فإن الكتاب أود أن أشكر بريانكا سوبراهمانيام مفيدة للمناقشات. وقد تنافس على الكتاب أي مصلحة مالية. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من الجمعية الأميركية للسرطان، NIH / NCI K01 CA131487، R21 CA162273، R21 CA162277، وP30 المناعة والأورام العلاج المناعي لبرنامج ويب TJ. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للسرطان أو المعاهد الوطنية للصحة.

1. جيل من AAPC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل إضافة إلى البروتينات والخرز، وإعداد جميع الكواشف ومخازن: 0.1M البورات العازلة؛ 1X PBS-D (لا كا 2 + والمغنيسيوم 2 +)؛ حبة العازلة غسل (1X PBS +5٪ AB الإنسان المصل + أزيد الصوديوم 0.02٪) ؛ متكامل المتوسطة (RPMI متوسطة الصوديوم ملي +100 البيروفات، 10 ملي حل فيتامين غير الضرورية، 100 مم الحل فيتامين MEM، 1٪ 2-المركابتويثانول، 10 ميكرومتر سيبروفلوكساسين، 5٪ AB مصل الإنسان)؛ MACS العازلة (1 L PBS مجانا من الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 +، 5 ز BSA، و 2 EDTA ملمول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف 1 مل الخرز الايبوكسي Dynabeads M-450 مع 3 مل العقيمة 0،1 العازلة البورات M (حمض البوريك والمياه، ودرجة الحموضة 7،0-7،4) في 5 مل قارورة زجاجية واضحة البورسليكات مترابطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في منفصلة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، إضافة 100 ميكروغرام hCD1d-IG ديمر و 20 ميكروغرام costimulatory جزيئات (على سبيل المثال: مكافحة CD28mAb) إلى 1 مل كا ث / س 2 + PBS أو Mg 2 +. </li> &lt;لى&gt; وضع حبة تحتوي على قارورة زجاجية على المغناطيس والرشفة العازلة بورات من الخرز. إضافة خليط من البروتين من الخطوة 1.2 إلى قارورة زجاجية واستبدال الغطاء. مزيج فورا فيال في قلب تغطي سقف مع parafilm، ووضعت على محور دوار واحتضان بين عشية وضحاها في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، ومكان قنينة زجاجية على جذب وإزالة خليط من البروتين، مع تجنب بعناية الخرز. غسل الخرز بإضافة 3 مل العازلة غسل حبة (PBS مع 5٪ AB أزيد الصوديوم في الدم +0.02٪)، واحتضان عند 4 ° C على محور دوار لمدة 5 دقائق. كرر مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين حبات في هذا الخليط غسل حبة. لجعل AAPC وظيفية، إزالة قسامة الصغيرة وعد الخرز باستخدام عدادة الكريات. تأكد من أن يتم تحميل ثابت البروتينات على حبات من تلطيخ مع الأجسام المضادة (مثلا: PE-مترافق المضادة للماوس IgG1) وإجراء تحاليل تدفق cytometric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحميل الخرز مع مستضد، وإزالة 5 × 10 7 حبات، وإضافة إلى قارورة صغيرة 1.5 مل الزجاج، الخرز شطف مع 1 مل العقيمة PBS. Rتغسل حبات esuspend مع 1 مل العقيمة PBS وإضافة مستضد؛ سبيل المثال: تحميل مع α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * ملاحظة: على الرغم من أننا لم الكشف عن أية مشاكل مع ذوبان الدهون أو تشكيل المذيلات، يجب التعامل مع الدهون وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. على وجه التحديد، أعيد تشكيل KRN7000 في DMSO (1mg/ml) لهذه الدراسات. ويمكن أيضا KRN7000 ومستضدات أخرى شحمي سكري يتم حلها في 0.2 ملغ / مل PBS تحتوي على 0.5٪ توين-20 (يصوتن 2 ساعة. في C ° 37). IMPORTANT-AAPC وتحتاج إلى أن يتم تحميل ما لا يقل عن 48-72 ساعة قبل استخدامها. </li></ol> 2. CD161 + عزل خلايا + CD3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMC). لكثافة الفصل Ficoll التدرج الطرد المركزي من الخلايا الليمفاوية من معطف الشهباء أو حزمة leukopheresis، تمييع الدم 1 heparinized مع حجم مساو من 1X PBS في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 مل من Ficoll (تحسنت إلى درجة حرارة الغرفة) لأنابيب مخروطية 50 مل. تراكب ببطء25 مل من الدم المخفف الخليط على رأس Ficoll. أجهزة الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الفرامل قبالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية واجهة اللمفاويات (الحلقة البيضاء بين وسائل الإعلام وFicoll) مع ماصة باستور ونقل إلى أنبوب