Les auteurs tiennent à remercier tout particulièrement les personnes suivantes pour leurs contributions techniques et intellectuelles au développement de ces méthodes à travers les années: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis cellulaire des sciences et de la recherche PTI) , Brian Gray (PTI recherche), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc), et Mary Waugh (Dartmouth Medical School). Ils aimeraient également remercier la classe de 2006 Bowdoin des cours annuels dans les méthodes de recherche et les applications de la cytométrie en flux, qui ont généré les données présentées dans la figure 2. La cytométrie en flux a été réalisée au Laboratoire de Roswell Park Cancer Institute de cytométrie en flux, qui a été créé en partie par des subventions d&#39;équipement du programme NIH Instrument partagée, et reçoit le soutien de la Subvention de base (5 P30 CA016056-29) du NationalInstitut du cancer à l&#39;Institut Roswell Park Cancer, et à la cytométrie en flux Abramson Cancer Center et Laboratoire de ressources tri cellulaire de l&#39;Université de Pennsylvanie, qui a été créé en partie par des subventions d&#39;équipement du programme NIH Instrument partagée, et reçoit le soutien du NIH # 2P30 CA016520 du National Cancer Institute. Le travail le montrent les figures 3 et 5 a également été soutenu en partie par subvention SBIR EB00228 de la National Institutes of imagerie biomédicale et de bio-ingénierie (NIBIB) attribué à PTI Research, Inc

1. Marquage membranaire général avec PKH26 Dye Suivi Cellulaire (Réf. 25; figure 1) <ol><li> Utiliser une technique stérile pour les étapes de 1,1 à 1,9. Préparer ~ 10 7 cellules humaines mononucléées du sang périphérique ou des lymphocytes (hPBMC, HPBL) en utilisant la méthode standard de laboratoire avec plus d&#39;une finale 300 xg rotation pour minimiser la contamination des plaquettes. Remettre en suspension les cellules à 10 7 / ml dans du HBSS BSA +1% et le placer sur la glace, en réservant une aliquote de 500 ul (5x10 6 cellules) pour une utilisation dans l&#39;étape 2. </li><li> Lieu 5x10 6 cellules (500 ul) dans un tube de 12 x 75 mm en polypropylène coniques. Laver une fois avec HBSS ml 3.5. Aspirer soigneusement le surnageant en laissant pas plus de 15-25 ul du liquide résiduel, mais en prenant soin de ne pas enlever les cellules. Utiliser ce tube à préparer une suspension de cellules à l&#39;étape 2x 1,4. </li><li> Pendant la cellule laver à l&#39;étape 1.2, ajoutez 0,5 ml de diluant étiquetage véhicule C (à partir du kit PKH26GL) à un 12 x 75 mm tube en polypropylène coniques. Utilisez ce tube pour préparersont une solution de 2x PKH26 à l&#39;étape 1.5. </li><li> Ajouter 0,5 ml de diluant véhicule étiquetage C à la cellule de l&#39;étape culot lavé et 1,2 fois aspirer et distribuer 3-4 pour obtenir une suspension de cellules individuelles (2x cellules). Eviter la formation de bulles et de mélange excessive, ce qui peut réduire la viabilité cellulaire et la régénération. </li><li> Immédiatement après la préparation de la suspension de cellules à l&#39;étape 2x 1,4, préparer un 2x (4 M) en ajoutant une solution de colorant 2,0 l de 1,0 mM PKH26 langue colorant dans de l&#39;éthanol (à partir de la trousse PKH26GL) pour le tube C diluant préparé dans l&#39;étape de vortex et 1,3 disperser uniformément. </li><li> Immédiatement après la préparation de la solution de colorant 2x à l&#39;étape 1.5, pipeter rapidement la suspension cellulaire 2x partir de l&#39;étape 1.4 dans la solution de colorant 2x et en même temps aspirer et distribuer 3-4 fois pour disperser complètement les cellules à colorant ne pas faire:. Ajoutez 1,0 mM colorant directement à cellules et verser cellules 2x 2x dans le colorant, ou ajouter des cellules 2x 2x colorant tout en vortex. Parce que la coloration est quasi