저자는 도움이 토론을 Priyanka Subrahmanyam 감사드립니다. 저자는 금융 관심을 경쟁 없습니다. 이 작품은 미국 암 학회, NIH / NCI K01 CA131487, R21 CA162273, R21 CA162277 및 P30 종양 면역학과 TJ 웹에 Immunotherapy 프로그램에서 보조금에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며, 반드시 국립 암 연구소, 건강의 국립 연구소의 공식 전망을 대표하지 않습니다.

1. aAPC의 생성 <ol><li> 구슬에 단백질을 추가하기 전에 모든 시약 및 버퍼 준비 : 0.1M Borate 버퍼를, 1X D-PBS (NO 칼슘 2 +와 MG 2 +), 비드 워시 버퍼 (1X PBS 5% 인간 AB 혈청 + 0.02 % 나트륨 azide) , 전체 매체 (RPMI 매체 100 MM 나트륨 pyruvate, 10 MM 중요하지 않은 비타민 솔루션, 100 MM 가상 비타민 솔루션, 1 % 2 - 메르 캅토 에탄올, 10 μM의 * 시프로플록사신, 5 % 인간 AB 혈청), 맥 버퍼 (1 L PBS 무료 칼슘 2 +와 MG 2 +, 5g BSA, 2 mmol EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). </li><li> 5 ML 명확한 붕규산 유리 스레드 유리 병 3 ML 멸균 0.1 M Borate 버퍼 (붕산과 물, 산도 7.0-7.4) 1 개 ML Dynabeads M-450 에폭시 구슬을 씻어. </li><li> 1 ML PBS w / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 + : 별도의 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 100 μg hCD1d-IG 이량 체 및 20 μg의 costimulatory 분자 (안티 - CD28mAb 예를 들어)을 추가합니다. </li> &lt;리&gt; 장소 구슬 구슬의 자석 및 기음 borate 버퍼에 유리 병을 포함. 단계 1.2에서 유리관에 단백질 혼합물을 추가하고 캡을 교체하십시오. 반전 유리 병에 의해 즉시 혼합, 회전하는 것에 parafilm과 캡, 및 장소를 커버와 4 ° C.에서 하루 아침에 품다 </li><li> 조심스럽게 구슬을 피하면서 다음 날, 장소 유리 자석에 약병하고, 단백질 혼합물을 제거합니다. 3 ML 비드 세척 버퍼를 (PBS와 5퍼센트 AB 혈청 0.02 %의 나트륨 azide)을 추가, 5 분의 회선 근에 ° C 4에 잠복기로 구슬을 씻으십시오. 두 번 반복합니다. </li><li> 구슬이 구슬 세탁 혼합물에 저장 할 수 있습니다. 기능 aAPC을 만들려면, 작은 나누어지는를 제거하고 hemacytometer를 사용하여 구슬을 계산합니다. 단백질이 안정적으로 항체 (예 : PE-복합 안티 - 마우스 IgG1)으로 얼룩 및 흐름 cytometric 분석을 수행하여 구슬에로드되어 있는지 확인합니다. </li><li> 항원과 구슬을로드하려면, 5 X 10 7 구슬을 제거하고 작은 1.5 ML의 유리관에 추가, 1 ML 멸균 PBS로 구슬을 씻어. Resuspend 1 ML 멸균 PBS로 구슬을 씻고 및 항원 추가, 예 : α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml)을로드합니다. * 참고 : 우리는 지질 용해도 또는 마이셀 형성에 문제를 발견하지 않은 있지만, 지질은 제조업체의 권장 사항에 따라 처리해야합니다. 특히, KRN7000은 이러한 연구에 DMSO (1mg/ml)에서 재구성되었습니다. KRN7000 및 기타 glycolipid 항원은 0.2 MG / ML PBS는 0.5 %를 포함에 용해 될 수 십대 초반 - 2​​0 (2 시간을 sonicate. 37 ° C에서). 중요 - aAPC는 사용하기 전에 적어도 48-72 시간에로드해야합니다. </li></ol> 2. CD161 + 3 번 CD + 세포의 분리 <ol><li> 말초 혈 mononuclear 세포 (PBMC)를 수집합니다. 버피 코트 나 leukopheresis 팩에서 림프구의 Ficoll 밀도 기울기 원심 분리 분리를 들어, 첫 번째 방 온도에서 1X PBS의 동일한 볼륨으로 heparinized 혈액을 희석. </li><li> Ficoll 15 ML (객실 온도로 예열) 50 ML 원뿔 튜브에 추가합니다. 천천히 오버레이25 Ficoll 상단에 희석 혈액 혼합물의 ML. 