המחברים מבקשים להודות לחברי העבר של גודריץ-בלייר המעבדה: סמנתה אורצ&#39;רד, קימברלי קאולס, ארין הרברט-טראן, גרג ריצ&#39;רדס, מייגן נרד, וYoungjin פרק על תרומתם לפיתוח של פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי מענק קרן המדע הלאומי IOS-0950873 והמכונים הלאומיים לבריאות NRSA המלגה FAI084441Z.

1. עיקור ביצת חרקים וגידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הדיאטה של 15 גרם מעוקר הראשון של אגר ספק ב900-1,000 המ&quot;ל H 2 O. מייד לאחר מעוקר, לערבב עם דיאטה 166 גר &#39;ניבט חיטה ותערובת היטב במעבדת בלנדר. יוצק לצלחת (או צלחות) להתקרר, ואז להעביר לדיאטת רדיד אלומיניום, עוטף היטב, ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הגעתו, לעקר מ &#39; ביצי סקסטה עם 250 מ&quot;ל של 0.6% בתמיסת כלור ל2-3 דקות בבעל זכוכית מסנן ומכשירים ירמסו עם נייר סינון 90 מ&quot;מ, תוך ערבוב מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ואקום לניקוז תמיסת כלור וביצי 3-4 פעמים לשטוף עם 250 המ&quot;ל סטרילי המזוקק H 2 O לשטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביצים לנייר חדש 90 מ&quot;מ מסנן להציב מכסה צלחת הפטר ולאפשר להם להתייבש עד שהם כבר לא ביחד מקל (כ 20-30 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביצים לתחתית מכלי פלסטיק עם דיאטת חרקים, צבת כ 40 ביצים בכל מכולה(איור 1 א). ביצים מופרדות מדיאטה על מנת למנוע זיהום פטרייתי לחות מושרה. לשמור על ביצים על 26 ° C עם אור 16 שעות: 8 השעות photoperiod הכהה. ביצים תהיינה להאיר לצבע צהוב לבן לפני הבקיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הבקיעה היא מוחלטת, להעביר בזהירות כ 25 זחלים לכל מכולות חדשות עם דיאטה בתחתית (1B איור). חשוב לאסוף את כל זחל על ידי הקרן השחורה הארוכה באמצעות מלקחיים, כדי למנוע פגיעה בם במהלך שלבי ההתפתחות המוקדמים השבירים שלהם. דגירה עבור 2 ימים כאמורים לעיל. בעוד מות זחל הוא יוצא דופן בשלב זה, חלק הזחלים מתים או, סבירים יותר, ננסי התפתחותית אפשר לראות. חרקים כאלה צריכים להיות מחוץ למחקר נוסף והקריבו על ידי הקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להימנע מהתנהגויות קניבליות, זחלי העברה למכלים נפרדים עם חתיכות קטנות של אוכל (התרשים 1C) ודגירה כאמורה לעיל. לעקוב אחר התפתחות חרקים, צואת החלפת מזון וניקוי ouלא של מכולות בכל יום אחר עד שהם עוברים את נשירת הזחל השלישית (בדרך כלל 6-9 ימים לאחר בקיעה). זה שלב ה 4 instar הזחל, המתאפיין במראה של crochets קרס השחור על כל גדולת proleg ומוגברת של פסים לאורך גוף החרק (1D איור). הזחלים עשויים להשתנות במידה ניכרת בגודלה, אך בדרך כלל שוקלים 0.15-0.4 גרם עם כניסתו לבמת instar -4. זחלים בגודל דומה צריכים להיבחר להזרקה. </li></ol> 2. הכנה של חיידקים להזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול זן החיידקים (הים) להיבדק על פי נהלים הרגילים לשלב הצמיחה ברצונך לבדוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 μl הגלולה של כל זן חיידקים שנבדק על ידי ספינינג עבור 2 דקות בmicrocentrifuge ב13000 סל&quot;ד בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend בפוספט 1x סטרילי 1 המ&quot;ל נאגרו מלוחים (PBS) וגלולה שוב כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend ב 0.5 המ&quot;ל סטרילי 1x PBS וmeaבטוח הצפיפות האופטית (OD) של ההשעיה. לדלל את כל ההשעיות לאותו OD, במידת צורך. תקשורת צמיחה סטריליים עשויה לשמש גם לresuspension תא ודילול במקום 1x PBS, אם תרצה בכך. </li></ol> 3. הזרקה של 4 זחלי Instar ה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילולים סידוריים 10-קיפול של זן החיידקים הראשון ב6 בארות של צלחת 96-microtiter גם ב1x PBS סטרילי, באמצעות קצה פיפטה טריה עבור כל דילול (איור 2 א). הנפח הסופי של השעית תא בכל אחד גם צריך לחרוג הנפח נדרש להזרקה (10 μl לחרקים) בתוספת 20 μl לצלחת הבידוד (ראה שלבים 3.2 ו -3.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 μl ספוט כל במשך 5 דילולים -2 (10 עד 10 -6) בחלק העליון של צלחת פטרי המכיל מדיום גידול מתאים. הטה את הצלחת כך שהכתמים התפשטו למרכז (איור 2 ב &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דיאטת חרקים וצואה וחרקי מקום במכולות על קרחכ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את מחט המזרק על ידי שטיפת 3 פעמים כל אחד ב 2 צינורות של אתנול 70-100%, ואחריו צינור אחד H 2 O סטרילי (האיור 2C). הנפח נוזלי חייב להיות מספיק כדי להטביע את המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את המתלים הסלולריים לדלל תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytometer. בהתאם לבידוד הרצוי, לצייר 10 μl מmicrotiter המתאים היטב (האיור 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוגית משטח החרקים עם אתנול 95%, ולהזריק את השעית תא 10 מ&quot;ל לחרקים בזווית (פחות מ 45 מעלות) מאחורי אחד מprolegs הבטן. יש להיזהר שלא לנקב את המעי ולהזריק את התוכן בדיוק מתחת לשכבת האפידרמיס (2E איור). בעוד שחלק אובדן hemolymph (נוזל שקוף, ירוק כחול) הוא נורמלי, חומר חלקיקים ונוזל צהוב יוצא מאתר ההזרקה מעיד על לנקב מעי. במקרה זה, להקריב את החרק ולהשיג זחל חדש מחדשלמקם אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.6 לכל חרק שנותר בקבוצת הזריקה הראשונה. מחט העיקור אינו הכרחי בין כל חרקים הזריקו עם אותו הדילול והזן של חיידק אלא אם זיהום מתרחש. לחלופין, מנפק חוזר עשוי לשמש לעקביות רבה יותר בנפח הזרקה בין דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה כל חרקים במתח הראשון של חיידקים, חזור על שלב 3.2, הפעם ייכון השעיות סלולריות באמצע הצלחת ולתת להם לזרום לכיוון החלק התחתון (האיור 2F). דגירת צלחות בטמפרטורה המתאימה ולסמוך מושבות למנות בידוד. צעד 2 ציפוי זה משמש כדי לוודא שהדגימות אינן מזוהמות במהלך תהליך ההזרקה, שכן דבר יגרום למספרי מושבה שונים בין platings הראשון והשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1 עד 3.8 לכל זן של חיידק בניסוי. לבסוף, להזריק 3-5 חרקים עם 1x PBS סטרילי באמצעות sterמחט איל כקבוצת ביקורת שלילית. דגירת חרקים ב 26 ° C עם אור 16 שעות: 8 השעות photoperiod הכהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פקח על הישרדות חרקים לאורך זמן לאחר הזרקה. מות חרק מאופיין כחוסר תנועה רצונית על גירוי. חרקים מציגים לעתים אובדן תיאבון, שלשולים (צואה מימית, צהובה), ו / או אובדן מים (&quot;זעה&quot;) במהלך זיהום לפני המוות; מאפיינים אלו עשויים להיות ראויים לציון גם כן. </li></ol>