instantanée, ces méthodes donnent moinsintensités uniformes que la méthode recommandée (Figure 2). </li><li> Après 1 min, ajoutez 1,0 ml de sérum inactivé par la chaleur ou BSA HBSS +5% pour arrêter la montée du colorant dans les membranes cellulaires. Si vous n&#39;utilisez pas suffisamment de protéines risque de la formation d&#39;agrégats de colorants, qui peuvent culot avec les cellules pendant les étapes de lavage et de provoquer l&#39;étiquetage involontaire d&#39;autres cellules présentent dans une expérience. Si le milieu avec de la chaleur 10% de sérum inactivé (CM) ou du HBSS 1% de BSA doit être utilisé en tant que réactif d&#39;arrêt, effectuer la coloration dans un tube en polypropylène de 15 ml conique et ajouter au moins 5,0 ml de réactif d&#39;arrêt pour assurer l&#39;adsorption de tous non constituée en société colorant. </li><li> Centrifuger les cellules marquées pendant 5 min @ ~ 400 x g. Aspirer soigneusement le surnageant sans enlever les cellules. Laver le culot deux fois avec 4 ml de CM ou BSA HBSS +1%, la dispersion du culot bien avant recentrifugation. À minimiser la contamination de colorant adsorbé sur les parois du tube et d&#39;optimiser l&#39;efficacité du lavage, transférer les cellules dans un tube en polypropylène fraîche après la first remise en suspension. Remarque: de façon adéquate cellules colorées présentera une teinte rose distincte dans le culot. </li><li> Remettre en suspension le culot lavé de cellules dans 1,0 ml de HBSS% de BSA +1. Compter le nombre de cellules, déterminer la récupération des cellules, et régler le volume pour donner une concentration finale de 10 7 / ml. Avec une aspiration prudente, la récupération des cellules doit être ≥ 85%. Si la récupération des cellules est &lt;70%, de déterminer la cause avant de poursuivre. Retirer une aliquote de 150 pl (1.5x10 6 cellules) et les placer sur la glace pour une utilisation à l&#39;étape 2. </li></ol> 2. Préparation des commandes de configuration des instruments et dosage (tableau 1) <ol><li> Aliquote 50 pi (5x10 5) de cellules non colorées de la suspension de cellules sauvegardé à l&#39;étape 1,1 dans chacun des cinq tubes Eppendorf 1,8 ml: 1, 3, 4, 5, et 7. Aliquote de 50 ul (5x10 5) de cellules pos PKH26 de l&#39;étape 1.9 dans chacun des trois tubes: 2, 6 et 8. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;IgG bloc (100 pg / tube d&#39;IgG, voir tableau des réactifs) pour les tubes 8.1et incuber pendant 10 min à température ambiante (20-25 ° C). </li><li> Ajouter une quantité saturante de l&#39;anticorps (s) indiqué dans le tableau 1 pour les tubes 4, 5, 7, et 8 et incuber tous les tubes échantillons (1-8) pendant 30 min à température ambiante et à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Ajouter 1,5 ml de BSA HBSS +1% à tous les échantillons, sédimenter les cellules par centrifugation (5 min à 400 xg) et laver une fois avec 1,5 ml de HBSS + 1% BSA, avec une aspiration prudente afin d&#39;éviter la perte de cellules. </li><li> Resuspendre chaque échantillon dans 500 ul de HBSS +1% BSA. Si nécessaire pour les échantillons à analyser sur votre cytomètre, transférer dans un tube de 12 x 75 mm en bas ronde. Ajouter 10 ul de 100 pg / ml 7-AAD quotidienne stock de travail (voir le tableau des réactifs) pour tubes 3, 6, 7 et 8 comme indiqué dans le tableau 1. Incuber dans la glace pendant 30 minutes avant de l&#39;utiliser dans la configuration du cytomètre de flux et de vérification coloration (étape 3). </li></ol> 3. Configuration cytomètre de flux et de vérification de coloration <ol><li> Vérifiez que le flux de cytoter fonctionne correctement, en utilisant les procédures établies par le laboratoire de contrôle de qualité quotidien. Vérifier que les signaux peuvent être facilement détecté dans chaque fenêtre spectrale à être utilisé, et en ce que les