جديد 50 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا عن طريق ملء الأنبوب إلى 50 مل مع PBS الطرد المركزي في و1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف والجمع الأنابيب من شخص واحد إلى واحد وأنبوب غسل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMC) مرة أخرى مع PBS مل 20. ثم عد PBMC و resuspend بتركيز من 5 7 10 X الخلايا / مل العازلة في MACS (1 L PBS خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 +، 5 ز BSA، و 2 ملمول EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل عزل جزء الخلية T، وتبدأ مع 2 مل من PBMC (10 8 خلايا) وإضافة 100 ميكرولتر من خلية T عموم الحل تخصيب من أدوات EasySep T الإنسان تخصيب الخلية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من الجزيئات المغناطيسية في حل واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. جلب الحجم النهائي من المذيبات إلى 2.5 مل ووضع أنبوب في المغناطيس الأرجواني لمدة 5 دقائق. صب بسرعة قبالة CD3 + جزء في أنبوب مخروطي 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا عن طريق إضافة 5 مل العازلة MACS الباردة، حساب عدد خلايا قابلة للحياة، وإزالة قسامة لتلطيخ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد الخلايا CD161 +، أولا إعادة تعليق التخصيب خلايا T في 980 ميكرولتر العازلة الجليد الباردة MACS، إضافة 10 ميكروغرام مكافحة CD161 ماب، واحتضان في الثلاجة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 1،500 دورة في الدقيقة في C ° 4 لمدة 5 دقائق. ثم إعادة الخلية بيليه في 800 ميكرولتر من العازلة MACS. أضف 200 ميكرولتر من microbeads IgG1 المضادة للماوس واحتضان الحل لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال هذه الخطوة الحضانة، يوازن عمود LS من إضافة 3 عازلة MACS مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، وغسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 1،500 دورة في الدقيقة C ° 4 لمدة 5 دقائق. دورة الفتشوبتنفق الخلايا في 3 مل العازلة MACS. ماصة ثم الخلايا في العمود MACS LS فصل. تأكد لتجنب توليد فقاعات من قبل pipetting ببطء. شطف العمود بإضافة 3 مل من العازلة MACS. كرر مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 مل العازلة MACS الطازجة وإزالة عمود من المغناطيس. العمود مكان في أنبوب 15 مل المخروطية. إدراج المكبس وطرد محتويات تنقية للحصول على CD161 + + CD3 الخلايا. عدد NKT الخلية المخصب الكسر. يجب أن يكون 2-4000000 الخلايا. </li></ol> 3. AAPC بوساطة توسيع NKT الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء شارك في الثقافة من خلال إضافة 10 6 + CD3 CD161 التخصيب + الخلايا التائية و 10 AAPC 6 في المتوسط ​​16 مل كاملة (المتوسطة كاملة + IL-2، 100 U / مل). لوحة هذا الخليط بإضافة 160 ميكرولتر / النهائي جيدا حجم البوليسترين إلى 96 زراعة الأنسجة بشكل جيد المعالجة، U-أسفل لوحة مع تبخر منخفضة الغطاء. أداء تبادل المتوسطة كل يوم ال 7 عن طريق إضافة 80 ميكرولتر من متوسطة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصادالخلايا، عد، وأداء FACS تلطيخ يوم 12-14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن replated الموسع الخلايا NKT كما هو موضح أعلاه في الخطوة 3.1، على وجه التحديد إعادة تعليق 10 6 خلايا T الموسع و 10 AAPC 6 في المتوسط ​​16 مل كاملة. لوحة هذا الخليط بإضافة 160 ميكرولتر / جيد لوحة 96 U-أسفل أيضا. تواصل تحديث المتوسطة coculture كل يوم ال 7 عن طريق إضافة 80 ميكرولتر من المتوسط ​​الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن الأفضل لتجميد خلايا إضافية NKT بعد الجولة الثانية من التوسع (1 X10 6 / cryovial في 1 مل DMSO-5٪ FBS 95٪ /.) </li></ol> 4. اختبار وظيفية: AAPC بوساطة تحفيز خلايا NKT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء 5x10 4 خلايا NKT / 5 AAPC بشكل جيد مع 5x10 في حجم نهائي 200 ميكرولتر (متوسطة كاملة) في 96 لوحة U-أسفل أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف الحصاد لزراعة الخلايا بعد 24-48 ساعة ELISA. </li></ol>

