-Plot fällt, ist nicht außerhalb des Messbereichs in beiden Parameter, und wird nicht unterbrochen durch Schwellenwertbildung. Sammle ungated FSC vs SSC Daten für alle Proben in den Schritten von 3,3 bis 3,7. </li><li> Erfassung von Daten für Rohr 1 mit keine Farbe Entschädigung und logarithmische Darstellung Skalen für alle 4 Fluoreszenzdetektoren. Stellen Sie die einzelnen Detektors Hochspannung (HV), um die Autofluoreszenz von ungefärbten Lymphozyten auf der Skala stellen mit wenigen / keine Zellen, der sich in den ersten Kanal. Stellen Sie eine Analyse Grenze für jedes Histogrammentsprechend dem hellsten 2% ungefärbter Zellen. </li><li> Mit keine Farbe Entschädigungen und der HV-Einstellungen in den Schritten 3,2 und 3,3 festgelegt, erwerben Daten für Tube 2, Sammeln FSC, SSC und Signale in allen 4 Fluoreszenz-Detektoren. Für den Detektor verwendet, um PKH26 Fluoreszenz zu überwachen, ob alle PKH26 pos Zellen auf der Skala erscheinen als einem einzigen symmetrischen Peak in der 3 rd -4 th Jahrzehnt mit wenigen / ohne Zellen in der letzten Kanal. Wenn es mehrere Gipfel sind oder Peakform schief ist, wiederholen Sie Schritt 1 mit besonderer Aufmerksamkeit zur Minimierung und Mischtechnik (Abbildung 2) salzen. Falls erforderlich, Farbstoffkonzentration. </li><li> Mit Einstellungen in Step 3,3 etablierten erwerben Daten für Tube 3, Sammeln FSC, SSC und Signale in allen 4 Fluoreszenz-Detektoren. Für den Detektor verwendet, um 7-AAD-Fluoreszenz zu überwachen, zu überprüfen, ob 7-AAD pos Zellen oberhalb der 2%-Grenze in Schritt 3,3 festgelegt (dh die nicht-lebensfähigen Zellen gut gelöst werden fallenvon lebensfähigen 7-AAD neg Zellen). </li><li> Mit Einstellungen in Step 3,3 etablierten erwerben Daten für Rohr 4, das Sammeln FSC, SSC und Signale in allen 4 Fluoreszenz-Detektoren. Überprüfen Sie, dass CD8 pos Zellen gut aus ungefärbten Zellen (dh, fall über der 2%-Grenze in Schritt 3,3 für die FITC-Detektor aufgebaut) gelöst. Wiederholen Sie mit Tube 5 und sicherstellen, dass CD8 pos Zellen gut aus ungefärbten Zellen (dh Herbst über der 2%-Grenze in Schritt 3,3 für die APC-Detektor aufgebaut) gelöst. </li><li> Mit Einstellungen in Step 3,3 etablierten erwerben Daten für Rohre 6, 7 und 8, Sammeln FSC, SSC und Signale in allen 4 Fluoreszenz-Detektoren. </li><li> Verwenden Sie die List-Modus Dateien für Tubes 1-5 und Ihre Farbkompensation Software, um eine Farbe zu etablieren überschneiden Matrix für jedes Fluorochrom in den Detektoren eingesetzt, um die drei anderen Fluorochromen Überwachung gesammelt. Wenden Sie diese Matrix List-Mode-Datei für die Probe 6 und sicherstellen, dass die Anwesenheit von PKH26 labeling verändert nicht die Fähigkeit, 7-AAD pos Zellen nachzuweisen. </li><li> Übernehmen die Farbe überlagern Matrix aus Schritt 3,8 bis List-Mode-Datei für die Probe 7 und sicherstellen, dass: a) 3 gut gelöst Subpopulationen (CD3 neg CD4 neg, CD3 pos CD4 neg und CD3 pos CD4 pos) auf einem FITC vs identifiziert werden können APC Dot-Plot, und b) die Anwesenheit