يصف هذا البروتوكول استخدام جاليريا ميلونيلا كنموذج بديل للعدوى لدراسة السل، مما يقلل من عدد نماذج الثدييات المستخدمة في الأبحاث. بالمقارنة مع نماذج الثدييات التقليدية مثل الفئران، غاليريا ميلونيلا هو أرخص، ومقبول أخلاقيا، وأكثر سهولة في الوصول إلى دراسة مرض السل. وسيتيح المزيد من التحسين لهذا النموذج فحص فعالية سمية الأدوية المضادة للبكتيريا المرشحة وسُمّيتها، وسيسهم في تطوير علاجات جديدة مطلوبة على وجه السرعة لمرض السل.
جاليريا ميلونيلا تمتلك جهاز المناعة الفطرية المعقدة مماثلة لتلك التي من الثدييات. وقد تكشف دراسة التفاعل بين المُمْرض المضيفين دور المناعة الفطرية في السل. لا يقتصر استخدام جاليريا ميلونيلا كنموذج للعدوى على السل وقد استخدم على نطاق واسع لمسببات الأمراض البكتيرية والفطرية الأخرى على مدى العقد الماضي.
للبدء، قم بتذويب مخزون الجلسرول المجمد 1.2 ملليلتر من Mycobacterium bovis BCG لوكس، سلالة لقاح مونتريال تحولت مع بلازميد المكوك pSMT1 تحمل الجينات luxAB. في قارورة Erlenmeyer المسماة 250 ملليلتر ، تلقيح 15 ملليلتر من مرق Middlebrook 7H9 مع 1.2 ملليلتر مزيل من BCG lux. ضع القارورة في حاوية السلامة البيولوجية المغلقة واحتضانها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة للحاكر المداري عند 220 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة.
بعد الحضانة، وإعداد 1:10 تخفيفات من الثقافة في المالحة الفوسفات المخزنة في أنابيب مضيئة، دوامة، وتحميل أنابيب مضيئة في المضيء. تحميل الركيزة 1٪ ن ديكيل ألدهيد في الإيثانول المطلق في منصة حاقن وقياس الإضاءة الحيوية. تحويل الإضاءة الحيوية إلى وحدات تشكيل مستعمرة للتحقق من نمو ثقافة BCG لوكس.
نقل الثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي في 2، 175 مرات ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ل بيليه الخلايا. تخلص من المطهر في مطهر مناسب مع نشاط مبيد البكتيريا المعروف. غسل بيليه الخلية مرتين في 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني-T عن طريق الطرد المركزي في 2, 175 مرات ز لمدة 10 دقائق لمنع تكتل البكتيرية.
بعد الغسيل النهائي، decant النفايات supernatant و resuspend بيليه الخلية الفطرية في حجم المطلوب من برنامج تلفزيوني-T لتخفيف تعليق mycobacterial إلى كثافة الخلايا المطلوبة. ثم، وإعداد 10 أضعاف التخفيفات التسلسلية من inoculum في لوحات 24-جيدا باستخدام برنامج تلفزيوني-T. لوحة من أصل 10 microliters من كل تخفيف على Middlebrook 7H11 لوحات أجار في مكررة لتعداد التهم CFU inoculum.
الحفاظ على اليرقات التي تم شراؤها في الظلام عند 18 درجة مئوية عند الوصول والاستخدام في غضون أسبوع واحد من الشراء. تحديد واختيار اليرقات الصحية للتجريب على أساس لون كريم موحد ، الحجم والوزن المناسبين ، والحركة العالية ، وامتلاك القدرة على الحق في أنفسهم عندما انقلبت. باستخدام ملاقط حادة النهاية ، عد بعناية اليرقات السليمة في طبق بيتري مبطن بطبقة من ورق التصفية ويخزن في درجة حرارة الغرفة في الظلام حتى الاستخدام.
إعداد منصة الحقن عن طريق تسجيل ورقة تصفية دائرية قطرها 94 ملليمتر على سطح مسطح، أثار. pirate ثلاثة مجلدات من 70٪ الإيثانول في 25 ميكرولتر microsyringe لتعقيم، والتخلص وشطف مزيد من مع ثلاثة مجلدات من برنامج تلفزيوني عقيمة-T. ثم، resuspend أعدت BCG lux inoculum وpirate 10 ميكرولترات في microsyringe تعقيم.
استخدام حقنة منفصلة لpirate PBS-T للسيطرة السلبية. بعد 10 حقن, resuspend BCG لوكس inoculum لضمان تعليق الخلية موحدة. استخدام ملاقط لالتقاط يرقة واحدة ووضعها على منصة الحقن.
على المنصة ، اقلب اليرقة على ظهرها وشل حركتها عن طريق تأمين الرأس والذيل مع الملاقط. حدد مكان آخر البرلليج الأيسر ، عد من رأس اليرقة وأدخل بعناية طرف الإبرة بعمق خمسة إلى ستة ملليمترات في زاوية 10 إلى 20 درجة إلى الطائرة الأفقية. حقن inoculum من الحقنة.