<ol>
	<li>Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+population+of+T-cell+receptor+&#945;&#946;-bearing+thymocytes+which+predominantly+expresses+a+single+V&#946;+gene+family.">A novel population of T-cell receptor &#945;&#946;-bearing thymocytes which predominantly expresses a single V&#946; gene family.</a> Nature. 329, 251-254 (1987).</li><li>Prigozy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolipid+antigen+presentation+by+CD1d+molecules.">Glycolipid antigen presentation by CD1d molecules.</a> Science. 291, 664-667 (2001).</li><li>Davodeau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+phenotypic+and+functional+similarities+between+human+and+murine+&#945;&#946;+T+cells+expressing+invariant+TCR+&#945;-chains.">Close phenotypic and functional similarities between human and murine &#945;&#946; T cells expressing invariant TCR &#945;-chains.</a> J. Immunol. 158, 5603-5611 (1997).</li><li>Exley, M., Garcia, J., Balk, S. P., Porcelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+CD1d+recognition+by+human+invariant+V&#945;24++CD4-CD8-+T+cells.">Requirements for CD1d recognition by human invariant V&#945;24+ CD4-CD8- T cells.</a> J. Exp. Med. 186, 109-120 (1997).</li><li>Koseki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+expression+of+a+distinctive+V14++T-cell+antigen+receptor+&#945;+chain+in+mice.">Dominant expression of a distinctive V14+ T-cell antigen receptor &#945; chain in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7518-7522 (1991).</li><li>Dellabona, P., Padovan, E., Casorati, G., Brockhaus, M., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+invariant+V&#945;24-J&#945;Q/V&#946;11+T+cell+receptor+is+expressed+in+all+individuals+by+clonally+expanded+CD4-8-+T+cells.">An invariant V&#945;24-J&#945;Q/V&#946;11 T cell receptor is expressed in all individuals by clonally expanded CD4-8- T cells.</a> J. Exp. Med. 180, 1171-1176 (1994).</li><li>Porcelli, S. A., Modlin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD1+System:+Antigen-presenting+molecules+for+T+cell+recognition+of+lipids+and+glycolipids.">The CD1 System: Antigen-presenting molecules for T cell recognition of lipids and glycolipids.</a> Annu. Rev. Immunol. 17, 297-329 (1999).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+alpha-galactosylceramide-stimulated+Valpha24++NKT+cells+cultured+in+the+absence+of+animal+materials.">Expansion of alpha-galactosylceramide-stimulated Valpha24+ NKT cells cultured in the absence of animal materials.</a> J. Immunother. 28, 314-321 (2005).</li><li>Bella, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+maturation+of+peripheral+blood+dendritic+cells+in+patients+with+breast+cancer.">Altered maturation of peripheral blood dendritic cells in patients with breast cancer.</a> Br. J. Cancer. 89, 1463-1472 (2003).</li><li>Onishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+and+Short-Lived+Subsets+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+from+Patients+with+Advanced+Cancer.">Dysfunctional and Short-Lived Subsets in Monocyte-Derived Dendritic Cells from Patients with Advanced Cancer.</a> Clinical Immunology. 105, 286-295 (2002).</li><li>Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+function+of+human+invariant+NKT+cells+from+cancer+patients+using+alpha-galactosylceramide-loaded+murine+dendritic+cells.">Evaluation of the function of human invariant NKT cells from cancer patients using alpha-galactosylceramide-loaded murine dendritic cells.</a> J. Immunol. 177, 3484-3492 (2006).</li><li>Shiratsuchi, T., Schneck, J., Kawamura, A., Tsuji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD1+dimeric+proteins+as+indispensable+tools+for+research+on+CD1-binding+lipids+and+CD1-restricted+T+cells.">Human CD1 dimeric proteins as indispensable tools for research on CD1-binding lipids and CD1-restricted T cells.</a> Journal of immunological. 345, 49-59 (2009).</li><li>Webb, T. J., Bieler, J. G., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+natural+killer+T+cells+by+CD1d1-Ig+coated+artificial+antigen+presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of natural killer T cells by CD1d1-Ig coated artificial antigen presenting cells.</a> J. Immunol. Methods. 346, 38-44 (2009).</li><li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins.">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> J. Immunol. Methods. 249, 111-119 (2001).</li><li>Goldberg, J., Shrikant, P., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+augmentation+of+tumor-specific+CTL+responses+by+class+I/peptide+antigen+complexes+on+microspheres+(large+multivalent+immunogen).">In vivo augmentation of tumor-specific CTL responses by class I/peptide antigen complexes on microspheres (large multivalent immunogen).