الكتاب أود أن أشكر أعضاء الماضية من مختبر غوودريتش وبلير: سامانثا بستان، كولز كيمبرلي، ايرين هربرت-تران، ريتشاردز جريج، ميغان مينار، وبارك Youngjin لما قدموه من مساهمات في تطوير هذا البروتوكول. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية منحة IOS-0950873 والمعاهد الوطنية للصحة الزمالة FAI084441Z NRSA.

1. الحشرات تعقيم البيض وتربية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد النظام الغذائي من جانب أول مجموعة ال 15 للأجار التعقيم المنصوص عليها في 900-1،000 مل O. 2 H مباشرة بعد التعقيم، مع مزيج القمح 166 جم النظام الغذائي والجرثومية الخليط جيدا في الخلاط المختبر. تصب في طبق (أو الأطباق) لتبرد، ثم نقل إلى النظام الغذائي رقائق الألومنيوم، والتفاف بإحكام، وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لدى وصوله، تعقيم M. البيض سيكستا مع 250 مل من محلول التبييض 0.6٪ لمدة 2-3 دقيقة في حامل الزجاج فراغ جهاز تصفية وقارورة مع ورقة مرشح 90 مم، واحيانا اثارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الفراغ لاستنزاف حل التبييض وغسل البيض 3-4 مرات مع 250 مل العقيمة O 2 H المقطر في الغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البيض إلى ورقة جديدة مم 90 مرشح وضعت في غطاء لوحة بيتري والسماح لهم لتجف حتى أنها لم تعد عصا معا (حوالي 20-30 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البيض إلى أسفل الحاويات البلاستيكية التي تحتوي على نظام غذائي الحشرات، ووضع ما يقرب من 40 بيضة في كل حاوية(الشكل 1A). يتم فصل البيض من النظام الغذائي لمنع الرطوبة التي يسببها التلوث الفطرية. الحفاظ على البيض حتى 26 ° C مع ضوء HR 16: 8 ساعة الضوئية الظلام. سوف يخفف البيض إلى اللون الأصفر والأبيض قبل الفقس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الفقس اكتمال نقل ما يقرب من 25 يرقات بعناية كل لحاويات جديدة مع النظام الغذائي على الجزء السفلي (1B الشكل). من المهم أن تلتقط كل يرقة من القرن الأفريقي الأسود الطويل باستخدام ملقط لتجنب إلحاق الأذى بهم خلال مراحلها التنموية الهشة في وقت مبكر. احتضان لمدة 2 يوم على النحو الوارد أعلاه. بينما الموت اليرقات غير المعتاد في هذه المرحلة، يمكن ملاحظة بعض القتلى أو، على الأرجح، يرقات توقف تنمويا. ينبغي استبعاد مثل هذه الحشرات من مزيد من الدراسة وضحت من قبل التجميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجنب السلوكيات أكل لحوم البشر، نقل اليرقات إلى حاويات فردية مع قطع صغيرة من الطعام (الشكل 1C) واحتضان على النحو الوارد أعلاه. رصد نمو الحشرات، البراز استبدال الطعام وتنظيف أووطن من الحاويات كل يوم حتى الخضوع لتساقط اليرقات الثالثة (عادة 6-9 يوم بعد الفقس). هذا هو ال 4 المرحلة الرابعة الطور اليرقي، وتتميز بظهور الكروشيهات الذي يشبه الخطاف الأسود على كل بروز proleg وزيادة المشارب على طول الجسم الحشرات (1D الشكل). قد تختلف اختلافا كبيرا في يرقات الحجم، ولكن عادة تزن 0،15-0،4 ز عند دخول مرحلة الطور ال 4. وينبغي اختيار اليرقات مشابهة من حيث الحجم للحقن. </li></ol> 2. إعداد البكتيريا للحقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو سلالة بكتيرية (ق) لفحصها وفقا للإجراءات القياسية لمرحلة النمو التي ترغب في اختبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفحصها بيليه 500 ميكرولتر من كل سلالة بكتيرية من خلال الدوران لمدة 2 دقيقة في ميكروسنتريفوج في 13000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا مخزنة resuspend في 1 مل الفوسفات المالحة عقيمة 1X (PBS) وبيليه مرة أخرى على النحو الوارد أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X 