réponses du détecteur sont linéairement proportionnelle à l&#39;intensité du signal dans la fenêtre à utiliser pour la surveillance 14 prolifération. </li><li> Acquérir FSC vs SSC données pour tube 1 en utilisant des échelles d&#39;affichage linéaires. Réglage de l&#39;amplification de chaque détecteur de telle sorte que la population de lymphocytes tombe dans le quadrant inférieur gauche du graphique de points n&#39;est pas hors échelle dans les deux paramètres, et n&#39;est pas interrompue en raison de seuillage. Recueillir des données non synchronisées FSC vs SSC pour tous les échantillons dans les étapes de 3,3 à 3,7. </li><li> Acquérir des données pour le tube 1, en utilisant la couleur et aucune compensation échelles logarithmiques d&#39;affichage pour les 4 détecteurs de fluorescence. Ajuster la haute tension de chaque détecteur (HV) pour placer l&#39;autofluorescence des lymphocytes non colorées sur l&#39;échelle de quelques / pas de cellules d&#39;accumulation dans le premier canal. Définir une limite de l&#39;analyse pour chaque histogrammecorrespondant à 2% les plus brillants de cellules non colorées. </li><li> Utilisation sans compensation de couleur et les réglages HV établi dans les étapes 3.2 et 3.3, l&#39;acquisition de données pour le tube 2, la collecte FSC, SSC et des signaux dans les 4 détecteurs de fluorescence. Pour le détecteur utilisé pour surveiller PKH26 fluorescence, vérifier que toutes les cellules PKH26 pos apparaissent sur ​​l&#39;échelle comme un seul pic symétrique dans la décennie ème 3 ème -4, avec quelques / aucune cellule dans le dernier canal. Si il ya des pics multiples ou la forme du pic est biaisée, répétez l&#39;étape 1 avec une attention particulière au sel de minimisation et de la technique de mélange (Figure 2). Si nécessaire, ajuster la concentration de colorant. </li><li> Utilisation des paramètres établis à l&#39;étape 3.3, l&#39;acquisition de données pour le tube 3, la collecte FSC, SSC et des signaux dans les 4 détecteurs de fluorescence. Pour le détecteur utilisé pour surveiller 7-AAD fluorescence, vérifiez que 7-AAD cellules pos tomber dessus de la limite de 2% établie à l&#39;étape 3.3 (à savoir que les cellules non viables sont bien résolusà partir de cellules viables neg 7-AAD). </li><li> Utilisation des paramètres établis à l&#39;étape 3.3, l&#39;acquisition de données pour le tube 4, la collecte FSC, SSC et des signaux dans les 4 détecteurs de fluorescence. Vérifiez que les cellules CD8 pos sont bien résolus à partir de cellules non colorées (c.-à-automne au-dessus de la limite des 2% fixé à l&#39;étape 3.3 pour le détecteur FITC). Répéter avec le tube 5 et vérifier que les cellules CD8 pos sont bien résolus à partir de cellules non colorées (c.-à-automne au-dessus de la limite des 2% fixé à l&#39;étape 3.3 pour le détecteur APC). </li><li> Paramètres à l&#39;aide établies à l&#39;étape 3.3, l&#39;acquisition de données pour les tubes de 6, 7 et 8, la collecte FSC, SSC et des signaux dans les 4 détecteurs de fluorescence. </li><li> Utilisez les fichiers en mode liste collectées pour tubes 1-5 et votre logiciel de compensation de couleur pour établir une matrice de couleurs se chevauchent pour chaque fluorochrome dans les détecteurs utilisés pour le suivi des trois autres fluorochromes. Appliquer cette matrice dans le fichier mode liste pour l&#39;échantillon 6 et vérifiez que la présence de PKH26 laboratoireeling ne modifie pas la capacité de détecter 7-AAD cellules pos. </li><li> Appliquer la couleur se chevauchent matrice de l&#39;étape 3.8 à la mode fichier liste pour l&#39;échantillon 7 et vérifier que: a) 3 sous-populations bien résolus (CD3 CD4 neg neg, CD3 CD4 pos neg et CD3 CD4 pos pos) peuvent être identifiés sur un FITC vs APC dot plot, et b) la présence d&#39;anticorps anti-CD3-FITC et anti-CD4-APC