</a> J. Immunol. 170, 228-235 (2003).</li><li>Dal Porto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+soluble+divalent+class+I+major+histocompatibility+complex+molecule+inhibits+alloreactive+T+cells+at+nanomolar+concentrations.">A soluble divalent class I major histocompatibility complex molecule inhibits alloreactive T cells at nanomolar concentrations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6671-6675 (1993).</li><li>Greten, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+antigen-specific+T+cells:+HTLV-1+Tax11-19-specific+CD8++T+cells+are+activated+in+peripheral+blood+and+accumulate+in+cerebrospinal+fluid+from+HAM/TSP+patients.">Direct visualization of antigen-specific T cells: HTLV-1 Tax11-19-specific CD8+ T cells are activated in peripheral blood and accumulate in cerebrospinal fluid from HAM/TSP patients.</a> PNAS. 95, 7568-7573 (1998).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat. Med. 9, 619-625 (2003).</li><li>Huang, M. M. S., Borszcz, P., Sidobre, S., Kronenberg, M., Kane, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1d1+Displayed+on+Cell+Size+Beads+Identifies+and+Enriches+an+NK+Cell+Population+Negatively+Regulated+by+CD1d1.">CD1d1 Displayed on Cell Size Beads Identifies and Enriches an NK Cell Population Negatively Regulated by CD1d1.</a> J. Immunol. 172, 5304-5312 (2004).</li><li>Bourgeois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pro-Th2+cytokine+IL-33+directly+interacts+with+invariant+NKT+and+NK+cells+to+induce+IFN-gamma+production.">The pro-Th2 cytokine IL-33 directly interacts with invariant NKT and NK cells to induce IFN-gamma production.</a> Eur. J. Immunol. 39, 1046-1055 (2009).</li><li>Ugel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+administration+of+artificial+antigen-presenting+cells+activates+low-avidity+T+cells+for+treatment+of+cancer.">In vivo administration of artificial antigen-presenting cells activates low-avidity T cells for treatment of cancer.</a> Cancer Res. 69, 9376-9384 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ويمكن استخدام AAPC لدراسة المتطلبات الأساسية لتنشيط الخلايا NKT ولها قيمة السريرية المجراة إمكانية التوسع السابقين من الخلايا T NK لعلاج مناعي بالتبني. وصف Mescher وآخرون واحد من أنظمة الأولى استنادا حبة، حيث المعقدة البيروكسيديز الطبقة MHC I-الفئران الببتيد واحد يبني سلسلة وجنبا إلى جنب مع جزيئات costimulatory المعقدة البيروكسيديز B7.1 وB7.2 عبر streptavidin على سطح المجهرية اللاتكس 14 و 15. وقد تم بنجاح هذا النهج المستخدمة لتحفيز المستضد محددة الخلايا T من الفئران المعدلة وراثيا. وبالإضافة إلى ذلك، لأن هذا النهج يستخدم احد سلسلة MHC-الببتيد المعقدة لضمان التحميل متجانسة من جزيئات MHC، فإن كل مستضد الببتيد الهدف يتطلب ترنسفكأيشن جديدة للتعبير عن المطلوب واحد مجمع الببتيد سلسلة MHC-، مما يحد من عمومية ما النهج. الأهم من ذلك، رائدة مجموعة الدكتور Schneck هو حبة القائم على AAPC، من خلال تطوير أخرى غير القائمة على حبة الخلوية AAPC، التي أدلى بها اقتران HLA-IG، إشارة 1، ومكافحة CD28، إشارة 2، على الخرز المغناطيسي. وقد وضعت HLA-IG، شكلا فريدا من multimeric HLA تنصهر إلى سقالة المناعي الجزيئي 16 و 17 من جماعته. بعد ذلك، أنها وضعت على أساس MHC-الإيج AAPC، والتي ثبت بشكل فعال لتوسيع CMV وMART-1 CTL محددة 18. هنا، لقد أثبتنا التي يمكن استخدامها CD1d-IG AAPC يستند إلى توسيع الخلايا الوظيفية NKT. وقد استخدمت إحدى الدراسات نظام مماثل لدراسة التفاعل المادي للخلايا NK مع CD1d 19. والجدير بالذكر أن قمنا بتصميم خلية مستضد تقديم الاصطناعية التي هي قابلة للتكيف مع أي متطلبات نجد اللازمة لتكاثر الخلايا NKT الأمثل. طريقة توسيع AAPC يوفر طريقة بسيطة وموثوق بها لتوسيع وإثراء خلايا NKT. يمكن تعديل AAPC لدينا منهجية لتقييم دور لجنة من جزيئات costimulatory المحتملة وتقييم دورها في الخلية NKT proliferaنشوئها ووظيفتها. وهكذا، تمثل التكنولوجيا AAPC قوية تنوعا مفيدا لإحداث وتوسيع الخلايا NKT. توليد aAPCs تستغرق أقل من أسبوع واحد ومناسبة لإنتاج كميات كبيرة من الخرز. ومع ذلك، خطوة حاسمة في توليد AAPC هو للتأكد من أن يتم يجمد ثابت CD1d-الإيج على سطح حبات لتقييم وظائفها لضمان الاتساق من دفعة لدفعة واحدة. وجود قيود المحتملة لهذا النظام هو أنه لا يوجد آلية في مكان لإيقاف التحفيز، وغيرها من الإزالة الميكانيكية من الخرز. على وجه التحديد، وإشراك مستقبلات الخلايا T (TCR) مع المستضد: مجمع CD1d/MHC توليد عادة المشبك المناعية بالتنسيق مع الإكسسوارات / التصاق جزيئات، والتي يمكن أن تؤدي إلى تحريض من العوامل المثبطة أو الخلية القمعية على كل وT مستضد تقديم الخلايا. في نظام AAPC، قد يكون upregulated هذه العوامل من قبل خلية T، ولكن حبة لن تعبر عن يغاندس وما شابه ذلكلهذه