0.5 مل العقيمة والشرق الأوسط وأفريقياتأكد من أن الكثافة الضوئية (OD) من التعليق. تمييع كل تعليق إلى OD نفسه، إذا لزم الأمر. ويمكن أيضا وسائل الإعلام نمو معقمة يمكن استخدامها لإعادة تعليق خلية والتخفيف بدلا من 1X PBS، إذا رغبت في ذلك. </li></ol> 3. حقن من 4 ال يرقات الطور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المسلسل أضعاف التخفيفات 10-سلالة بكتيرية الأولى في 6 آبار من لوحة عيار مكروي 96-1X PBS جيدا في معقمة، وذلك باستخدام معلومات سرية ماصة جديدة لكل التخفيف (الشكل 2A). ينبغي أن الحجم النهائي للتعليق خلية في كل بئر يتجاوز حجم المطلوب للحقن (10 ميكرولتر لكل الحشرات) بالإضافة إلى 20 ميكرولتر لوحة واللقاح (انظر الخطوات 3.2 و 3.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ميكرولتر كل بقعة لمدة 5 التخفيفات (10 -2 من خلال 10 -6) على طول الجزء العلوي من لوحة تحتوي على بيتري المتوسطة النمو المناسبة. إمالة لوحة بحيث تنتشر البقع إلى مركز (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة النظام الغذائي الحشرات والبراز والحشرات مكان في حاويات على الجليد للحوالي 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الإبرة حقنة وذلك بدهن كل 3 مرات في 2 أنابيب من الإيثانول 70-100٪، تليها أنبوب واحد من العقيمة O 2 H (الشكل 2C). يجب أن يكون حجم السائل كافية لغمر الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Quantitate على تعليق خلية المخففة تحت المجهر باستخدام عدادة الكريات. اعتمادا على اللقاح المطلوب، ووضع 10 ميكرولتر من عيار مكروي المناسبة أيضا (الشكل 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسحة السطح الحشرات مع الايثانول 95٪، وحقن الخلية 10 مل التعليق في الحشرات في زاوية (أقل من 45 درجة) وراء واحدة من prolegs البطن. والحرص على عدم ثقب الأمعاء وحقن محتويات فقط تحت طبقة البشرة (2E الشكل). في حين أن بعض الخسائر في الدملمف (واضحة، الأخضر والأزرق السائل) أمر طبيعي، والجسيمات الناشئة سائل أصفر من موقع الحقن تدل على ثقب الأمعاء. إذا حدث هذا، التضحية الحشرات والحصول على يرقة جديدة لإعادةوضعه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 3.6 للكل الحشرات الباقية في المجموعة الحقن الأولى. إبرة التعقيم ليس من الضروري بين كل الحشرات حقن نفسه مع التخفيف وسلالة من البكتيريا ما لم يحدث التلوث. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام موزع لتكرار قدر أكبر من الاتساق في حجم الحقن بين العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حقن كل الحشرات مع سلالة الأولى من البكتيريا، كرر الخطوة 3.2، هذه المرة اكتشاف تعليق خلية في منتصف لوحة والسماح لهم تدفق نحو الأسفل (الشكل 2F). احتضان لوحات في درجة حرارة مناسبة والاعتماد المستعمرات تعداد اللقاح. يتم استخدام هذه الخطوة الثانية لطلاء تحقق من لم تلوث عينات أثناء عملية الحقن، حيث أن هذا من شأنه أن يؤدي بأعداد متباينة بين مستعمرة التصفيح الأولى والثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3.1 خلال 3.8 لكل سلالة من البكتيريا في التجربة. وأخيرا، وضخ 3-5 الحشرات العقيمة مع 1X PBS باستخدام ster يسودإيل إبرة كمجموعة مراقبة سلبية. احتضان الحشرات في C ° 26 مع ضوء HR 16: 8 ساعة الضوئية الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد الحشرات البقاء على قيد الحياة على مر الزمن بعد الحقن. ويتميز فاة الحشرات وعدم وجود حركة الطوعية على التحفيز. غالبا ما تظهر الحشرات فقدان الشهية، والإسهال (المائي، والبراز أصفر)، و / أو فقدان المياه (&quot;التعرق&quot;) خلال العدوى قبل وفاته، وهذه الخصائص قد تكون الجدير بالذكر أيضا. </li></ol>