브레이크 해제로 실온에서 30 분에 2,000 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 파스퇴르 피펫으로 림프구 인터페이스 (미디어 및 Ficoll 사이에 하얀 링)을 제거하고 새로운 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> PBS로 50 ML에 튜브를 작성하고 5 분에 1,500 rpm으로 centrifuging하여 세포를 씻으십시오. 표면에 뜨는을 취소하고 단일 관에 한 개인의 튜브를 결합, 20 ML PBS로 다시 말초 혈 mononuclear 세포 (PBMC)를 씻는다. 그런 다음 PBMC를 계산 5 X 10 7 세포 / 맥 버퍼에 ML의 농도에 resuspend (CA 2 단계 중 1 L PBS 무료 +와 MG 2 +, 5g BSA, 2 mmol EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). </li><li> T 세포 분획을 분리하기 위해, PBMC (10 8 셀) 2 ML로 시작하고 EasySep 인간 T 세포 농축 키트의 팬 T 세포 농축 솔루션 100 μl를 추가합니다. 10 분 동안 실온에서 알을 품다. </lI&gt; <li> 또 다른 10 분 동안 실온에서 솔루션과 부화 자기 입자의 100 μl를 추가합니다. 2.5 용매 ML의 최종 볼륨을 데려와 5 분의 보라색 자석에 튜브를 놓습니다. 빠르게 15 ML 원뿔 튜브에 3 번 CD + 일부를 부어. </li><li> 5 ML 추위 맥 버퍼를 추가하여 세포를 씻으, 가능한 세포의 수를 계산하고, FACS의 착색에 나누어지는을 제거합니다. </li><li> 980 μl 얼음 차가운 맥 버퍼에 CD161 + 세포 먼저 resuspend 농축 T 세포를 선택하려면, 10 μg 항 CD161적인 mAb를 추가하고 10 분 동안 냉장고에 품다. </li><li> 5 분에 대해 4 ° C에서 1,500 rpm으로 세포를 원심 분리기. 맥 버퍼 800 μl의 다음 reconstitute 세포 펠릿. 안티 - 마우스 IgG1 microbeads 200 μl를 추가하고 4시 10 분에 대한 솔루션을 품다 ° C. </li><li> 이 부화 단계에서, 3 ML 맥 버퍼를 추가하여 LS 열을 평형. </li><li> 다음 5 분에 대해 4 ° C에서 1,500 rpm을 centrifuging하여 세포를 씻어. 열매3 ML 맥 버퍼에 셀을 보냅니다. 그런 다음 LS 맥 분리 칼럼으로 세포를 피펫. 천천히 pipetting하여 거품을 발생하지 않도록해야합니다. 맥 버퍼 3 ML을 추가하여 열을 씻어. 두 번 반복합니다. </li><li> 3 ML 신선한 맥 버퍼를 추가하고 자석의 열을 제거합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 장소 열. 플런저를 삽입하고 정화 CD161 + 3 번 CD + 세포를 얻기 위해 내용을 밀어. 카운트 NKT 세포에는 소수점으로 값진 경험을했습니다. 당신은 2-4000000 세포가 있어야합니다. </li></ol> 3. aAPC로 인한 NKT 세포 확장 <ol><li> 16 ML 전체 매체 (전체 중간 + IL-2, 100 U / ML)에서 10 6 강화 CD161 + 3 번 CD + T 세포와 10 6 aAPC을 추가하여 공동 문화를 설정합니다. , 96 잘 조직 문화 취급 폴리스티렌으로 낮은 증발 뚜껑이있는 U-바닥 판을 160도 최종 / μl 볼륨을 추가하여 판이 혼합합니다. 신선한 매체의 80 μl를 추가하여 매 7 일 하루 매체 교환을 수행합니다. </li><li> 수확세포는, 계산하고, 일 12-14에 FACS의 착색을 수행합니다. </li><li> 확장 NKT 세포는 특히 16 ML 완전한 매체에 10 6 확장 된 T 세포와 10 6 aAPC을 resuspend, 위의 단계 3.1에 설명 된대로 replated 할 수 있습니다. μl / 잘 96도 U-바닥 판 160를 추가하여 판이 혼합합니다. 신선한 매체의 80 μl를 추가하여 매 7 일 일 coculture 매체를 새로 고침 계속합니다. </li><li> 이 확장의 두 번째 라운드에 따라 추가 NKT 세포를 동결하는 것이 가장 좋습니다 (1 ML-5퍼센트 DMSO / 95% FBS 1 X10 6 / cryovial.) </li></ol> 4. 기능 테스트 : NKT 세포 aAPC로 인한 자극 <ol><li> 5x10 4 NKT 세포를 설정 / 잘 96도 U-바닥 판 200 μl 최종 볼륨 (전체 매체)에 5x10 5 aAPC을 갖추고 있습니다. </li><li> 24-48 시간 후 엘리사에 대한 수확 세포 배양 표면에 뜨는. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