المستقبلات. وبالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت CD4 + الخلايا NKT لقمع ردود انتيتومور في الفئران والبشر، ولذلك فمن الممكن أن تفعيل الخلايا غير انتقائية لجميع NKT (أي التحفيز العالمية مع α-GalCer) أو تفعيل فرعية خاطئة يمكن أن يؤدي إلى المناعية غير المرغوب فيها النتائج. وبناء على ذلك، يجب على المرء ظاهريا وظيفيا تميز الخلية NKT-AAPC الموسع السكان. كما هو مبين في الشكل (4)، وجدنا أن التحفيز مع α-GalCer محملة AAPC معربا عن مكافحة CD28 يمكن أن يؤدي إنتاج خلايا NKT TH1، TH2، والسيتوكينات نوع Th17. وأفادت الدراسات أن الفئران التحدي مع IL-33، والتي تم تحديدها مؤخرا خلوى، أدى إلى زيادة مستويات تعميم السيتوكينات الالتهابية مثل IL-5 و13-IL. تعزيز العلاج للخلايا NKT مع IL-33 خلوى إنتاجها 20. IL-33 هو يجند محددة لST2 ولقد ثبت أن ذوبان ST2 كاليفورنيان كتلة IL-33 إشارة. وهكذا، وعلى سبيل المثال لتطبيقها في المستقبل، يمكن أن تتولد AAPC ST2 التعبير عن وتستخدم لتحديد ما إذا كان يمكن للمرء أن تمنع بشكل انتقائي إنتاج السيتوكينات TH2 بينما حمل TH1 خلوى من قبل خلايا إفراز NKT. وأفيد أيضا أن حقن الرابع كيلو بايت، معربا عن AAPC في C57BL / 6 الفئران أدى إلى انخفاض الانبثاث الرئة من 21 الورم. الأهم من ذلك، هذه البيانات تثبت أن حركة المرور AAPC إلى الرئة، وتمكن من تنشيط الخلايا T المستجيب مجموعات فرعية. لذلك، يمكن للمرء أن تولد أنواع متعددة من AAPC ودراسة التفاعل بين مجموعات فرعية محددة مستضد الخلايا T. لتلخيص، فإن هذه الدراسات تثبت أن يمكن استخدامها CD1d-IG AAPC القائم على استبدال APC الخلوية العادية، ويجب أن القدرة على تعزيز النهج السريرية الحالية لعلاج مناعي NKT القائم على بالتبني الخلية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> Ficoll-PLUS Paque </td><td> GE العلوم الحياتية </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep خلية T الإنسان التخصيب كيت </td><td> StemCell تكنولوجيا </td><td> 19051 </td><td></td></tr><tr><td> Allophycocyanin CD161 الإنسان ماب </td><td> Pharmingen </td><td> 550968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep المغناطيس </td><td> StemCell تكنولوجيا </td><td> 18002 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الماوس IgG1 Microbeads </td><td> Miltenyi بيوتيك </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> ديمر الحادي عشر المؤتلف مثنوي ماوس قابلة للذوبان CD1d: IG انصهار بروتين </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 557599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; مكافحة CD28 ماب </td><td> Biolegend </td><td> 302914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 الخرز الايبوكسي </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> ألفا galactosylceramide (KRN7000) </td><td> Axxora، LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI متوسطة 1640 </td><td> سيغما الدريتش </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> البيروفات الصوديوم </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> غير الأحماض الأمينية الأساسية </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> فيتامين الحل </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2-المركابتويثانول </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> سيبروفلوكساسين </td><td> الكسيس الكيميائية الحيوية </td><td> 380-288-G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> Biolegend </td><td> 342904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (استنساخ C15) </td><td> بيكمان كولتر </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (استنساخ C21) </td><td> بيكمان كولتر </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> Biolegend </td><td> 123510 </td><td></td></tr><tr><td> PE مكافحة الماوس IgG1 </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 556650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC مكافحة الماوس IgG2a </td><td> Biolegend </td><td> 407105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS، لا الكالسيوم، المغنيسيوم لا </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> أزيد الصوديوم </td><td> سيغما الدريتش </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> الأبقار مصل الزلال </td><td> Bioanalytical الأمريكية </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> سيغما الدريتش </td><td> 431788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 354043 </td><td></td></tr><tr><td> الإنسان AB المصل </td><td> أتلانتا الحيوية </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Labquake أنبوب الدوار </td><td> فيشر العلمية </td><td> 13-687-10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD 5 مل فالكون البوليسترين جولة القاع أنابيب </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14-959-1A </td><td></td></tr><tr><td> قوارير الزجاج ويتون عينة مع كاب </td><td> فيشر العلمية </td><td> صغيرة (03-343-6A) كبير (03-343-6E) </td><td></td></tr></tbody></table>

artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells

الطبيعية القاتلة T (NKT) الخلايا هي مجموعة فرعية من الخلايا T فريدة من نوعها التي تعرض علامات مميزة لكلا القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا وخلايا T 1. على عكس الخلايا T الكلاسيكية، وخلايا الدهون NKT الاعتراف مستضد في سياق CD1 جزيئات 2. الخلايا NKT إبداء ثابتة إعادة ترتيب سلسلة TCRα: Vα14Jα18 في الفئران والبشر في Vα24Jα18، الذي يرتبط مع سلاسل Vβ التنوع محدودة 3-6 و ويشار إليه على أنه الكنسي أو ثابتة خلايا (ط NKT) NKT. مماثلة لخلايا T التقليدية، وخلايا CD4 NKT تطوير من CD8-T-التوتة خلايا السلائف بعد إشارات مناسبة من CD1d 7. وزادت القدرة على الاستفادة من الخلايا لأغراض علاجية NKT بشكل كبير مع القدرة على تحفيز وتوسيع خلايا NKT مع Galactosylceramide-α (α-GalCer) ومجموعة متنوعة من السيتوكينات 8. الأهم من ذلك، احتفظت هذه الخلايا الأصلية phenotypه، السيتوكينات يفرز، وظيفة السامة للخلايا ضد عرض خطوط الخلايا السرطانية. وهكذا، الخلايا خارج الجسم الموسعة NKT تبقى وظيفية، ويمكن استخدامها لعلاج مناعي بالتبني. ومع ذلك، فقد اقتصرت القائمة على الخلية NKT العلاج المناعي عن طريق استخدام خلايا مستضد ذاتي تقديم وكمية ونوعية هذه الخلايا يمكن أن تختلف إلى حد كبير مشجعا. تم الإبلاغ عن الوحيدات المستمدة من DC مرضى السرطان للتعبير عن انخفاض مستويات جزيئات costimulatory وإنتاج السيتوكينات الالتهابية أقل 9،10. في الواقع، وقد استخدمت DC الفئران بدلا من APC ذاتي لاختبار وظيفة الخلايا من المرضى NKT CML 11. ومع ذلك، لا يمكن إلا أن هذا النظام يستخدم لاختبار في المختبر حيث لا يتم توسيع الخلايا NKT بواسطة DC الفئران وتستخدم بعد ذلك لعلاج مناعي بالتبني. وهكذا، يمكن لنظام موحد يعتمد على خلايا مستضد تقديم الاصطناعي (AAPC) تنتج على المؤثرات المحفزة للDC بدون مطبات أو ألو م أعضاء غير بشريةLLS 12 و 13. هنا، نحن تصف طريقة لتوليد CD1d القائم على AAPC. منذ إشراك مستقبلات الخلايا T (TCR) من CD1d مستضد المجمعات شرط أساسي لتنشيط الخلايا NKT، مستضد: مجمعات CD1d-IG توفر طريقة موثوق بها لعزل وتنشيطها وتوسيع المستجيب السكان الخلية NKT.

