وأيد هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبية وماري كوري الدولية مخطط المنح إعادة الإدماج (لJKV).

1. اختيار النسخ التعبير [كدنا] <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتقدم مكتبة [كدنا] واستنساخ البكتيرية واحد في مخزونات الجلسرين في شكل 96-أيضا. باستخدام الأمر Rearray في القائمة المنتقى من CP7200 Norgen، واختيار الحيوانات المستنسخة من لوحة البكتيرية المصدر وتطعيم 1.5 مل في LB / AMP في deepwell-96 (1 مل أيضا) لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحات deepwell مع ختم الغاز نفاذية واحتضان بين عشية وضحاها في C ° 37 في شاكر. </li></ol> 2. إعداد مكتبة التعبير [كدنا] <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لوحات deepwell تحتوي على البكتيريا في 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة باستخدام محولات لوحة أجهزة الطرد المركزي في جدول القمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الاعلام من الآبار، وترك بيليه البكتيرية سليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكوين سطح مختبر أتمتة محطة العمل كما هو مبين في الشكل 2. يتم توزيع حلول لإعداد البلازميد في أحواض 1-5 ويتم وضع لوحة deepwell على سطح السفينة. A الحوض الصغير multiwell مع الحل شطفيتم وضع لوحة بجوار deepwell. يتم تحميل نصائح في رفوف الإكراميات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع متعددة فراغ. يتم وضع لوحة بلازميد متعددة داخل ملزمة ويتم وضع لوحة البلازميد مرشح على رأس متعددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الكريات مع 250 ميكرولتر الحل 1 (العازلة إعادة تعليق) بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز على البكتيريا عن طريق إضافة محلول من 250 ميكرولتر 2 (العازلة يزيس). وختم وحة ومقلوب للسماح كاملة الاختلاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ستارت 2 توقيت دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 350 ميكرولتر الحل 3 (العازلة الإبطال). ختم لوحة وعكس 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لست] البكتيرية لوحات تصفية البلازميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق فراغ لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة تصفية ووضع لوحة ملزم على رأس متعددة. تطبيق فراغ لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من غسل إضافية (AW) العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق فراغ لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 900 ميكرولتر من محلول منظم غسيل 4. تطبيق فراغ لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر قTEP 2.14. تطبيق فراغ ل15 دقيقة إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة DNA داخل مجموعة متعددة. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة شطف لوحة ملزمة واحتضان لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فراغ لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة جمع وقياس تركيز الحمض النووي باستخدام Nanodrop 8000. وعادة ما يمكن أن محصول ~ 100 نانوغرام / ميكرولتر من المتوقع مع هذا الأسلوب. </li></ol> 3. خلية البذر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وtrypsinized HEK293 الخلايا وفرزها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والاستغناء عن 2 × 10 4 خلايا في كل بئر من Viewplate PerkinElmer باستخدام ThermoFisher 96-multidrop جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحضين الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li></ol> 4. ترنسفكأيشن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج من 100 GFP-DNA البلازميد Grb2 نانوغرام مع 100 نانوغرام من [كدنا] في 25 المتوسطة المصل خالية ميكرولتر لكل بئر في أسفل الجولة 96-وحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 ميكرولتر مصل خالية