von anti-CD3-FITC und anti-CD4-APC verändert nicht die Fähigkeit, 7-AAD pos Zellen nachzuweisen. Wenn das Vorhandensein von Anti-CD3-FITC verändert die oberen 2%-Grenze für Daten auf dem PKH26 Detektor erfasst, stellen die Grenze nach Bedarf. </li><li> Übernehmen Sie die Farbüberlappung Matrix aus Schritt 3,8 bis List-Mode-Datei für Probe 8. Wenn das Vorhandensein von PKH26 Kennzeichnung ändert sich die 2%-Grenze für das FITC, 7-AAD oder APC Detektoren von den Set mit der Autofluoreszenz-Steuerung in Schritt 3,3, stellen die Grenze (n) nach Bedarf mit Rohr 7 der Tabelle 1 und sicherzustellen, dass es ist dennoch möglich, distinguish CD3 pos CD4 pos, CD3 pos CD4 neg und CD3 neg CD4 neg Zellen unter Verwendung des eingestellten Grenze (n). </li></ol> 4. Proliferation Modellauswahl für die Zellteilung Überwachung von Dye Dilution <ol><li> Bestimmen Sie den Abstand zwischen den Generationen, die abhängig von der Anzahl der Kanäle und logarithmische Jahrzehnten auf Ihrem Zytometer ist. Für digitale Instrumente, wird dieser Wert, typischerweise 4 oder 5 Jahrzehnten durch die Anzahl der Behälter in dem digitalen Signalprozessor bestimmt. Bei analogen Instrumenten, wo die Zahl der Jahrzehnte selten ist eine ganze Zahl, erfordert eine genaue Modellierung die genaue Anzahl der Jahrzehnte experimentell bestimmt werden. Um dies zu tun, werden die Daten aus einer Mischung von kalibrierten fluoreszierenden Kügelchen in die herstellerspezifische zugeordneten relativen Intensitäten bei denselben Detektor Hochspannungs-Einstellungen in dem Experiment verwendet erworben. Die Position der Peaks Wulst direkt für die Kalibrierung der logarithmischen Skala in Bezug auf intichte Bereich pro log Jahrzehnt. Konkret wird dies durch Auftragen der Kanalnummer für jedes Kügelchen Typs gegen den log des herstellerspezifischen zugewiesenen Wert durchgeführt. Die Steigung einer Best-Fit-Geraden für den Wulst Datenwerte gibt die Anzahl der relativen Intensität pro Kanal. Multipliziert mit der Anzahl der Kanäle, wird dieser Wert dann die Anzahl von Log Jahrzehnten für die volle Skala, von dem die Anzahl von Kanälen, die einem Zwei-fache Abnahme der Intensität (dh Tochtergeneration Abstand) 14 berechnet werden kann. </li><li> Entscheiden für einen festen Abstand zwischen den Generationen verwenden, bzw. dass der Abstand zu schweben. A Standard (fest) Einstellung verwenden, den Generationswechsel Abstandswert in Schritt 4,5 ermittelt, um die Position einer jeden Generation zuzuordnen und wird normalerweise verwendet, wenn das Histogramm fehlt deutliche Spitzen. Ein Float Einstellung erlaubt es jedem Generationswechsel Spitzenposition durch das Histogramm Form bestimmt werden und wird normalerweise verwendet, wenn distinguishable Generationswechsel Gipfel sind evident. </li><li> Entscheiden Sie, ob eine feste Peakbreite für alle Generationen oder einer schwimmenden Breite zu verwenden. Ein fester Breite verwendet die SD berechnet für den unstimulierten Kontrollprobe alle Generationen modellieren