<ol>
	<li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes.">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li><li>Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+for+homogeneous+parasporal+crystal+of+Bacillus+thuringiensis+using+the+tobacco+hornworm,+Manduca+sexta.">Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).</li><li>P&#233;chy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+a+novel+gene+cluster+encoding+an+insect+toxin+in+plant-associated+strains+of+Pseudomonas+fluorescens.">Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens.</a> Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).</li><li>Nu&#241;ez-Valdez, M. E., Calder&#243;n, M. A., Aranda, E., Hern&#225;ndez, L., Ram&#237;rez-Gama, R. M., Lina, L., Rodr&#237;guez-Segura, Z., Guti&#233;rrez Mdel, C., Villalobos, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+Mexican+strain+of+Serratia+entomophila+pathogenic+against+root-damaging+larvae+of+Scarabaeidae+(Coleoptera).">Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera).</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).</li><li>Forst, S. A., Tabatabai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+histidine+kinase,+EnvZ,+in+the+production+of+outer+membrane+proteins+in+the+symbiotic-pathogenic+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus.">Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).</li><li>Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+responses+of+a+lepidopteran+insect,+Manduca+sexta.">Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta.</a> Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).</li><li>Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+proteins+in+Manduca+sexta+plasma.">Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).</li><li>Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+immune+response+to+the+entomopathogen+Photorhabdus.">Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus.</a> Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).</li><li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friend+and+foe:+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila.">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li><li>D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+host+for+Pseudomonas+aeruginosa+Infection.">Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection.</a> J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).</li><li>Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+toxicity+of+Photorhabdus+luminescens+W14+toxin+complexes+in+Escherichia+coli.">Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).</li><li>Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+variation+in+Xenorhabdus+nematophila+virulence+and+suppression+of+Manduca+sexta+immunity.">Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity.</a> Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).</li><li>Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus+depresses+nodulation+reactions+to+infection+by+inhibiting+eicosanoid+biosynthesis+in+tobacco+hornworms,+Manduca+sexta.">The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).</li><li>Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+regulator+Lrp+contributes+to+mutualism,+pathogenesis+and+phenotypic+variation+in+the+bacterium+Xenorhabdus+nematophila.">The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila.</a> Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).</li><li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects.">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li><li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus:+two+roads+to+the+same+destination.">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).</li><li>Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+modulation+of+immunity:+changes+within+the+feeding+period+of+the+fifth+larval+stage+in+the+defence+reactions+of+Manduca+sexta+to+infection+by+Photorhabdus.">Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus.</a> J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).</li><li>Kavanagh, K., Reeves, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+potential+of+insects+for+in+vivo+pathogenicity+testing+of+microbial+pathogens.">Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

والحقن المباشر للM. سيكستا اليرقات مع البكتيريا الممرضة للحشرات، كما هو موضح هنا، بمثابة وسيلة بسيطة وفعالة لتحليل الفوعة الجرثومية. الأسلوب هو أيضا قابلة للتكيف للغاية لتناسب مختلف المواضيع التجريبية و / أو شروط. يمكن تحضير البكتيريا بطرق مختلفة قبل الحقن. في ح...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> 90 مم رقة الترشيح </td><td> WHATMAN </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> مرشح الزجاج حامل </td><td> ميليبور </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> ماندوكا سيكستا البيض </td><td> كارولينا البيولوجي التموين </td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td> الغجر العثة حمية + أجار </td><td> النائب Biomedicals </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5.5 أوقية. البلاستيك الحاويات وأغطية </td><td> كأس منفردا الشركة </td><td> URC55-0090-0090 PL4 </td><td></td></tr><tr><td> 1 أوقية. البلاستيك الحاويات وأغطية </td><td> DART حاوية شركة </td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 8 مم نا 2 HPO 4، 1،46 ملم KH 2 PO 4، درجة الحموضة 7.4 </td></tr><tr><td> محقنة </td><td> هاميلتون </td><td> 80208 </td><td> 30 عداد، 0،375 &quot;على غرار طول نقطة، 2 </td></tr></tbody></table>

rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence

ويعتبر ماندوكا سيكستا، المعروف باسم hornworm التبغ، آفة كبيرة الزراعية، وتغذية النباتات على باذنجاني بما في ذلك التبغ والطماطم. قابلية M. سيكستا اليرقات إلى مجموعة متنوعة من الأنواع البكتيرية الممرضة للحشرات 1-5، فضلا عن ثروة من المعلومات المتاحة عن نظام الحشرة المناعة 6-8، وتسلسل الجينوم انتظار 9 جعله كائن نموذج جيد للاستخدام في دراسة المضيف ميكروب التفاعلات خلال المرضية. وبالإضافة إلى ذلك، M. سيكستا يرقات كبيرة نسبيا وسهلة للتلاعب والحفاظ على النسبية في المختبر لأنواع أخرى عرضة للحشرات. حجمها كبير كما يسهل كفاءة الأنسجة / الدملمف استخراج لتحليل استجابة العائل للإصابة. الأسلوب المعروضة هنا يصف الحقن المباشر للبكتيريا في hemocoel (تجويف الدم) من M. سيكستا اليرقات. هذا النهجيمكن استخدامها لتحليل ومقارنة خصائص الفوعة الأنواع البكتيرية المختلفة، سلالات، أو ببساطة من خلال مراقبة طفرات الوقت حتى الموت الحشرات بعد الحقن. وقد تم تطوير هذه الطريقة لدراسة تسببها Xenorhabdus والأنواع Photorhabdus، والتي عادة ما تربط مع ناقلات الديدان الخيطية كوسيلة للدخول في الحشرات. النيماتودا الممرضة للحشرات تصيب اليرقات عادة عن طريق الجهاز الهضمي أو فتحات الجهاز التنفسي الطبيعية، والافراج عن محتوياتها البكتيرية التكافلية في الدملمف الحشرات (الدم) بعد فترة وجيزة 10. طريقة الحقن الموصوفة هنا يتجاوز الحاجة إلى ناقلات الديدان الخيطية، وبالتالي uncoupling آثار البكتيريا والديدان الخيطية على الحشرات. هذا الأسلوب يسمح للتعداد دقيق للمواد المعدية (الخلايا أو البروتين) في اللقاح، وهو أمر غير ممكن باستخدام طرق أخرى موجودة لتحليل entomopathogenesis، بما في ذلك الخدش 11 و فحوصات السمية عن طريق الفم 12 <eم&gt;. أيضا، فحوصات السمية عن طريق الفم معالجة الفوعة من السموم يفرز التي أدخلت على الجهاز الهضمي من اليرقات، في حين أن طريقة الحقن المباشر يتناول ضراوة خلية كاملة قائح. الأداة المساعدة لطريقة الحقن المباشر كما هو موضح هنا هو تحليل المرضية البكتيرية من خلال رصد وفيات الحشرات. ومع ذلك، يمكن بسهولة هذه الطريقة يتم توسيع لاستخدامها في دراسة آثار العدوى على M. سيكستا الجهاز المناعي. الحشرة يستجيب للإصابة عن طريق كل من الاستجابات الخلطية والخلوية. الاستجابة الخلطية يتضمن الاعتراف البكتيرية المرتبطة أنماط الإنتاج واللاحقة من الببتيدات المضادة للميكروبات المختلفة 7؛ يمكن رصدها في التعبير عن الجينات ترميز هذه الببتيدات لاحقة للإصابة المباشرة عبر استخراج الحمض النووي الريبي والكمية PCR 13. الاستجابة الخلوية للإصابة ينطوي تكوين العقد الجذرية، التغليف، والبلعمة من العوامل المعدية عن طريق hemocytes 6 </sup&gt;. لتحليل هذه الاستجابات، يمكن تشريح الحشرات وحقن المجهري تصور من قبل 13 و 14.