<ol>
	<li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes.">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li><li>Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+for+homogeneous+parasporal+crystal+of+Bacillus+thuringiensis+using+the+tobacco+hornworm,+Manduca+sexta.">Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).</li><li>P&#233;chy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+a+novel+gene+cluster+encoding+an+insect+toxin+in+plant-associated+strains+of+Pseudomonas+fluorescens.">Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens.</a> Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).</li><li>Nu&#241;ez-Valdez, M. E., Calder&#243;n, M. A., Aranda, E., Hern&#225;ndez, L., Ram&#237;rez-Gama, R. M., Lina, L., Rodr&#237;guez-Segura, Z., Guti&#233;rrez Mdel, C., Villalobos, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+Mexican+strain+of+Serratia+entomophila+pathogenic+against+root-damaging+larvae+of+Scarabaeidae+(Coleoptera).">Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera).</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).</li><li>Forst, S. A., Tabatabai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+histidine+kinase,+EnvZ,+in+the+production+of+outer+membrane+proteins+in+the+symbiotic-pathogenic+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus.">Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).</li><li>Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+responses+of+a+lepidopteran+insect,+Manduca+sexta.">Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta.</a> Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).</li><li>Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+proteins+in+Manduca+sexta+plasma.">Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).</li><li>Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+immune+response+to+the+entomopathogen+Photorhabdus.">Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus.</a> Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).</li><li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friend+and+foe:+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila.">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li><li>D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+host+for+Pseudomonas+aeruginosa+Infection.">Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection.</a> J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).</li><li>Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+toxicity+of+Photorhabdus+luminescens+W14+toxin+complexes+in+Escherichia+coli.">Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).</li><li>Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+variation+in+Xenorhabdus+nematophila+virulence+and+suppression+of+Manduca+sexta+immunity.">Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity.</a> Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).</li><li>Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus+depresses+nodulation+reactions+to+infection+by+inhibiting+eicosanoid+biosynthesis+in+tobacco+hornworms,+Manduca+sexta.">The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).</li><li>Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+regulator+Lrp+contributes+to+mutualism,+pathogenesis+and+phenotypic+variation+in+the+bacterium+Xenorhabdus+nematophila.">The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila.</a> Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).</li><li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects.">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li><li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus:+two+roads+to+the+same+destination.">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).</li><li>Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+modulation+of+immunity:+changes+within+the+feeding+period+of+the+fifth+larval+stage+in+the+defence+reactions+of+Manduca+sexta+to+infection+by+Photorhabdus.">Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus.</a> J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).</li><li>Kavanagh, K., Reeves, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+potential+of+insects+for+in+vivo+pathogenicity+testing+of+microbial+pathogens.">Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ההזרקה הישירה של מ &#39; זחלי סקסטה עם חיידקי entomopathogenic, כפי שמתוארים כאן, משמשים כאמצעי פשוט ויעיל לניתוח ארסיות חיידקים. השיטה היא גם ישימה מאוד כדי להתאים לנושאים ניסיוניים שונים ו / או תנאים. חיידקים יכולים להיות מוכנים בדרכים קודמות להזרקה שונות. במקרה של <e...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 90 נייר סינון מ&quot;מ </td><td> Whatman </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> בעל זכוכית מסנן </td><td> Millipore </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> Manduca סקסטה ביצים </td><td> אספקת קרוליינה הביולוגית </td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td> דיאט עש הצועני + אגר </td><td> Biomedicals MP </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5.5 גר &#39;. מכולות ומכסי פלסטיק </td><td> חברת גביע יחיד </td><td> URC55-0090-0090 Pl4 </td><td></td></tr><tr><td> 1 גר &#39;. מכולות ומכסי פלסטיק </td><td> DART מכולות תאגיד </td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137 המ&quot;מ NaCl, 2.7 mM KCl, 8 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 1.46 mM KH 2 4 ת.ד., 7.4 pH </td></tr><tr><td> מזרק </td><td> המילטון </td><td> 80208 </td><td> 30 מד, 0.375 &quot;אורך, סגנון נקודה 2 </td></tr></tbody></table>