aAPC는 NKT 세포 활성화를위한 기본 요구 사항을 연구하는 데 사용하며 입양 immunotherapy에 대한 NK T 세포의 전 생체 확장에 대한 잠재적 인 임상 적 가치를 가지고 할 수 있습니다. Mescher 외이 있습니다. 라텍스 마이크로 14, 15의 표면에 biotinylated costimulatory 분자 streptavidin을 통해 B7.1와 B7.2와 결합 된 최초의 구슬 기반 시스템 중 하나 인 biotinylated 손쥐 MHC 클래스 I-펩타이드 단일 사슬 구조를 설명했다. 이러한 접근 방식이 성공적으로 형질 전환 생쥐에서 항원에 특정한 T 세포를 자극하는 데 사용되었습니다. 이 접근법은 MHC 분자의 균일 한로드을 보장하기 위해 단일 ​​체인 MHC-펩타이드 복합를 사용하고 있기 때문에 또한, 각 대상 펩타이드 항원 따라서의 일반성을 제한, 원하는 단일 체인 MHC-펩타이드 복잡한 표현을위한 새로운 transfection를 요구 접근. 중요한 것은, 박사 Schneck의 그룹은 또 다른 비 세포 비드 기반 aAPC를 개발하여, 비드 기반 aAPC을 개척, 자기 구슬에 HLA-IG, 신호 1, 항 CD28, 신호 2, 커플 링으로했습니다. HLA-IG, 면역 글로불린 분자 골격 16, 17 융합 HLA의 고유 한 multimeric 양식은 자신의 그룹에 의해 개발되었다. 그 후, 그들은 효과적으로 CMV와 마트-1 특정 CTL 18 확대 표시 한 MHC-IG 기반 aAPC을 개발했습니다. 여기, 우리는 CD1d-IG 기반 aAPC가 작동 NKT 세포를 확장하는 데 사용할 수있는 증명하고있다. 한 연구는 CD1d 19과 NK 세포의 물리적 상호 작용을 조사하기 위해 비슷한 시스템을 사용하고 있습니다. 특히, 우리는 최적의 NKT 세포 증식에​​ 필요한 찾을 수 요구 사항에 적용 할 수 있습니다 인공 항원 제시 세포를 설계했습니다. aAPC 확장 방법은 인간의 NKT 세포를 확대하고 풍부하게하는 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 우리 aAPC는 체계적으로 잠재적 인 costimulatory 분자의 패널의 역할을 평가하고 NKT 세포 prolifera에서 자신의 역할을 평가하기 위해 수정할 수 있습니다기 및 기능. 따라서, aAPC는 NKT 세포를 유도하고 확장에 유용한 강력한 다목적 기술을 나타냅니다. aAPCs의 세대 미만의 주 소요 구슬의 대량 생산에 적합합니다. 그러나 aAPC을 생성에 중요한 단계는 CD1d-IG는 안정적 구슬의 표면에 고정되어 있는지 확인하고 일괄 배치에 일관성을 보장하기 위해 자신의 기능을 평가하는 것입니다. 시스템의 잠재적 인 제한은 구슬의 기계적 제거 이외의 자극을 해제하는 장소에서 메커니즘이 없을 것입니다. 특히, 항원과 T 세포 수용체 (TCR)의 참여 : CD1d/MHC 단지는 일반적으로 T 세포와 모두에서 억제 또는 진압 요인의 유도 될 수 있습니다 액세서리 / 접착 분자와 협력의 면역 시냅스를 생성 항원이 세포를 제시. aAPC 시스템에서 이러한 요소는 T 세포에 의해 upregulated 될 수도 있지만 구슬은 같은 종류의 리간드를 표현하지 않습니다이 수용체에. 또한 CD4 + NKT 세포는 마우스와 인간의 antitumor 응답을 억제하기 위해 표시되었습니다, 따라서 모든 NKT 세포 (α-GalCer있는 즉, 글로벌 자극) 또는 잘못된 부분 집합의 활성화 nonselective 활성화가 원치 않는 면역이 발생할 수 가능성이 있습니다 결과. 따라서, 하나는 phenotypically하고 기능적으로 aAPC 확장 된 NKT 세포 인구를 특성화해야합니다. 그림 4에 도시 된 바와 같이, 우리는 안티 CD28을 표현 α-GalCer -로드 aAPC과 자극이 Th2 Th1을 생산하는 NKT 세포, 그리고 Th17 형 크린 시토 킨을 발생할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 손쥐 연구 IL-33, 최근에 확인 시토 킨과 도전 이러한 IL-5 및 IL-13 등의 염증성 크린 시토 킨을 순환의 증가 수준으로 이어진보고했습니다. IL-33와 NKT 세포 치료는 시토 킨 생산 20 강화했습니다. IL-33은 ST2에 대한 특정 리간드이며, 그 용해 ST2 CA 보여왔다N 블록 IL-33 신호. 따라서, 미래의 응용 프로그램의 예를 들어, aAPC 표현 ST2가 생성 및 NKT 세포의 Th1 시토 킨 분비를 유도하면서 하나가 선택적으로 Th2 크린 시토 킨의 생산을 억제 할 수 있는지 확인하기 위해 사용될 수있다. 또한보고되었습니다 그 IV 주입 KB - 표현 C57BL에 aAPC을 / 6 쥐가 종양이 21 감소 폐 전이있었습니다. 중요한 것은, 이러한 데이터는 폐에 해당 aAPC 트래픽을 입증하고 효과기 T 세포 하위 집합을 활성화 할 수 있습니다. 따라서, 하나는 aAPC의 여러 유형을 생성하고 항원 특정 T 세포의 하위 집합 사이의 상호 작용을 조사 수 있습니다. 