ويصور A سبيل المثال ممثل لفحص الحشرات وفيات في الشكل 3. في هذه التجربة، تم حقن الحشرات مع وحدات مستعمرة تشكيل ما يقرب من 50 (CFU) من أي نوع البرية (ATCC19061) أو سلالة متحولة الموهن (الدوريات طويلة المدى 13) من nematophila Xenorhabdus نمت لمنتصف المرحلة سجل (ن = 6 الحش...

Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence at JoVE.com

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

وصف الأسلوب هنا يستخدم الحقن المباشر للبكتيريا الممرضة للحشرات في hemocoel من<em&gt; ماندوكا سيكستا</em&gt; يرقات الحشرات.<em&gt; M. سيكستا</em&gt; هو حشرة المتاحة تجاريا ومدروسة. وبالتالي، هذا الأسلوب يمثل نهجا بسيطة لتحليل التفاعلات المضيفة للبكتيريا من منظور واحد أو الشركاء على حد سواء.

تربية وحقن<em&gt; ماندوكا سيكستا</em&gt; اليرقات لتقييم الفوعة البكتيرية

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

rearing-injection-manduca-sexta-larvae-to-assess-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

12.6K Views.  University of Wisconsin-Madison. وصف الأسلوب هنا يستخدم الحقن المباشر للبكتيريا الممرضة للحشرات في hemocoel من ماندوكا سيكستا يرقات الحشرات. M. سيكستا هو حشرة المتاحة تجاريا ومدروسة. وبالتالي، هذا الأسلوب يمثل نهجا بسيطة لتحليل التفاعلات المضيفة للبكتيريا من منظور واحد أو الشركاء ...

Video: Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

اللعاب، الغدد اللعابية، وجمع اللمف الدموي من القراد اللبود الكتفي

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

رصد الجمعية ليفرز البكتيرية الفوعة عن طريق عامل يشابك بمواقع محددة

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

تطبيق نظام التعبير محرض لدراسة التدخل من العوامل البكتيرية الفوعة مع اشارة بين الخلايا

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can be utilized as an alternative animal model for the study of virulence, host-pathogen interaction, innate immune response, and drug efficacy. Details for the rearing, care and breeding of the hissing cockroach are provided. We also illustrate how it can be infected with bacteria such as the intracellular pathogens Burkholderia mallei, B. pseudomallei, and B. thailandensis. Use of the hissing cockroach is inexpensive and overcomes regulatory issues dealing with the use of mammals in research. In addition, results found using the hissing cockroach model are reproducible and similar to those obtained using mammalian models. Thus, the Madagascar hissing cockroach represents an attractive surrogate host that should be explored when conducting animal studies.

We present a protocol to utilize the Madagascar hissing cockroach as an alternative non-mammalian animal model to conduct bacterial virulence, pathogenesis, drug toxicity, drug efficacy, and innate immune response studies.

أن مدغشقر الهسهسة الصرصور كنموذج بديل غير الثدييات حيوانية للتحقيق في الفوعة، والمرضية، وفعالية المخدرات

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

تحديد "علامات الفوعة" بكتريا أبسسيسوس "النسخ المتماثل داخل الخلايا" في البالعات

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human diseases have been reported to be associated with four species of bacteria: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, and Aeromonas caviae. The model organism Caenorhabditis elegans is a bacterivore that provides an excellent infection model by which to study the bacterial pathogenesis of Aeromonas. Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection using a C. elegans model, including survival, liquid toxicity, and muscle necrosis assays. The results of the three methods determining the virulence of Aeromonas were consistent. A. dhakensis was shown to be the most toxic among the 4 major Aeromonas species causing clinical infections. These methods are shown to be a convenient way to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species and contribute to our understanding of the pathogenesis of Aeromonas infection.

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection in C. elegans. Using these convenient methods, it is easy to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species.

تقييم الفوعة والمرضية للعدوى أيروموناس في نموذج ايليجانس كاينورهابديتيس

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

نموذج الماوس لتقييم الفطرية الاستجابة المناعية للعدوى المكوّرات العنقودية الذهبية

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

الفائق دوسنتاريا-مقايسة جراثيم معينة

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

أوبسونوفاجوسيتيك قتل المقايسة لتقييم الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض البكتيرية

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...