und wird in der Regel dann gewählt, wenn die Probe fehlt unterscheidbare Generationswechsel Gipfel. Eine schwimmende Breite erlaubt das Programm unabhängig voneinander variieren die SD für jede Generation und wird am besten mit unterscheidbaren Generationswechsel Peaks verwendet. </li><li> Führen Sie ein Programm mit einer Verbreitung Analyse-Modul (hier ModFit LT Version 3.3). Legen Sie die stimulierte PKH26 pos-Datei aus den Daten zu analysierenden (zB ein stimuliert 96 Stunden-Kultur PKH26 pos Zellen gegengefärbt für Rohr 8 in Tabelle 1). </li><li> Wählen Sie die Parameter für die Analyse, in diesem Fall PKH26 (585/42) gated auf lebensfähigen (7-AAD neg) CD3 pos Lymphozyten und FSC vs SSC kleine Schutt und großen Aggregaten (Abbildung 3) auszuschließen. Bei der Festlegungdiese Regionen vorsichtig sein, um den hohen Vorwärtsstreuung Gebiet, wo Blasten typischerweise gefunden werden, gehören und beachten Sie, dass CD3 Expression kann down-moduliert stimulierten Kulturen. </li><li> Erstellen Sie eine neue Verbreitung Modell mit der Proliferation Wizard. Mit dem Open Data File (Registerkarte Start), laden Sie die unstimulierten PKH26 pos Control-Datei und den Speicherort der Spitze Kanal in der elterlichen Verteilung entsprechend ungeteilten Zellen. </li><li> Analysieren Sie die Datei für den unstimulierten PKH26 pos Kontrolle, unter Hinweis auf die Werte für die elterliche Spitzenposition und Breite (Standardabweichung). Wenn eine feste Peakbreite (SD) gewünscht wird, überprüfen Sie sperren SD. </li><li> Legen Sie die PKH26 neg Kontrolle (z. B. eine 96 Stunden-Kultur PKH26 neg Zellen gegengefärbt für Rohr 7 in Tabelle 1). Anpassen der Anzahl der Generationen, indem die Peak-Kanal für den dunkelsten Generation über dem PKH26 neg. Kontrolle. Dies bestimmt die number der Tochter Generationen das Modell exakt passen und ist typischerweise 6-9 Generationen. </li><li> Öffnen Sie die Datei für die stimulierte Probe (zB eine stimulierte 96 Stunden-Kultur PKH26 pos Zellen gegengefärbt für Rohr 8 in Tabelle 1) und bestätigen, dass die Regionen für die elterliche Spitzenposition und des SD, wie in Schritt 4,7 festgelegt sind, unverändert bleiben. Wenn feste Generationen Abstand gewünscht wird, wählen Sie Standard-Modell Option, ansonsten wählen Sie die Option Frei. </li><li> Analysieren Sie jede experimentelle Datei im Datensatz, mit dem gleichen Modell in Schritt 4,9 definiert. Kleinere Anpassungen der elterlichen Spitzenposition kann, um die besten fit notwendigen definiert sowohl visuell als auch durch die reduzierte Chi-Quadrat (RCS)-Wert. </li><li> Notieren Sie die gewünschte Verbreitung Metriken aus dem Best-Fit für jeden experimentellen Datei im Datensatz. Für eine umfassende Beschreibung der möglichen Kennzahlen siehe Ref. 22. </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).</li><li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease.">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li><li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