هنا نحن تصف طريقة لتوليد CD1d-IG AAPC القائمة، التي أدلى بها توصيل التساهمية من CD1d-الإيج ومكافحة CD28 ماب لالخرز المغناطيسي لتحفيز خلايا NKT كوسيلة من وسائل موحدة لنشر خلايا NKT (الشكل 1): أولا، يجب على المرء أن تثبت أن يجمد والبروتينات الانصهار ثابت CD1d-الإيج على سطح من الخرز المغناطيسي. كما هو مبين في الشكل 2A، CD1d IG-CD28-ومكافحة وأعرب كل من الأجسام المضادة على سطح حبات المغناطيسي. دراسة القدرة تنشيطية للAAPC، ونحن الخلية NKT المشترك مع مثقف hybridomas AAPC بين عشية وضحاها، supernatants الثقافة وتحصد قياس إنتاج IL-2 بواسطة ELISA. وجدنا أن CD1d-IG مقرها AAPC كانت قادرة على تحفيز الخلايا hybridomas NKT عند مستويات مساوية أو أعلى من نظرائهم الخلوية (الشكل 3، والبيانات لا تظهر). ومن المثير للاهتمام، وجدنا أن يتم تحفيز الخلايا لدينا hybridomas الماوس NKT من AAPC CD1d الانسان ومقرها (FIجوري 2B)، الذي يوفر طريقة بسيطة لاختبار كل دفعة من AAPC. وبعد ذلك، سعينا لإثبات إمكانية نشر AAPC، عزل الخلايا T وبالتالي الإنسان من الدم المحيطي. الأول كان CD161 + إثراء CD3 + T الخلية جزء من فصل حبة المغناطيسي. ثم، وحفز الخلايا T-α كل أسبوعين مع GalCer محملة AAPC. الأهم من ذلك، وجدنا أنه حتى مع الانخفاض النسبي الأولية سكان الخلية NKT (0.03٪)، كنا قادرين على توسيع الخلايا ل67٪ ~ Vα24 + Vβ11 + (الشكل 3). قمنا بتوسيع الخلايا NKT من PBMC العديد من المتطوعين الأصحاء ومرضى السرطان ولقد وجدت أن α-GalCer تحميل AAPC كانوا قادرين على توسيع الخلايا NKT السكان في كلا المجموعتين. وتجدر الإشارة إلى أن معدل التوسع غاية المانحة التابعة. كما هو متوقع وارتفاع عدد السكان من الخلايا الأولية + Vα24، وزيادة النسبة المئوية للتوسع. وبالإضافة إلى ذلك،عند استخدام السكان بدءا من 2 مليون خلية CD161 + + CD3 خلايا T، يمكن للمرء أن الحصول على&gt; 10 7 الخلايا بعد جولتين من التوسع (الجدول 1). حوالي 80-90٪ من الخلايا NKT الموسع CD4 +، ~ 5٪ CD8 +، والباقي هي فرضا CD4 CD8-الخلايا المزدوج السلبية NKT. ويمكن استخدام هذه الخلايا الموسع للدراسات الفنية NKT كما هو موضح في الشكل 4A-C. لقد وجدنا أن لدينا فيفو السابقين الخلايا توسيع NKT تظل استجابة لα-GalCer التحفيز وتعتبر منتجة قوية من IL-17A، TNF-α، γ IFN و. تجدر الإشارة إلى أنه إذا الخلية الأولية T السكان منخفض التخصيب واحد غير قادر على أداء الخطوة الثانية CD161 التخصيب، وتوسيع AAPC بوساطة قد لا تسفر عن النتائج المتوقعة (انظر الشكل 4D، المانحة 1). ومع ذلك، إذا كانت النسبة المئوية للخلايا NKT المتداولة هي أعلى من 0.1٪، وينبغي للمرء أن يكون لا يزال قادرا على الحصول على توسع كبيرمن الخلايا NKT ط. بشكل جماعي، وهذه البيانات تظهر أنه يمكن استخدام CD1d القائم على AAPC بشكل فعال لتوسيع وتحفيز الخلايا الأولية الإنسان NKT. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> الشكل 1. وتنصهر IG-مقرها خارج الخلية aAPCs أجزاء من جزيء CD1d إلى المنطقة المستمر لسلسلة البروتين المناعي الثقيلة مفصولة رابط قصيرة من الأحماض الأمينية: الرسم التخطيطي لCD1d. ويمكن تحميل هذه الجزيئات بسهولة مع مستضدات الدهون، مثل α-GalCer، ببساطة عن طريق احتضان لهم وجود فائض من الدهون في المصالح. وأدلى AAPC وذلك بربط CD1d-الإيج والقيمة المطلقة لمكافحة CD الخرز المغناطيسي. في هذا النظام، يتم استخدام CD1d-IG وما شابه ذلك لتوفير مستضد محددة من خلال إشارة ومكافحة CD28 TCR-ماب يوفر إشارة costimulatory. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="4.25in" fس: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot; /&gt; الشكل 2. تم اختبار FACS تلطيخ من البروتينات السطحية على aAPCs A aAPCs) لوجود CD1d: مفتش ديمر (عن طريق تلطيخ مع IgG1 مكافحة الماوس PE-مترافق)، وكذلك الأجسام المضادة لمكافحة CD28 (باستخدام FITC، مترافق مكافحة الماوس IgG2a) . المدرج الاحصائي تشير المفتوح تحكم نمط إسوي؛ المدرج الاحصائي مليئة تمثل الأجسام المضادة المشار إليه. يمكن CD1d-IG AAPC تعرب عن تحفيز إنتاج IL-2 قبل خلايا NKT. B) وcocultured و+ Vα14 الماوس NKT خلية ورم هجين، DN32.D3، إما متوسطة، مستضد القابلة للذوبان (α-GalCer)، أو تفريغ AAPC AAPC α-GalCer محملة. تم حصادها supernatants الثقافة، وكان يستخدم معيار لقياس ELISA ساندويتش IL-2 الإنتاج. <img alt="الشكل 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> الشكل 3. توسيع الخلايا NKT من CD1d-IG المغلفة خلايا مستضد تقديم الاصطناعي. (A) CD3 + الابتدائية CD161 + تم عزل الخلايا إيجابية مزدوجة من PBMCs باستخدام مغناطيس. وحفز الخلايا α-مصنفة مع GalCer تحميل، CD1d-IG AAPC المغلفة لمدة 14 يوما. كانت ملطخة الخلايا لتحفيز Vα24 وVβ11 AAPC التالية. (B) بوساطة الخلايا الأولية NKT الإنسان تحلل من خط الخلية اللمفاوية B. C1R-CD1d الخلايا مع الخلايا المحتضنة NKT في نسب المشار إليها في وجود أو عدم وجود مستضد، وGalCer-(100 نانوغرام / مل) في لوحات أسفل U-96-جيدا للفترة 20-24 ساعة. تم تقييم NKT الخلية بوساطة تحلل الخلايا التي قدمها مقايسة 51Cr الإفراج القياسية. <img alt="الشكل 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> الشكل 4. ملامح من خلايا خلوى NKT-AAPC الموسعة. </stronز&gt; بعد التحفيز مع تحميل α AAPC GalCer لمدة أسبوعين، وتوسيع الخلايا NKT (1 × 10 5 / أيضا) وcocultured مع ذوبان α-GalCer، سلطة النقد الفلسطينية / Ionomycin، microbeads anti-CD3/28، أو α-GalCer AAPC تحميل (2 × 10 5 / أيضا) لمدة 48 ساعة. (A) IL-17A، (B) TNF-α، و (C) الإنترفيرون γ تم قياس الإنتاج عن طريق ELISA خلوى القياسية. البيانات المعروضة هي صافي إنتاج السيتوكينات بعد طرح الضوابط السلبية (إدارة الإعلام والخرز فارغ). (D) T تم عزل الخلايا الأولية من PBMC باستخدام حبة الفصل المغناطيسي. وحفز الخلايا مصنفة لمدة أسبوعين مع الإشارة A-GalCer تحميل-AAPC. كانت ملطخة الخلايا باستخدام القيمة المطلقة محددة لVα24 + + وVβ11 وتحليلها من قبل التدفق الخلوي.