rearing and injection of manduca sexta larvae to assess bacterial virulence

Manduca סקסטה, הידוע בכינויו hornworm הטבק, נחשבת למזיק חקלאי משמעותי, האכלה על צמחי solanaceous כוללים טבק ועגבנייה. רגישותו של מ &#39; זחלי סקסטה למגוון מיני entomopathogenic חיידקי 1-5, כמו גם השפע של מידע הזמין לגבי מערכת חיסון של חרק 6-8, ואת רצף הגנום עד 9 להפוך אותו לאורגניזם מודל טוב לשימוש בחקר אינטראקציות מארח חיידק במהלך פתוגנזה. בנוסף, מ &#39; זחלי סקסטה גדולים יחסית וקלים לתפעל ולתחזק במעבדה היחסית למיני חרקים רגישים אחרים. ממדיהן גדולים גם מאפשרים מיצוי רקמה / hemolymph יעיל לניתוח של תגובת המארח לזיהום. השיטה שהוצגה כאן מתארת ​​הזרקה הישירה של חיידקים לhemocoel (חלל דם) של מ &#39; זחלי סקסטה. גישה זוניתן להשתמש בו כדי לנתח ולהשוות את המאפיינים הארסיים של מינים שונים של חיידקים, נקע, או פשוט על ידי מוטציות ניטור הזמן למות חרק לאחר הזרקה. שיטה זו פותחה ללמוד פתוגניות של Xenorhabdus ומיני Photorhabdus, אשר בדרך כלל לקשר עם וקטורים נמטודות כאמצעי לזכות כניסה לחרקים. נמטודות Entomopathogenic בדרך כלל להדביק זחלים דרך עיכול טבעי או פתחי נשימה, ולשחרר את תוכנם לתוך החיידקים סימביוטיים hemolymph החרקים (דם) זמן קצר לאחר מכן 10. שיטת ההזרקה המתוארת כאן עוקפת את הצורך בוקטור נמטודות, ובכך מתירה את ההשפעות של חיידקים ונמטודות על החרקים. שיטה זו מאפשרת לספירה מדויקת של חומר מדבק (תאים או חלבונים) בבידוד, דבר שאינו אפשרי בשיטות קיימות אחרות לניתוח entomopathogenesis, כוללות לסחוב 11 ומבחני רעילות אוראליים 12 <eמ &#39;&gt;. כמו כן, מבחני רעילות אוראליים לטפל הארסיות של רעלים מופרשים הציגו לתוך מערכת העיכול של זחלים, ואילו בשיטת ההזרקה הישירה כתובות הארסיות של inocula כל התאים. התועלת של שיטת ההזרקה הישירה כפי שתואר כאן היא לנתח פתוגנזה חיידקים על ידי ניטור תמותת חרקים. עם זאת, שיטה זו יכולה בקלות להיות מורחבת לשימוש בחקר ההשפעות של זיהום על מ &#39; מערכת חיסונית של סקסטה. החרקים מגיבים לזיהום באמצעות שתי תגובות הומורלית ותאיות. התגובה הומורלית כוללת זיהוי תבניות חיידקים הקשורים והפקה הבאה של פפטידים שונים מיקרוביאלית 7; הביטוי של גני מקודדי חלבונים אלה יכול להיות במעקב לאחר זיהום ישיר באמצעות RNA חילוץ וכמותית PCR 13. התגובה התאית לזיהום כרוך nodulation, אנקפסולציה, וphagocytosis של חומרים מזהמים על ידי hemocytes 6 </sup&gt;. כדי לנתח את התגובות האלה, חרקים מוזרקים יכולים להיות גזורים ומדמיינים ידי מיקרוסקופיה 13, 14.