K. Humphrey, JD Tario, Jr. und PK Wallace haben vorkommerziellen Zelle Tracking Reagenzien für die Auswertung von Life Technologies, Inc. und BD Biosciences erhalten. AD Bantly und JS Moore haben vorkommerziellen Zelle Tracking Reagenzien zur Auswertung erhalten von Life Technologies, Inc. und die Finanzierung von PTI Research, Inc. für die vorkommerzielle Charakterisierung verschiedener CellVue Zelle Tracking Farbstoffe. K. Muirhead wird durch SciGro, Inc., das beratende Dienstleistungen für Phanos Technologies, Inc. (Inhaber des PKH und CellVue Farbstoffe) und bietet Backup technischen Support für Sigma-Aldrich und Molekulares Targeting Technologies, Inc. (beschäftigt Distributoren davon Farbstoffe). Produktion und den freien Zugang zu diesem Artikel wird von Sigma-Aldrich gesponsert.

Die hier beschriebenen Methoden sind diejenigen in unserer gemeinsamen Labors gefunden, die meisten sicher geben, optimale Ergebnisse für hPBMC Kennzeichnung mit Membran Farbstoffe 13,16,18 und Lymphozyten Untergruppe Phänotypisierung und Proliferation Tracking entweder mit Membran-oder Protein-Farbstoffe 2,11,13,16, 18. Wie in den 1 und 2 dargestellt ist, ist hell einheitliche Kennzeichnung am leichtesten durch Begrenzung des Gehalts physiologische Salze und unter Verwendung eines Misch-Technik erreicht, dass zusätzlich eine schnelle, homogene Belichtung aller Zellen auf die gleiche Konzentration an Farbstoff. Weil Färbung mit Farbstoffen erfolgt Membran durch Partitionieren in die Lipid-Doppelschicht, können andere Variablen, die frei verändern Farbstoffkonzentration auch Auswirkungen Markierungseffizienz. Zum Beispiel die Kennzeichnung mit rundem Boden Polystyrolröhrchen Ergebnisse in weniger effizient Auswaschung von Salzen vor Resuspension in Diluent C und auch in reduzierten freien Farbstoffkonzentration durch Adsorption an Rohrwänden färben, insbesonderebei niedrigeren Farbstoffkonzentrationen. Beide Faktoren tendenziell breitere Färbung Distributionen, als wenn die Kennzeichnung erfolgt mit konischen Boden Polypropylenröhrchen (Abbildungen 3, 4 und geben unveröffentlichte Ergebnisse). Probe Alter und Art kann auch Auswirkungen Peakbreite selbst wenn optimierten Färbeverfahren verwendet werden. Zum Beispiel Lebensläufe PKH26 pos Lymphozyten aus frisch entnommenem Blut reichen von 14-20% (Abbildung 3, Nr. 13 und unveröffentlichte Ergebnisse), während Lebensläufe Lymphozyten von 24 Stunden alten Blutproben oder TRIMA Pherese Filter-Bereich isoliert 25 bis 30 % (Abbildung 4 und Nr. 18). Färbung Einheitlichkeit und das Ausmaß, in dem sie nicht lebensfähige Zellen von der Analyse ausgeschlossen werden kann sowohl Einfluss darauf, ob unterscheidbare Tochter Gipfel zeigt sich in der Farbstoffdilution Profil, was sich wiederum auf Wahl eines Verbreitung Modell, um die beobachteten Daten (Abbildungen 5 und 6 passen </strong&gt;). Obwohl ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) wird hier als ein Beispiel verwendet werden, um Software-Metriken wie Proliferationsindex und Zwischenprodukt Frequenz (Figuren 3, 5 und 6; Tabelle 3) zu erzeugen verwendet, andere Software-Module Pakete enthalten, zu analysieren Proliferation Daten. Dazu gehören FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) und FlowJo (Baum Star, Inc., Ashland, OR). Alle diese Programme verwenden eine nicht-lineare Analyse der kleinsten Quadrate, iterativ zu finden die beste Anpassung an den Rohdaten durch Veränderung der Position, Höhe und SD (oder Breite) der Gauß-Peaks, welche sequentielle Tochter Generationen. Proliferativen Index (PI) und Precursor Frequency (PF) sind die am häufigsten verwendeten Maßnahmen Ausmaß der Proliferation. PI, wie durch ModFit definiert ist, ist ein Maß für die Zunahme der Zellzahl im Verlauf des Assays, analog zu den &quot;Stimulationsindex &#39;eines Thymidinaufnahme Assay. PF gibt den Anteil der Zellen in der anfänglichen populatIonen, die auf den Stimulus von proliferierenden reagiert. Vorsicht ist geboten, aber beim Lesen der Literatur seit Terminologie variiert etwas zwischen den Software-Paketen (zB FlowJo und ModFit verwenden unterschiedliche Definitionen und Berechnungen für das, was durch die &quot;Proliferation Index&quot; gemeint) 22. Die kritischen Fragen hier für die Kennzeichnung und die Proliferation Analyse mit Membran Farbstoffe diskutiert werden auch auftreten, wenn unter Verwendung von Protein-Farbstoffe. Zum Beispiel muss sorgfältig auf Mischtechnik auch beobachtet, zusammen mit Ausschluss tot / sterbenden Zellen werden, um eine gleichmäßige Verteilung und unterscheidbar Tochter Peaks erhalten bei Verwendung CFSE (Abbildung 6) 2-4,13,18,24. Geeignete Wahl der Fluorochrome zur Phänotypisierung und Rentabilitätsprüfung ist auch wichtig zu übermäßigen spektrale Überlappung und die Unfähigkeit, Antikörper positiv Zellen erkennen zu vermeiden, insbesondere mit sichtbarem emittierenden Protein Farbstoffe wie CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;. Verminderung der Konzentration von Tracking Farbstoff vermindert die Kompensation Probleme in benachbarten