ne modifie pas la capacité de détecter 7-AAD cellules pos. Si la présence d&#39;anticorps anti-CD3-FITC modifie la limite supérieure de 2% pour les données recueillies sur le détecteur PKH26, réajuster la frontière selon les besoins. </li><li> Appliquer la matrice de couleur chevauchement de l&#39;étape 3.8 à la mode fichier liste pour l&#39;échantillon 8. Si la présence de PKH26 étiquetage modifie la limite des 2% pour le FITC, 7-AAD ou des détecteurs d&#39;APC de ceux qui sont à l&#39;aide de la commande autofluorescence à l&#39;étape 3.3, réajuster la limite (s), si nécessaire en utilisant Tube 7 du tableau 1 et vérifiez qu&#39;il est encore possible de Distinguish CD3 CD4 pos pos pos CD3 CD4 neg, et CD3 CD4 neg neg cellules en utilisant la limite réglée (s). </li></ol> 4. Sélection du modèle pour la surveillance de la prolifération cellulaire par la Division de dilution Dye <ol><li> Déterminer l&#39;espacement entre les générations, ce qui est dépendante du nombre de canaux et des décennies logarithmiques sur votre cytomètre. Pour instruments numériques, cette valeur, typiquement 4 ou 5 ans, est déterminée par le nombre de casiers dans le processeur de signal numérique. Sur les instruments analogiques, où le nombre d&#39;années est rarement un nombre entier, nécessite une modélisation précise le nombre exact des décennies à être déterminées expérimentalement. Pour ce faire, les données à partir d&#39;un mélange de billes fluorescentes calibrées avec du fabricant attribuées par les intensités relatives sont acquises à même les paramètres du détecteur de haute tension utilisés dans l&#39;expérience. La position des pics de talon permet le calibrage de l&#39;échelle logarithmique en fonction de intgamme ensity par décennie journal. Plus précisément, cela se fait en traçant le numéro de canal pour chaque type de bourrelet contre le journal du fabricant attribué par valeur. La pente d&#39;une droite de meilleur ajustement linéaire pour les valeurs de données de perles donne le nombre d&#39;unités d&#39;intensité relative par canal. Multiplié par le nombre de canaux, cette valeur sera alors le nombre de décennies de journal pour la pleine échelle, à partir de laquelle le nombre de canaux correspondant à une diminution de deux fois en intensité (c.-à espacement génération fille) peut être calculée à 14. </li><li> Décidez si vous souhaitez utiliser un espacement fixe entre les générations ou pour permettre l&#39;espacement de flotter. Un standard (fixe) de réglage va utiliser la valeur d&#39;espacement déterminé à l&#39;étape de génération 4,5 à assigner l&#39;emplacement de chaque génération, et est généralement utilisé lorsque l&#39;histogramme manque de pics distincts. Un réglage du flotteur permet à chaque position du pic de génération qui sera déterminée par la forme et l&#39;histogramme est généralement utilisée lorsque distinguishable Les crêtes générationnelles sont évidents. </li><li> Décidez si vous souhaitez utiliser une largeur de pic fixe pour toutes les générations ou une largeur variable. Une largeur fixe utilise la SD calculée pour l&#39;échantillon témoin non stimulé de modéliser toutes les générations et est généralement choisi lorsque l&#39;échantillon n&#39;a pas distinguables des pics générations. Une largeur variable permet au programme de manière indépendante varier la SD pour chaque génération et est utilisée de préférence avec des pics distincts générations. </li><li> Exécuter un programme contenant un module d&#39;analyse de la prolifération (ici ModFit LT version 3.3). Chargez le fichier stimulé PKH26 pos de l&#39;ensemble de données à analyser (par exemple, un stimulées 96 h de culture de cellules pos PKH26 contrecolorées que pour Tube 8 dans le tableau 1). </li><li> Sélectionnez les paramètres pour l&#39;analyse, dans ce cas PKH26 (585/42) fermée sur viables (7-AAD neg) lymphocytes CD3 pos FSC vs SSC et à exclure les petits débris et grands agrégats (figure 3). En définissantces régions soient pris soin d&#39;inclure la zone de dispersion d&#39;avancement élevée, où se trouvent généralement explosions et CD3 noter que l&#39;expression peut être modulée en bas dans les cultures stimulées. </li><li> Créer un modèle de prolifération aide de l&#39;Assistant prolifération. Utilisation du fichier de données ouvert (onglet Démarrer), chargez le fichier de contrôle non stimulé PKH26 pos et définir l&#39;emplacement du canal pic dans la distribution parentale correspondant à des cellules non divisées. </li><li> Analyser le fichier pour le contrôle non stimulé PKH26 pos, en notant les valeurs pour la position de pointe des parents et de la largeur (écart-type). Si une largeur de pic fixe (SD) est souhaitée, vérifier verrouillage SD. </li><li> Chargez le PKH26 neg contrôle (par exemple, une culture de cellules de 96 h neg PKH26 contrecolorées que pour le tube 7 dans le Tableau 1). Réglez le nombre de générations par le réglage du canal de pointe pour le plus obscur génération au-dessus du contrôle PKH26 neg. Ceci détermine le numbre de générations fille le modèle peut exactement en forme et est généralement 6-9 générations. </li><li> Ouvrez le fichier de données pour l&#39;échantillon stimulé (par exemple, un stimulées 96 h de culture de cellules pos PKH26 contrecolorées que pour Tube 8 dans le tableau 1) et de confirmer que les régions de la position du pic des parents et de la carte SD tel que défini à l&#39;étape 4.7 restent inchangés. Si l&#39;espacement fixe générationnelle est souhaitée, sélectionnez l&#39;option Modèle standard, sinon sélectionnez l&#39;option flottant. </li><li> Analyser chaque fichier expérimental dans l&#39;ensemble de données, en utilisant le même modèle défini à l&#39;étape 4.9. Des ajustements mineurs à la position du pic parentale peut être nécessaire pour le meilleur ajustement très au sens à la fois visuellement et par la réduction de chi carré (RCS) de valeur. </li><li> Enregistrer les paramètres souhaités prolifération résultant de l&#39;ajustement optimal pour chaque fichier expérimental dans l&#39;ensemble de données. Pour une description complète des paramètres possibles, voir Réf. 22. </li></ol>

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Biol. 699, 119-164 (2011).</li><li>Fuse, S., Underwood, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Analysis+of+In+Vivo+CD8++T+Cell+Cytotoxicity+Against+Multiple+Epitopes+using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry.</a> Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111, 3546-3552 (2008).</li><li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+cellular+proliferation+data:+Avoid+the+panglossian.">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).</li><li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease.">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li><li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

K. Humphrey, JD Tario, Jr. et PK Wallace ont reçu hématies pré-commerciaux de suivi pour l&#39;évaluation de Life Technologies, Inc et BD Biosciences. AD Bantly et JS Moore ont reçu pré-commerciale cellule de suivi des réactifs pour l&#39;évaluation de Life Technologies, Inc et le financement du PTI Research, Inc pour le pré-commerciale caractérisation des cellules CellVue divers colorants suivi. K. Muirhead est employé par SciGro, Inc, qui fournit des services de consultation aux Technologies Phanos, Inc (propriétaire de la PKH et colorants CellVue) et fournit un appui technique pour la sauvegarde Sigma-Aldrich et moléculaires technologies de ciblage, Inc (distributeurs de ces colorants). Production et le libre accès à cet article est sponsorisé par Sigma-Aldrich.