بعد كل عدوى ، نقل اليرقة المصابة إلى طبق بيتري مبطن بطبقة من ورق التصفية. يمكن لطبق بيتري واحد من 94 ملليمترًا أن يستوعب ما يصل إلى 30 يرقة. تخزين طبق بيتري في تنفيس، مربع الظلام داخل حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
مراقبة بقاء اليرقات كل 24 ساعة. تعتبر اليرقات ميتة عندما تفشل في التحرك استجابة للمس. سجل البقاء على قيد الحياة وتقييم الأهمية الإحصائية مع اختبار Mantel-Cox.
كل 24 ساعة ، اختر عشوائيًا خمس يرقات مصابة واستخدم مسحة برعم قطن غارقة في 70 ٪ من الإيثانول لتعقيم أسطح اليرقات بلطف. ضع اليرقات بشكل فردي في أنابيب مصفوفة مليلتر تحتوي على 800 ميكرولترات من PBS العقيمة. ثم استخدم التجانس لتجانس اليرقات لمدة 60 ثانية في ستة أمتار في الثانية.
الطرد المركزي أنابيب اللينينغ في 3، 500 مرات ز لمدة خمس ثوان لإزالة التجانس من الأغطية وdedeant بعناية التجانس في خمسة أنابيب مضيئة العقيمة بشكل فردي. حجز 100 ميكرولترات من التجانس في أنبوب تفاعل معقمة 1.5 ملليلتر. استعادة أي تجانس المتبقية عن طريق غسل أنابيب مصفوفة lysing مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني T والماصات في أنابيب مضيئة المقابلة.
دوامة أنابيب مضيئة وقياس الإضاءة الحيوية من تجانس على مضيئة. ثم، وإعداد 10 أضعاف التخفيفات التسلسلية من 100 ميكرولترات محفوظة من تجانس في لوحات ثقافة 24-well باستخدام PBS-T. Pipette 10 ميكرولترات من التخفيف على كل لوحة Middlebrook 7H11 أجار واستخدام موزع لوحة معقمة لنشر.
احتضان في 37 درجة مئوية لمدة أسبوعين. بعد ذلك، عد وحدات تشكيل مستعمرة. تحديد نسبة RLU إلى CFU من BCG لوكس التالية في العدوى الجسمية.
في هذه التجربة ، لوحظت ضراوة تعتمد على الجرعة BCG في يرقات G.mellonella على مدى فترة حضانة مدتها 96 ساعة. تم تحديد الجرعة القاتلة اللازمة لوفيات اليرقات بنسبة 50٪، لتكون مرة واحدة 10 مرات إلى قوة سبعة CFU. لم تؤثر مجموعات التحكم التي تم حقنها بجرعة 10 ميكرولتر من PBS-T أو تلك التي تم وخزها ببساطة على إصابات إبرة الإبرة على صحة اليرقات أو تؤدي إلى زيادة في الوفيات.
بالنسبة لليرقات المصابة بـ 10 مرات إلى قوة سبع جرعة من CFU من BCG lux ، لوحظ اتمّر الخط الظهري من 48 ساعة بعد العدوى وتم ملاحظة الميلانة الجهازية من 96 ساعة بعد العدوى. العدوى مع مرة واحدة 10 إلى قوة جرعة CFU سبع من BCG لوكس أدى إلى انخفاض أولي للضبابية الحيوية في غضون أول 72 ساعة بعد العدوى. ومع ذلك ، بعد 72 ساعة بعد العدوى ، بدأت الإضاءة الحيوية لـ BCG lux في الهضبة ، مما يشير إلى إنشاء عدوى مستمرة.
في هذا النظام العدوى خاصة، وتراوحت نسبة في الجسم الحي من RLU و CFU 2:1 إلى 5:1 بمتوسط 4:1 على مدى 168 ساعة دورة زمنية. أثناء الحقن ، تذكر تأمين اليرقات بحيث يتم تقليل خطر الإفراط في البكرة. ثقب عرضي في الأمعاء يمكن أن يؤدي إلى زيادة معدل الوفيات.
من خلال إجراء تحليل الهستوباتي ، يمكن تصور إدخال الميكوبتريا مع الخلايا المضيفة. ويمكن أن يكشف المزيد من التحليلات المستنسخة التفاعل على المستوى الجينومي. وقد يسمح استخدام نموذج العدوى هذا بإجراء اختبار سريع لمرشحين رواية للمخدرات في مرحلة مبكرة من التطور، مما يقلل كثيرا من عدد الحيوانات المستخدمة في فحص المخدرات.
يتطلب نموذج العدوى هذا استخدام الحقنة ، والتي يمكن أن ترتبط مع إصابة إبرة عصا. نوصي باستخدام تقنية الحقن لتقليل هذه المخاطر.