요약하면,이 연구 CD1d-IG 기반 aAPC은 정상적인 세포 APC를 대체하는 데 사용할 수 있다는 것을 입증하고, NKT 세포 기반 입양 immunotherapy에 대한 현재 임상 접근법을 향상 할 수있는 잠재력이 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE 생명 과학 </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep 인간 T 세포 농축 키트 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 19,051 </td><td></td></tr><tr><td> Allophycocyanin CD161 인간적인 mAb </td><td> Pharmingen </td><td> 550968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep 자석 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 18,002 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 IgG1 Microbeads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> 이량 체 XI 재조합 가용성식이 Dimeric 마우스 CD1d : IG의 융합 단백질 </td><td> BD Biosciences </td><td> 557599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; 안티 CD28적인 mAb </td><td> Biolegend </td><td> 302914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 에폭시 구슬 </td><td> 생명 기술 </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> 알파 galactosylceramide (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 매체 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 Pyruvate </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> 비타민 솔루션 </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - 메르 캅토 에탄올 </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> * 시프로플록사신 </td><td> 알렉시스의 Biochemicals </td><td> 380-288 - G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> Biolegend </td><td> 342904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (복제 C15) </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (복제 C21) </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> Biolegend </td><td> 123510 </td><td></td></tr><tr><td> PE 방지 마우스 IgG1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 556650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC 안티 - 마우스 IgG2a </td><td> Biolegend </td><td> 407105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, 아니 칼슘, 마그네슘 없음 </td><td> 생명 기술 </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 Azide </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> Bioanalytical 미국 </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 431788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354043 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 AB 세럼 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Labquake 튜브 회전하는 것 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-687 - 10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD 매 5 ML의 폴리스티렌 내내 아래로 튜브 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14-959 - 1A </td><td></td></tr><tr><td> 모자와 Wheaton의 유리 샘플 병 </td><td> 피셔 과학 </td><td> (03-343 - 6E) 대형 (03-343 - 6A) 소형 </td><td></td></tr></tbody></table>

artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells

자연 킬러 T (NKT) 세포는 자연 킬러 (NK) 세포와 T 세포 하나 둘의 특성 마커를 표시 T 세포의 고유 한 하위 집합입니다. 고전 T 세포와는 달리 NKT 세포는 CD1 분자 2의 맥락에서 지질 항원을 인식하고 있습니다. 쥐 Vα14Jα18 및 제한된 다양성 3-6의 Vβ 체인과 관련된 인간에 Vα24Jα18, 그리고 표준 또는 불변 NKT (I NKT) 세포라고합니다 : NKT 세포는 불변 TCRα 체인 다시 정리하기를 표현한다. 기존의 T 세포와 마찬가지로, NKT 세포는 CD1d에 7 적절한 신호에 따라 CD4 - CD8-thymic 전구체 T 세포에서 개발할 수 있습니다. 치료 목적으로 NKT 세포를 활용 할 수있는 가능성이 크게 α-Galactosylceramide (α-GalCer)과 크린 시토 킨 8 다양한 인간의 NKT 세포를 자극하고 확장 할 수있는 능력 증가했다. 중요한 것은, 이러한 세포는 원래 phenotyp을 유지E, 분비의 크린 시토 킨, 그리고 종양 세포 라인에 대한 표시 세포 독성 기능입니다. 따라서, 예 생체 확장 NKT 세포는 기능 유지와 입양 immunotherapy에 사용할 수 있습니다. 그러나, NKT 세포 기반 immunotherapy는 autologous 항원 제시 세포의 사용에 의해 제한되어 이러한 stimulator 세포의 수량 및 품질이 실질적으로 다를 수 있습니다. 암 환자의 단핵 세포 - 파생 DC는 costimulatory 분자의 감소 수준을 표현하고 9,10 이하 염증성 크린 시토 킨을 생산하는 것으로보고되었습니다. 사실, 오히려 autologous APC보다 손쥐 DC는 CML 환자 11 일부터 NKT 세포의 기능을 테스트하는 데 사용되었습니다. NKT 세포는 손쥐 DC에 의해 확장하고 입양 immunotherapy 사용할 수 없습니다 수 있기 때문에 그러나,이 시스템은 체외 테스트에 사용할 수 있습니다. 따라서, 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 의존 표준화 된 시스템은여 또는 xenogeneic CE의 함정없이 DC의 자극 효과를 생산할 수재편 12, 13. 여기, 우리는 CD1d 기반 aAPC을 생성하는 방법을 설명합니다. CD1d-IG 단지는 신뢰할 수있는 방법 격리 활성화하고, 이펙터 NKT 세포 인구를 확장 할 수를 제공합니다 CD1d-항원 단지로 T 세포 수용체 (TCR)의 참여는 NKT 세포의 활성화, 항원의 기본 요구 사항 때문입니다.