Les méthodes décrites ici sont celles trouvées dans nos laboratoires combinés à la plus fiable pour obtenir des résultats optimaux étiquetage hPBMC utilisant des colorants membrane 13,16,18 et pour le phénotypage lymphocytaire sous-ensemble et le suivi prolifération en utilisant soit la membrane ou des colorants protéines 2,11,13,16, 18. Comme illustré sur les figures 1 et 2, l&#39;étiquetage lumineux uniforme est plus facilement obtenue en limitant la présence de sels physiologiques et en utilisant une technique de mélange qui en résulte rapide, l&#39;exposition homogène de toutes les cellules de la même concentration de colorant. Parce que la coloration avec des colorants membrane se fait par partitionnement dans la bicouche lipidique, d&#39;autres variables qui modifient la concentration du colorant libre peut également avoir une incidence efficacité du marquage. Par exemple, l&#39;étiquetage en rond tubes en polystyrène résultats inférieurs au lavage moins efficace des sels avant remise en suspension dans du diluant C et également en baisse de concentration du colorant libre en raison de teindre adsorption sur les parois du tube, en particulierà des concentrations plus faibles de colorant. Ces deux facteurs ont tendance à donner des distributions de coloration plus larges que lorsque l&#39;étiquetage soient réalisés à l&#39;aide des tubes en polypropylène coniques de fond (figures 3, 4 et résultats non publiés). L&#39;âge et le type d&#39;échantillon peut également affecter la largeur du pic, même si les procédures de coloration optimisés sont utilisés. Par exemple, les CV des lymphocytes pos PKH26 isolées à partir de sang fraîchement prélevé gamme de 14 à 20% (figure 3, Réf. 13 et résultats non publiés), tandis que les CV des lymphocytes isolés à partir d&#39;échantillons sanguins h 24 anciens ou TRIMA aphérèse filtres gamme de 25 à 30 % (figure 4 et Réf. 18). Coloration uniformité et la mesure dans laquelle les cellules non viables peuvent être exclus de l&#39;analyse à la fois affecter si les pics fille distinctes sont évidentes dans le profil de dilution d&#39;un colorant, qui à son tour affecte le choix d&#39;un modèle de prolifération d&#39;ajuster les données observées (figures 5 et 6 </strong&gt;). Bien que ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) est utilisé ici comme un exemple de logiciel utilisé pour générer des indicateurs tels que l&#39;indice de prolifération et de la fréquence des précurseurs (figures 3, 5 et 6; Tableau 3), d&#39;autres progiciels contiennent également des modules pour analyser données prolifération. Ceux-ci comprennent FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) et FlowJo (Star Tree, Inc, Ashland, OR). Tous ces programmes utilisent une formule non linéaire des moindres carrés itérativement pour trouver le meilleur ajustement aux données brutes en changeant la position, la hauteur et SD (ou largeur) de pics gaussiens représentant générations successives fille. Indice de prolifération (PI) et de la fréquence des précurseurs (PF) sont les mesures les plus couramment utilisées de mesure de la prolifération. PI, tels que définis par ModFit, est une mesure de l&#39;augmentation du nombre de cellules au cours de l&#39;essai, analogue à la «indice de stimulation &#39;un dosage de thymidine. PF renvoie la fraction de cellules dans la première populations qui ont répondu au stimulus par la prolifération. La prudence est recommandée, cependant, lors de la lecture de la littérature depuis la terminologie varie quelque peu entre les logiciels (par exemple, FlowJo et ModFit utilisent des définitions et des calculs différents de ce que l&#39;on entend par «prolifération indice») 22. Les questions essentielles abordées ici pour l&#39;étiquetage et l&#39;analyse prolifération de membranes avec des colorants sont également rencontrés lors de l&#39;utilisation de colorants protéines. Par exemple, une attention particulière à la technique de mélange doivent être respectées, ainsi que l&#39;exclusion des cellules mortes / meurt, afin d&#39;obtenir des distributions uniformes et les sommets fille distinctes lors de l&#39;utilisation CFSE (figure 6) 2-4,13,18,24. Choix approprié des fluorochromes pour le phénotypage et évaluation de la viabilité est également important d&#39;éviter un chevauchement spectral excessives et l&#39;incapacité à reconnaître les cellules d&#39;anticorps positifs, en particulier avec des colorants visibles protéines émettrices telles que CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;. La réduction de la concentration de colorant de suivi à réduire les problèmes de rémunération dans adjacents canaux spectraux, mais limite également le nombre de divisions cellulaires qui peuvent être contrôlés avant intensités de cellules filles commencent à se chevaucher avec autofluorescence. Vous pouvez également utiliser des colorants cellulaires les plus récents tels que le suivi Claret CellVue