Watch this Scientific Journal Video about Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells at JoVE.com

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

نحن هنا وصف طريقة لتفعيل وتوسيع خلايا NKT من معظم السكان الخلية باستخدام خلايا T مستضد تقديم الاصطناعي (AAPC). استخدام CD1d القائم على AAPC يوفر طريقة موحدة لتوليد أعداد كبيرة من الخلايا NKT الوظيفية.

مستضد تقديم الاصطناعي تنشيط الخلية بوساطة (AAPC) والتوسع في الخلايا التائية القاتلة الطبيعية

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

artificial-antigen-presenting-cell-aapc-mediated-activation-expansion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

17.9K Views.  University of Maryland. نحن هنا وصف طريقة لتفعيل وتوسيع خلايا NKT من معظم السكان الخلية باستخدام خلايا T مستضد تقديم الاصطناعي (AAPC). استخدام CD1d القائم على AAPC يوفر طريقة موحدة لتوليد أعداد كبيرة من الخلايا NKT الوظيفية.

Video: Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

إعداد واستخدام HIV - 1 CD4 + T الابتدائية المصابة خلايا والخلايا المستهدفة في الخلايا القاتلة الطبيعية فحوصات السامة للخلايا

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA - الإيج بناء خلايا مولدة الاصطناعي تقديم الكفء لل خارج الحي توسيع CTL الإنسان

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

السريرية تطبيق<em&gt; الجمال النائم</em&gt; ومستضد تقديم الخلايا الاصطناعية لتعديل وراثيا خلايا T من دم الحبل السري والمحيطية

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

القاتل مستضد تقديم الخلايا الاصطناعي (KaAPC) للكفاءة<em&gt; في المختبر</em&gt; استنفاد خلايا T الإنسان مستضد محددة

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

والطريقة الأمثل لعزل وتوسيع قسما ثابتا الطبيعية الخلايا التائية القاتلة من الماوس الطحال

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

تطوير التهاب القولون نموذج مدفوعة مستضد لدراسة عرض المستضدات التي كتبها مستضد الخلايا إلى خلايا T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

تطوير المستمدة الخلية الجذعية خلايا T التنظيمية مستضد محددة ضد المناعة الذاتية

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.