여기에 우리는 NKT 세포 (그림 1)의 전파를위한 표준화 된 방법으로 NKT 세포를 자극하는 자기 구슬로 CD1d-IG 및 안티 CD28적인 mAb의 공유 결합 커플 링에 의한 CD1d-IG 기반 aAPC를 생성하는 방법을 설명합니다. 첫째, 하나는 CD1d-IG 융합 단백질이 안정적으로 자기 구슬의 표면에 고정되어 있는지 입증해야합니다. 그림 2A, CD1d-IG 및 안티 CD28에 표시된 항체는 자기 구슬의 표면에 표현 된 두. aAPC의 stimulatory 용량을 조사하기 위해, aAPC 밤, 수확 문화 supernatants와 엘리사에 의해 측정 IL-2 생산과 우리가 공동 교양 NKT 세포 hybridomas. 우리는 CD1d-IG 기반 aAPC는 (그림 3, 데이터가 표시되지 않음)와 같거나 자신의 휴대 전화 대응보다 높은 수준에서 NKT 세포 hybridomas을 자극 할 수 사실을 발견했습니다. 흥미롭게도, 우리는 마우스 NKT 세포 hybridomas은 인간 CD1d 기반 aAPC (FI에 의해 자극 것을 발견aAPC의 각 배치 테스트를위한 간단한 방법을 제공합니다 gure 2B). 다음, 우리는 aAPC의 전파 가능성을 보여 모색, 따라서 인간의 T 세포는 말초 혈액에서 분리되었습니다. 먼저 CD161 + 3 번 CD + T 세포 비율은 자기 비드 분리하여 풍부하게되었다. 그런 다음, T 세포는 α-GalCer -로드 aAPC과 함께 격주 자극했다. 중요한 것은, 우리는 상대적으로 낮은 초기 NKT 세포 인구 (0.03 %)로, 우리는 ~ 67% Vα24 + Vβ11 + (그림 3)에 셀을 확장 할 수 사실을 발견했습니다. 우리는 건강한 자원 봉사자와 암 환자의 PBMC에서 NKT 세포를 확대하고 α-GalCer로드 aAPC가 모두 그룹에서 NKT 세포 인구를 확장 할 수있었습니다 것으로 나타났습니다. 특히, 확장 속도는 매우 기증자가 의존했다. 예상 Vα24 + 세포의 높은 초기 인구, 확장의 큰 비율입니다. 또한,2,000,000 셀의 시작 인구를 사용하는 경우 CD161 + 3 번 CD + T 세포는 하나가 확장의 두 발 (표 1) 후&gt; 10 7 세포를 얻을 수 있습니다. 확장 된 NKT 세포의 약 80~90%는 +, ~ 5% CD8는 +, 나머지는 아마 CD4 - CD8 더블 부정적인 NKT 세포 아르 CD4 있습니다. 그림 4A-C와 같이 이러한 확장 된 NKT 세포는 기능 연구에 사용할 수 있습니다. 우리는 우리의 전 생체는 NKT 세포는 α-GalCer의 자극에 반응 유지하고 IL-17A, TNF-α와 IFN-γ의 강력한 PD가 확대 것으로 나타났습니다. 그것은 초기 T 세포 농축 인구가 낮은 한 두 번째 CD161 농축 단계를 수행 할 수없는 경우 aAPC로 인한 확장이 예상 결과를 (그림 4D, 기부자 1 참조) 포기하지 않을 수 있다는 것을 알아야한다. 순환 NKT 세포의 비율이 0.1 %보다 높은 경우에는, 하나는 여전히 상당한 확장을 얻을 수 있어야합니다내가 NKT 세포. 이하,이 데이터는 CD1d 기반 aAPC이 효과적으로 확장하고 기본 인간의 NKT 세포를 자극하는 데 사용할 수있는 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> 1 그림. CD1d의 개략도 : IG 기반 aAPCs CD1d 분자의 세포 부분은 짧은 아미노산 링커로 구분하여 면역 글로불린 중쇄 단백질의 일정한 영역에 융합되어 있습니다. 이 분자는 쉽게 간단 관심 지질의 과잉으로 그들을 잠복기에 의해, 이러한 α-GalCer와 같은 지질 항원과로드 할 수 있습니다. aAPC는 자기 구슬로 CD1d-IG 및 안티 CD 배에 힘을 결합하여 만들어졌다. 이 시스템에서 CD1d-IG는적인 mAb는 costimulatory 신호를 제공하는 TCR 및 안티 CD28을 통해 같은 종류의 항원에 특정한 신호를 제공하는 데 사용됩니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="4.25in" fO : SRC = SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot;/ &quot;를 / files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot;&gt; 그림 2. . IgG 이량 체 (PE-복합 안티 - 마우스 IgG1과 착색을 통해)뿐만 아니라 안티 CD28 항체 (FITC-복합 항 마우스 IgG2a를 사용하여) : aAPCs에 표면 단백질의 FACS의 착색 A) aAPCs은 CD1d의 존재에 대해 테스트되었습니다 . 