électroluminescente rouge lointain (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ou violet émettant CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) peut réduire les problèmes de compensation (figure 6). Enfin, bien que les colorants membrane généralement tendance à présenter moins de toxicité 11,26, il est possible de sur-label cellules avec soit la classe de colorant. Il est donc toujours nécessaire de vérifier que la concentration de colorant de suivi utilisé n&#39;a pas modifié la fonctionnalité des cellules à suivre (Figure 6) 3,13,16,18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif ou de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Acheté dans le commerce </td></tr><tr><td> 7-aminoactinomycine D </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) </td><td> Life Technologies </td><td> 14175-079 </td><td> Le calcium et le magnésium libre, sans rouge de phénol </td></tr><tr><td> IgG humaine fraction de Cohn II et III globulines </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps de souris anti-CD3-FITC humain </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> Concentration saturante déterminée par titrage laboratoire </td></tr><tr><td> Souris anti-humain CD4-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> Concentration saturante déterminée par titrage laboratoire </td></tr><tr><td> Souris anti-humain CD4-PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> Concentration saturante déterminée par titrage laboratoire </td></tr><tr><td> Souris anti-humain CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> Concentration saturante déterminée par titrage laboratoire </td></tr><tr><td> Souris anti-humain CD8-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD0805 </td><td> Concentration saturante déterminée par titrage laboratoire </td></tr><tr><td> Souris anti-CD19 humain-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD1905 </td><tconcentration saturante d&gt; telle que déterminée par titrage laboratoire </td></tr><tr><td> Souris anti-humain CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> Concentration saturante déterminée par titrage laboratoire </td></tr><tr><td> Souris anti-humain CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> Concentration saturante déterminée par titrage laboratoire </td></tr><tr><td> Anticorps de souris anti-CD3 humain </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azide libre </td></tr><tr><td> Souris anti-CD28 humain </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azide libre </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 rouge fluorescente kit de liaison cellulaire contenant 10-3M PKH26 dans EtOH et le Diluant C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PKH26GL-1KT ou MINI26-1KT </td><td> Procédures à l&#39;étape 1 s&#39;appliquent égalementdes kits contenant PKH67 ou des colorants CellVue autres </td></tr><tr><td> CellVue Claret rouge lointain kit fluorescente linker cellule contenant 10-3M Claret CellVue dans EtOH et le Diluant C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MINCLARET-1KT ou MIDCLARET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (et-6)-carboxyfluorescéine diacétate, ester de succinimidyle (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> C34554 </td><td> Non fluorescent, clivés par des estérases membrane pour former amino-réactif fluorescent carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD Violet Fixable </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> Stérile 12 x 75 mm conique des tubes en polypropylène et casquettes </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> Donne une meilleure efficacité coloration de la membrane colorant (colorant réduit l&#39;adsorption, la perte de cellules moins pendant l&#39;aspiration surnageant) </td></tr><tr><td> 12 x 75 mm rounfond d des tubes de polystyrène </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> Cytomètre en flux </td><td> BD Bioscience </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> Toute cytomètre en mesure de détecter FITC, PKH26, et 7-AAD (ex. 488 nm;. Em 520 nm, 567 nm et 655 nm, respectivement) et APC ex. 633-640 nm; lui. 660 nm) </td></tr><tr><td> Cytomètre en flux </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII CyAn </td><td> Toute cytomètre en mesure de détecter FITC, PKH26, et 7-AAD (ex. 488 nm;. Em 520 nm, 567 nm et 655 nm, respectivement) et APC ex. 633-640 nm; lui. 660 nm) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Laboratoire Préparé </td></tr><tr><td> 7-aminoactinomycine D, stock concentré </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 mg / ml dans du PBS. Congeler en portions aliquotes et conserver à -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7-aminoactinomycine D, worroi de stock </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 pg / ml dans du PBS; préparer quotidienne de 1 mg / ml stock congelé. </td></tr><tr><td> IgG bloc </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / ml d&#39;IgG humaines fraction de Cohn II et III globulines + 10 mg / ml de BSA. </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