spektralen Kanälen, sondern begrenzt auch die Anzahl der Zellteilungen, die überwacht werden können, bevor Tochterzelle Intensitäten mit Autofluoreszenz überschneiden beginnen. Alternativ können Sie auch neuere Zellen Tracking Farbstoffe wie weit rot emittierenden CellVue Claret (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) oder violett emittierenden CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) kann die Entschädigung Probleme (Abbildung 6) zu reduzieren. Schließlich, obwohl Farbstoffe Membran allgemein geringere Toxizität aufweisen 11,26 neigen, ist es möglich, über-Label-Zellen mit entweder Klasse von Farbstoff. Daher ist es immer notwendig, zu überprüfen, dass die Konzentration von Tracking verwendete Farbstoff wurde nicht die Funktionalität der Zellen verfolgt werden (Abbildung 6) 3,13,16,18 verändert.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz oder Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Im Handel erworben </td></tr><tr><td> 7-D Aminoactinomycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks balanced salt solution (HBSS) </td><td> Life Technologies </td><td> 14175-079 </td><td> Calcium und Magnesium frei, ohne Phenolrot </td></tr><tr><td> Human IgG Cohn-Fraktion II und III Globuline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> Maus-Anti-Human-CD3-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> Sättigungskonzentration von Labor-Titration </td></tr><tr><td> Maus-anti-human-CD4-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> Sättigungskonzentration von Labor-Titration </td></tr><tr><td> Maus-anti-human-CD4-PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> Sättigungskonzentration von Labor-Titration </td></tr><tr><td> Maus-anti-humanen CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> Sättigungskonzentration von Labor-Titration </td></tr><tr><td> Maus-anti-humanen CD8-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD0805 </td><td> Sättigungskonzentration von Labor-Titration </td></tr><tr><td> Maus-Anti-Human-CD19-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD1905 </td><td&gt; Sättigungskonzentration von Labor-Titration </td></tr><tr><td> Maus-Anti-Human-CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> Sättigungskonzentration von Labor-Titration </td></tr><tr><td> Maus-Anti-Human-CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> Sättigungskonzentration von Labor-Titration </td></tr><tr><td> Maus-anti-humanem CD3 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1,0 mg / ml; Azid freien </td></tr><tr><td> Maus anti-human CD28 </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1,0 mg / ml; Azid freien </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 rot fluoreszierende Zellen Linker Kit mit 10-3M PKH26 in EtOH und Diluent C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PKH26GL-1KT oder MINI26-1KT </td><td> Verfahren in Schritt 1 gelten auchKits enthalten PKH67 oder andere CellVue Farbstoffe </td></tr><tr><td> CellVue Claret weit rot fluoreszierende Zellen Linker Kit mit 10-3M CellVue Claret in EtOH und Diluent C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MINCLARET-1KT oder MIDCLARET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (und-6)-Carboxyfluoresceindiacetat, Succinimidylester (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> C34554 </td><td> Nicht-fluoreszierenden; gespalten durch die Membran Esterasen zu bilden fluoreszierende aminoreaktiven Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD Fixierbarer Violet </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile 12 x 75 mm konische Polypropylenröhrchen &amp; Mützen </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> Eine bessere Membran Farbstoff Färbung Wirkungsgrad (reduzierte Farbstoffadsorption, weniger Zellverlust während Überstand Aspiration) </td></tr><tr><td> 12 x 75 mm round unten Polystyrolröhrchen </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> Durchflusszytometer </td><td> BD Bioscience </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> Jede Zytometer kann FITC, PKH26 und 7-AAD (ex. 488 nm.; Em 520 nm, 567 nm und 655 nm) zu erkennen und APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) </td></tr><tr><td> Durchflusszytometer </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII CyAn </td><td> Jede Zytometer kann FITC, PKH26 und 7-AAD (ex. 488 nm.; Em 520 nm, 567 nm und 655 nm) zu erkennen und APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Labor hergestellt </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, konzentrierten Lager </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 mg / ml in PBS. Frieren in Aliquots und bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, worKönig Stock </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 ug / ml in PBS; Vorbereitung von 1 mg / ml gefrorenen Vorrat täglich. </td></tr><tr><td> IgG-Block </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / ml Human IgG Cohn-Fraktion II und III Globuline + 10 mg / ml BSA. </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