דוגמה מייצגת של assay תמותת חרקים מתואר באיור 3. בניסוי זה, חרקים הוזרקו כ 50 יחידות להרכיב מושבה (CFU) של כל אחד מסוגים פרא (ATCC19061) או זן מוחלש מוטציה (LRP 13) של Xenorhabdus nematophila גדל שלב יומן האמצע (n = 6 חרקים למתח). חרקים נצפו במשך כ 72 שעות, ואחוזים מהחרקים הזר...

Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence at JoVE.com

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

השיטה המתוארת כאן מנצלת הזרקה ישירה של חיידקי entomopathogenic לhemocoel של<em&gt; Manduca סקסטה</em&gt; זחלי חרקים.<em&gt; מ סקסטה</em&gt; הוא חרק זמין מסחרי ונחקר היטב. לכן, שיטה זו מייצגת גישה פשוטה לניתוח אינטראקציות מארח בקטריאלי מנקודת המבט של אחד או שני בני הזוג.

גידול והזרקה של<em&gt; Manduca סקסטה</em&gt; זחלים להערכה ארסית קטריאלי

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

rearing-injection-manduca-sexta-larvae-to-assess-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

12.6K Views.  University of Wisconsin-Madison. השיטה המתוארת כאן מנצלת הזרקה ישירה של חיידקי entomopathogenic לhemocoel של Manduca סקסטה זחלי חרקים. מ סקסטה הוא חרק זמין מסחרי ונחקר היטב. לכן, שיטה זו מייצגת גישה פשוטה לניתוח אינטראקציות מארח בקטריאלי מנקודת המבט של אחד או שני בני הזוג.

Video: Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

ניטור העצרת של מופרש בקטריאלי ארסי פקטור שימוש Crosslinking אתר ספציפי

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can be utilized as an alternative animal model for the study of virulence, host-pathogen interaction, innate immune response, and drug efficacy. Details for the rearing, care and breeding of the hissing cockroach are provided. We also illustrate how it can be infected with bacteria such as the intracellular pathogens Burkholderia mallei, B. pseudomallei, and B. thailandensis. Use of the hissing cockroach is inexpensive and overcomes regulatory issues dealing with the use of mammals in research. In addition, results found using the hissing cockroach model are reproducible and similar to those obtained using mammalian models. Thus, the Madagascar hissing cockroach represents an attractive surrogate host that should be explored when conducting animal studies.

We present a protocol to utilize the Madagascar hissing cockroach as an alternative non-mammalian animal model to conduct bacterial virulence, pathogenesis, drug toxicity, drug efficacy, and innate immune response studies.

מדגסקר שריקה מקק בתור מודל אלטרנטיבי של בעלי חיים שאינם מידע יונקים לחקור התקפה אלימה, פתוגנזה ואת יעילות התרופה

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

זיהוי סמנים התקפה אלימה של Mycobacterium abscessus עבור שכפול תאיים ב Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human diseases have been reported to be associated with four species of bacteria: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, and Aeromonas caviae. The model organism Caenorhabditis elegans is a bacterivore that provides an excellent infection model by which to study the bacterial pathogenesis of Aeromonas. Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection using a C. elegans model, including survival, liquid toxicity, and muscle necrosis assays. The results of the three methods determining the virulence of Aeromonas were consistent. A. dhakensis was shown to be the most toxic among the 4 major Aeromonas species causing clinical infections. These methods are shown to be a convenient way to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species and contribute to our understanding of the pathogenesis of Aeromonas infection.

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection in C. elegans. Using these convenient methods, it is easy to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species.

הערכת התקפה אלימה ו פתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

דגם העכבר כדי להעריך מולדת התגובה החיסונית לזיהום Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...