Colorants fluorescents de suivi des cellules, en combinaison avec le flux et la cytométrie en image, sont des outils puissants permettant d&#39;étudier les interactions et les destins des différents types cellulaires in vitro et in vivo. 5.1 Bien qu&#39;il existe littéralement des milliers de publications utilisant ces colorants, certains d&#39;entre les applications les plus couramment rencontrés suivi cellulaires comprennent la surveillance de: <ol><li> la tige et la quiescence des cellules progénitrices, la prolifération et / ou différenciation 6-8 </li><li> transfert membrane entraînée antigène-9 et / ou la prolifération des cellules précurseurs 3,4,10-18 et </li><li> la fonction immunitaire cellulaire réglementaire et effecteur 1,18-21. </li></ol> Disponibles dans le commerce colorants suivi cellulaires varient considérablement dans leur composition chimique et les propriétés de fluorescence, mais la chute grande majorité dans l&#39;une des deux classes en fonction de leur mécanisme de marquage cellulaire. &quot;Colorants membrane&quot;, caractérisée par PKH26, sont des colorants fortement lipophiles tpartition chapeau de manière stable, mais de façon non covalente dans 1,2,11 membranes cellulaires. &quot;Colorants protéines&quot;, caractérisée par CFSE, sont amino-réactifs colorants qui forment des liaisons covalentes stables avec les protéines cellulaires 4,16,18. Chaque classe a ses avantages et ses limites. La clé de leur bonne utilisation, en particulier dans les études multicolores où plusieurs colorants sont utilisés pour suivre les différents types de cellules, est donc de comprendre les questions essentielles permettant une utilisation optimale de chaque classe 2-4,16,18,24. Les protocoles inclus ici souligner trois causes les plus fréquentes de mauvais résultats ou variable lors de l&#39;utilisation de cellules de suivi des colorants. Il s&#39;agit de: <ol><li> L&#39;incapacité d&#39;atteindre brillante et uniforme, l&#39;étiquetage reproductible. C&#39;est un point de départ obligé de toute étude de suivi cellulaire, mais nécessite une attention aux différentes variables lors de l&#39;utilisation des colorants membrane que quand on utilise des colorants réactifs de protéines ou de liaison à l&#39;équilibre telles que des anticorps. </li><li> Sous-optimaux combinaisons de fluorochrome une / ou omission d&#39;inclure commandes de compensation de critiques. Suivi fluorescence du colorant est typiquement 10 février au 10 mars de fois plus brillante que la fluorescence des anticorps. Il est donc essentiel de vérifier que la présence de colorant de suivi ne compromet pas la capacité de détecter d&#39;autres sondes utilisées. </li><li> Le défaut d&#39;obtenir un bon ajustement avec le logiciel de modélisation de pointe. Ce type de logiciel permet une comparaison quantitative des réponses prolifératives différentes populations ou des stimuli en fonction de la fréquence précurseur ou d&#39;autres paramètres. L&#39;obtention d&#39;un bon ajustement, cependant, exige l&#39;exclusion des morts / cellules mourantes qui peuvent fausser les profils par dilution et la congruence des hypothèses du modèle avec les caractéristiques du profil de dilution d&#39;un colorant observée. </li></ol> Les exemples donnés ici illustrent la façon dont ces variables peuvent affecter les résultats lors de l&#39;utilisation de membrane et / ou des colorants protéines pour contrôler la prolifération des cellules.

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Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

L&#39;utilisation réussie des colorants cellulaires de suivi pour surveiller la fonction des cellules immunitaires et la prolifération implique plusieurs étapes cruciales. Nous décrivons des méthodes pour: 1) l&#39;obtention brillante et uniforme, reproductible étiquette-ment avec des colorants membrane; 2) la sélection des fluorochromes et les conditions d&#39;acquisition de données, et 3) le choix d&#39;un modèle pour quantifier la prolifération cellulaire basée sur dilution de colorant.

Optimisé méthodes de modélisation de coloration et de prolifération pour la surveillance division cellulaire en utilisant des colorants Suivi cellulaires

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

35.3K vues.  Roswell Park Cancer Institute. L'utilisation réussie des colorants cellulaires de suivi pour surveiller la fonction des cellules immunitaires et la prolifération implique plusieurs étapes cruciales. Nous décrivons des méthodes pour: 1) l'obtention brillante et uniforme, reproductible étiquette-ment avec des colorants membrane; 2) la sélection des fluorochromes et les conditions d'acquisition de données, et 3) le choix d'un modèle pour quantifier la prolifération cellulaire bas...