Fluoreszierende Zelle Tracking Farbstoffe in Kombination mit Durchfluss-und Bildzytometrie, sind leistungsfähige Werkzeuge, mit denen die Interaktionen und Schicksale verschiedener Zelltypen in vitro und in vivo zu studieren. 1-5 Obwohl es buchstäblich Tausende von Publikationen mit solchen Farbstoffen, einige die am häufigsten auftretenden Zell-Tracking-Anwendungen sind die Überwachung von: <ol><li> Stamm-und Progenitorzellen Ruhe, Proliferation und / oder Differenzierung 6-8 </li><li> Antigen-angetriebenen Membrantransfer 9 und / oder Vorläufer Zellproliferation 3,4,10-18 und </li><li> immunregulatorische und Effektor-Zell-Funktion 1,18-21. </li></ol> Kommerziell erhältliche Zelle Tracking Farbstoffe weisen in Bezug Chemien und Fluoreszenzeigenschaften aber die große Mehrheit fallen in eine von zwei Klassen auf ihren Mechanismus Zellmarkierung basiert. &quot;Membrane Farbstoffe&quot;, verkörpert durch PKH26 sind stark lipophile Farbstoffe tHut Partition stabil, aber nicht kovalent in Zellmembranen 1,2,11. &quot;Protein-Farbstoffe&quot;, verkörpert durch CFSE, sind Amino-Reaktivfarbstoffen, die stabile kovalente Bindungen mit Zellproteinen 4,16,18. Jede Klasse hat ihre eigenen Vor-und Nachteile. Der Schlüssel zu ihrem erfolgreichen Einsatz, vor allem in multicolor Studien, in denen mehrere Farbstoffe verwendet werden, um verschiedene Zelltypen zu verfolgen, ist es daher, die kritischen Fragen, die optimale Nutzung der einzelnen Klassen 2-4,16,18,24 verstehen. Die Protokolle, die hier hervorzuheben drei häufigsten Ursachen für schlechte oder variable Ergebnisse bei der Verwendung von Zell-Tracking Farbstoffe. Diese sind: <ol><li> Nichtbeachtung helle, gleichmäßige, reproduzierbare Kennzeichnung zu erreichen. Dies ist ein notwendiger Ausgangspunkt für jede Zelle Tracking Studie, sondern erfordert Aufmerksamkeit auf verschiedene Variablen bei der Verwendung von Membran-Farbstoffe als bei Verwendung von Protein-Farbstoffe oder Gleichgewicht Bindungsreagenzien wie Antikörper. </li><li> Suboptimal Fluorochrom Kombinationen and / oder Nichtbeachtung enthalten kritische Entschädigung Kontrollen. Tracking Farbstofffluoreszenz ist in der Regel 10. Februar - 10. März Mal heller als Antikörper-Fluoreszenz. Es ist daher unerlässlich, um sicherzustellen, dass die Anwesenheit von Markierungsfarbstoff beeinträchtigt nicht die Fähigkeit, andere Sonden verwendet erkennen. </li><li> Failure, um eine gute Passform mit Peak-Modellierungs-Software zu erhalten. Solche Software ermöglicht quantitative Vergleich der proliferativen Reaktionen auf verschiedene Populationen oder Reize auf Vorstufe Frequenz oder anderen Metriken. Zur Erzielung eines guten Passform, erfordert jedoch Ausschluss von toten / sterbenden Zellen, die Farbstoffdilution Profile verzerren können und Abstimmung der dem Modell zugrundeliegenden Annahmen mit den Eigenschaften des beobachteten Farbstoffdilution Profil. </li></ol> Hier genannten Beispiele veranschaulichen, wie diese Größen beeinflussen Ergebnisse bei Verwendung Membran und / oder Protein-Farbstoffe, die Zellproliferation zu überwachen.