오픈 histograms는 isotype 제어를 나타냅니다, 채워진 histograms에 표시된 항체를 나타냅니다. CD1d-IG 표현 aAPC는 NKT 세포가 IL-2 생산을 자극 할 수 있습니다. B) Vα14 + 마우스 NKT 세포 하이 브리 도마, DN32.D3은 어느 매체, 가용성 항원 (α-GalCer), aAPC 또는 α-GalCer -로드 aAPC 하역과 cocultured되었습니다. 문화 supernatants는 수확 된 표준 샌드위치 엘리사는 IL-2 생산을 측정하기 위해 사용되었다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> 그림 3. CD1d-IG 코팅 인공 항원 제시 세포에 의한 NKT 세포의 확장. (A) 기본 3 번 CD + CD161 + 더블 긍정적 인 세포가 자기 분리를 사용하여 PBMCs으로부터 격리되었다. 정렬 세포는 α-GalCer로드, 14 일 동안 CD1d-IG 코팅 aAPC을 자극했다. 세포는 Vα24와 Vβ11 다음 aAPC 자극에 얼룩이했다. (B) 기본 인간의 NKT 세포는 B 세포 림프종 라인의 용해를 중재. 항원의 유무, 20-24 시간에 96도 U-바닥 판에-GalCer (100 NG / ML)에 지정된 비율에서 NKT 세포와 incubated C1R - CD1d 세포. NKT 세포 매개 세포 용해가 표준 51Cr 릴리스 분석에 의해에 의해 평가되었다. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> 4 그림. aAPC 확장 된 NKT 세포의 시토 킨 프로파일. </strong&gt; 두 주 동안 α GalCer로드 aAPC, 확장 된 NKT 세포 (1 × 10 5 / 잘)이 용해 α-GalCer, PMA / Ionomycin, anti-CD3/28 microbeads, 또는 α-GalCer로드 aAPC과 cocultured 했나요 자극 후 (2 × 10 5도 /) 48 시간 용. (A) IL-17A, (B) TNF-α, 그리고 (C) IFN-γ 생산 표준 시토 킨 엘리사에 의해 측정되었다. 데이터가 표시 부정적인 컨트롤 (미디어 및 빈 구슬) 차감 후 순 시토 킨 생산합니다. (D) 기본 T 세포는 PBMC는 자기 구슬 분리를 사용하여 분리되었습니다. 정렬 셀 - GalCer로드 - aAPC 표시와 함께 두 주 동안 자극했다. 세포가 Vα24에 대한 특정 애비를 사용하여 얼룩 져 있었다 +와 Vβ11 + 및 유동 세포 계측법에 의해 분석했다.

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Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

여기 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 사용하여 대량 T 세포 인구에서 인간의 NKT 세포를 활성화하고 확장하는 방법을 설명합니다. CD1d 기반 aAPC의 사용은 기능 NKT 세포의 높은 숫자를 생성하기위한 표준화 된 방법을 제공한다.

인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

17.9K 조회수.  University of Maryland. 여기 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 사용하여 대량 T 세포 인구에서 인간의 NKT 세포를 활성화하고 확장하는 방법을 설명합니다. CD1d 기반 aAPC의 사용은 기능 NKT 세포의 높은 숫자를 생성하기위한 표준화 된 방법을 제공한다.

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Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

준비 및 사용 HIV - 1 차 감염된 CD4 + 대상 세포로 T 세포 자연 킬러 세포 세포 독성 Assays에서

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

연구

면역학 및 감염병학

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

효율에 대한 HLA - IG 기반 인공 항원 제시 세포 예 생체내</em인간 CTL의> 확장

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC)<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

항원 중심의 성 대장염 모델의 개발은 항원이 T 세포에 세포를 제시하여 항원의 프리젠 테이션을 공부하기

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.