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Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Erfolgreicher Einsatz von Zell-Tracking Farbstoffe Immunzellfunktion und Proliferation zu überwachen umfasst mehrere wichtige Schritte. Wir beschreiben Methoden zur: 1) Erhalten hell, einheitliche, reproduzierbare Label-ten mit Membran Farbstoffe; 2) Auswählen Fluorochrome und Datenerfassung Bedingungen, und 3) der Auswahl eines Modells, die Zellproliferation auf Farbstoffdilution zu quantifizieren.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

35.4K Aufrufe.  Roswell Park Cancer Institute. Erfolgreicher Einsatz von Zell-Tracking Farbstoffe Immunzellfunktion und Proliferation zu überwachen umfasst mehrere wichtige Schritte. Wir beschreiben Methoden zur: 1) Erhalten hell, einheitliche, reproduzierbare Label-ten mit Membran Farbstoffe; 2) Auswählen Fluorochrome und Datenerfassung Bedingungen, und 3) der Auswahl eines Modells, die Zellproliferation auf Farbstoffdilution zu quantifizieren.

Serie: Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of almost all intracellular signaling. Moreover, they play an important role in environmental adaptation and drug treatment, and are often involved in disease pathogenesis and pathology (1). Protein-protein interactions are intrinsic to signaling pathways, and to gain more insight in these complex biological processes, sensitive and reliable methods are needed for studying cell surface proteins. Two-dimensional (2-D) electrophoresis is used extensively for detection of biomarkers and other targets in complex protein samples to study differential changes. Cell surface proteins, partly due to their low abundance (1 2% of cellular proteins), are difficult to detect in a 2-D gel without fractionation or some other type of enrichment. They are also often poorly represented in 2-D gels due to their hydrophobic nature and high molecular weight (2). In this study, we present a new protocol for intact cells using CyDye  DIGE Fluor minimal dyes for specific labeling and detection of this important group of proteins. The results showed specific labeling of a large number of cell surface proteins with minimal labeling of intracellular proteins. This protocol is rapid, simple to use, and all three CyDye DIGE Fluor minimal dyes (Cy 2, Cy 3 and Cy 5) can be used to label cell-surface proteins. These features allow for multiplexing using the 2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2-D DIGE) with Ettan  DIGE technology and analysis of protein expression changes using DeCyder  2-D Differential Analysis Software. The level of cell-surface proteins was followed during serum starvation of CHO cells for various lengths of time (see Table 1). Small changes in abundance were detected with high accuracy, and results are supported by defined statistical methods.

A simple and specific method was demonstrated for fluorescent labeling and enhanced detection of cell surface proteins without a fractionation step. Differential abundance in cell surface proteins was analyzed using two-dimensional (2-D) electrophoresis and Ettan&#x2122; DIGE technology.

Selektive Markierung von Zelloberflächen-Proteinen unter Verwendung von CyDye DIGE Fluor Minimal Farbstoffe

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Forschung

Biologie

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Handy-Tracking Mit Photoconvertible Proteine ​​während der Zebrafisch-Entwicklung

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modellierung des Morbid Human Genome mit Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Verfahren zur Haut Verwundung und Assays für Wound Antworten in<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Vergleich von drei verschiedenen Methoden zur Bestimmung Zellproliferation in Brustkrebs-Zelllinien

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery (References 2 - 3, and references therein). A characteristic that makes the oocyte attractive for foreign channel expression is the poor abundance of endogenous ion channels4. This expression system has proven useful for the characterization of many proteins, among them ligand-gated ion channels.
The expression of GABAA receptors in Xenopus oocytes and their functional characterization is described here, including the isolation of oocytes, microinjections with cRNA, the removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments. The procedures were optimized in this laboratory5,6 and deviate from the ones routinely used7-9. Traditionally, denuded oocytes are prepared with a prolonged collagenase treatment of ovary lobes at RT, and these denuded oocytes are microinjected with mRNA. Using the optimized methods, diverse membrane proteins have been expressed and studied with this system, such as recombinant GABAA receptors10-12, human recombinant chloride channels13, Trypanosome potassium channels14, and a myo-inositol transporter15, 16.
The methods detailed here may be applied to the expression of any protein of choice in Xenopus oocytes, and the rapid solution change can be used to study other ligand-gated ion channels.

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Xenopus Oozyten: Optimierte Methoden für die Mikroinjektion, Entfernen von Follicular Zellschichten und schnelle Lösung Änderungen in elektrophysiologischen Experimenten

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

LDL-Cholesterin-Aufnahme-Assay mit Live Cell Imaging-Analyse mit Zelle Systemüberwachung

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

Messung der Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen mit Hilfe der Klickchemie

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two decades ago and since then continues to contribute greatly to our understanding of the filamentous fungal lifestyle. This paper provides a practical guide for the utilization of the two membrane dyes FM 1-43 and FM 4-64 and the four cell wall stains Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 and Congo Red. The focus is on their low-dose application to ascertain artefact-free staining, their co-imaging properties, and their quantitative evaluation. The presented methods are applicable to all filamentous fungal samples that can be prepared in the described ways. The fundamental staining approaches can serve as starting points for adaptations to species that might require different cultivation conditions. First, biophysical and biochemical properties are reviewed as their understanding is essential for using these dyes as truly vital fluorescent stains. Secondly, step-by-step protocols are presented that detail the preparation of various fungal sample types for fluorescent live-cell imaging. Finally, example experiments illustrate different approaches to: (1) identify defects in the spatio-temporal organization of endocytosis in genetic mutants, (2) comparatively characterize shared and distinct co-localization of GFP-labeled target proteins in the endocytic pathway, (3) identify morphogenetic cell wall defects in a genetic mutant, and (4) monitor cell wall biogenesis in real time.

Vital fluorescent dyes are essential tools for live-cell imaging analyses in modern fungal cell biology. This paper details the application of established and lesser-known fluorescent dyes for tracking plasma membrane dynamics, endo-/exocytosis and cell wall morphogenesis in filamentous fungi.

Anwendung von Membran- und Zellwandselektiven Fluoreszenzfarbstoffen für die Live-Zell-Bildgebung von filamentösen Pilzen

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...