سائل الإعلام التي تحتوي على 0،5 ميكرولتر لكل بئر Transfectin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط وبدء الموقت FOص 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 50 ميكرولتر من [كدنا] / Transfectin مزيج إلى الخلايا باستخدام طريقة صرفها لطيف. وبدلا من ذلك، يمكن الاستغناء عن مزيج ترنسفكأيشن لأول مرة في لوحات خلايا ثم أضاف على رأس (ترنسفكأيشن العكسي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li></ol> 5. الصورة اكتساب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء أوبرا البرمجيات. ويرد لقطة شاشة الإعداد التجربة في الشكل 3. حدد &quot;تكوين&quot; علامة التبويب وحدد الهدف 20X ونوع لوحة الصحيح. ضمان &quot;طوق&quot; تم تعيين إلى القيمة الصحيحة على هدف للسماح للتركيز مع أنواع مختلفة وحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;ميكروسكوب&quot; علامة التبويب. تحديد التعرض (1)، FITC (488 ليزر) والتعرض للأشعة فوق البنفسجية (2)، (365 ليزر). تفعيل فلتر الأشعة فوق البنفسجية على كل من التعرض وتعيين التعرض 1 إلى كاميرا 1 و 2 إلى التعرض كاميرا 2. تعيين أوقات التعرض إلى 800 ميللي ثانية للتعرض 1 و 40 ميللي ثانية للتعرض 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;ميكروسكوب&quot; علامة التبويب. تعريف هxposure (1)، FITC (488 ليزر) والتعرض للأشعة فوق البنفسجية (2)، (365 ليزر). تفعيل فلتر الأشعة فوق البنفسجية على كل من التعرض وتعيين التعرض 1 إلى كاميرا 1 و 2 إلى التعرض كاميرا 2. تعيين أوقات التعرض إلى 800 ميللي ثانية للتعرض 1 و 40 ميللي ثانية للتعرض 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد التعرض 1. تعيين التركيز إلى 0 ارتفاع ميكرون. حدد &quot;التركيز&quot;. ركز مرة واحدة، تعرض الكاميرا 1. ضبط ارتفاع التركيز لتحسين الطائرة التعرض وانقر على &quot;ارتفاع اتخاذ&quot;. تغيير أوقات التعرض وقوة الليزر لإعطاء كثافة بكسل الحد الأقصى ل~ 3،000. حفظ المعلمات التعرض. تكرار التعرض ل2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;التجربة تعريف&quot; علامة التبويب. إنشاء تخطيط وsublayout. سحب وإسقاط ذات الصلة تخطيط، والتعرض الصورة المرجعية،، ملف skewcrop وsublayout. حفظ التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;تلقائي التجربة&quot; علامة التبويب والحصول على صور. </li></ol> 6. تحليل الصور (استنادا إلى الإصدار 1.46h يماغيج.) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الملكية PerkinElmer. الملفات المرن لمقاسات الصورة ذات الكلمات الدلالية ملف TIF. باستخدامFlex2Volocity Acapella النصي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استيراد الصور في تسلسل كما يماغيج الصورة، مما أدى إلى المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل المكدس في hyperstack القناة 2 عن طريق اختيار صورة / Hyperstack / كومة إلى عنصر القائمة Hyperstack. يجب تعيين عدد من شرائح لنصف كومة المستوردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار قناة GFP باستخدام صورة الأمر / مكرر: وضع علامة في خانة الاختيار hyperstack مكررة وتحديد القنوات: 1-1. استخدام الآخرة المكدس المكررة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد عملية تحسين / التباين مع بكسل المشبعة 0.01٪، وذلك باستخدام الرسم البياني كومة وتحويل إلى 8 بت مع Image/Type/8-bit. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد دائرة نصف قطرها 15 بكسل تجزئة التكيف المحلي باستخدام خوارزمية Bernsen مع عتبة النقيض (معلمة 1) س = 30. وضع علامة في خانة الاختيار كائنات الابيض يوم خلفية سوداء في القائمة صورة / ضبط / سيارات عتبة المحلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجزئة مراقبة الجودة: توليد مجزأة تراكب كفاف الكائن على الصور الأصلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Featuإعادة استخراج جزيئات من خلال تحليل: منطقة القياس، يعني وكثافة الإجمالية لكل عضية. حفظ الملفات النتيجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الملف في ذلك ميزات R وإنشاء المدرج التكراري. </li></ol> 7. ممثل النتائج في ظل الظروف العادية يتم ترجمة Grb2 في جميع أنحاء الخلية بأكملها. على التحفيز لمستقبلات عوامل النمو من translocates إلى غشاء البلازما والمنضوية في وقت لاحق في الإندوسومات كما هو موضح في الشكل 4. التعبير عن مستقبلات سطح خلية قادرة على Grb2 ملزمة كافية لإحداث هذا النبات. في تجربة نموذجية الفرز، ويلاحظ أي تغيير في GFP-Grb2 الترجمة. ومع ذلك، عندما يتم التعبير عن البروتين الذي المجندين Grb2 إلى موقع الفرعي الخلوية، هناك تغيير في الترجمة التي يمكن تصور بسهولة عن طريق الفحص المجهري مضان. للتعبير، مثلا من نتائج EGFR في إعادة المركزية من GFP-Grb2 لدخلول؛ جسيم داخلي مثل الهياكل (الشكل4). وهكذا، عند تطبيق مكتبة الجينوم على نطاق، يمكن توقع أن الرواية يمكن تحديد سطح الخلية Grb2 ملزم البروتينات. لا يقتصر هذا الأسلوب لاكتشاف البروتينات سطح الخلية. على سبيل المثال، يؤدي الى تغيير Dynamin2 في شبه الخلوية توطين GFP-Grb2 عرض دخلول؛ جسيم داخلي مثل التوظيف (الشكل 5). Dynamin2 يربط إلى المجال SH3 C-محطة من Grb2 وتشارك في هذا الإلتقام 9،10 المعقدة. وبالتالي، فإن هذا النهج يتيح تحديد مجمعات البروتين عامة ملزمة وعلى سبيل المثال لا تحديد الشركاء التفاعل للمجال SH2. ويمكن توقع عدة أنواع مختلفة من النبات مثل الترجمة إلى غشاء البلازما، لالإندوسومات، غيرها من الهياكل حويصلي أو حشوية إلى النواة. ولذلك، فمن المستحسن أن يتم تفتيشها أيضا جميع الصور عن طريق العين. ومع ذلك، عندما فحص مجموعات كبيرة من cDNAs الآليالصورة خوارزمية التحليل هو أكثر عملية. في هذه الحالة، وهو مزيج من خوارزميات أمر مرغوب فيه، مثل الكشف عن المكان لتحديد الإندوسومات، السيتوبلازم / نواة الكشف لتحديد خوارزميات المورفولوجية النووية مكوكية وعامة لتحديد شكل التغييرات الخلوية. وقد سبق بيان استخدام طرق الكشف هذه المظهرية مختلفة بمزيد من التفصيل في مكان آخر 11. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" /> الشكل 1. الخطة الشاملة للتجربة. تفاصيل التجربة كاملة سير العمل الفرز الفائق المحتوى بدءا من التضخيم وإعداد مكتبة [كدنا]، [كدنا] ترنسفكأيشن من ناقلات بالإضافة إلى بنيات مراسل، الحصول على الصور وتحليل الصور باستخدام برامج مجانية مفتوحة يماغيج. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" /> Figure 2. تكوين من سطح السفينة TECAN. (1) على الجانب الأيسر، وخمسة أحواض 100 مل يلزم سدها مع مخازن 1 (40 مل)، 2 (40 مل)، 3 (50 مل)، AW (60 مل) وA4 (100 مل). سوف A4 الحوض الصغير بحاجة إلى إعادة ملء مرة أثناء العملية. (2) يقع على موقف فراغ مشعب 14 في هذا المثال. (3) يقع وحة deepwell مع حبيبات البكتيرية على موقف 30، بجوار حوض شطف العازلة مع 25 مل العازلة شطف. (4) نصائح القابل للتصرف لرئيس القناة 8-يلزم تحميله في رفوف تلميح على الجانب الأيسر ونصائح لرئيس الأقنية يلزم سدها على الموقف 40. وقد تم تجهيز السائل FreedomEvo TECAN معالج يستخدم في هذه التجربة مع 500 ميكرولتر الحقن. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" /> الرقم3. أتمتة الحصول على الصور على LX أوبرا. A) حدد علامة التبويب تكوين (1). تفعيل خطوط ليزر اللازمة لتجربة (2). حدد الكاميرات لالتقاط صور (3). حدد نوع العدسة والهدف وحة للتجربة (4). B) حدد علامة التبويب المجهر (1). تحديد مصدر الضوء وزمن التعرض للتعرض 1 (2،3). التركيز على واحد جيد واتخاذ ارتفاع (4). C) حدد علامة التبويب تعريف التجربة (1). سحب وإسقاط التعرض، skewcrop، والإشارة، وتخطيط الملفات sublayout (2). سحب وإسقاط ملف التجربة (3). D) الاختيار التلقائي التجربة (1). سحب وإسقاط ملف التجربة (2). تخصيص الباركود المناسب (3). بدء الحصول على الصور من خلال النقر على زر البداية (4). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" /> <stroنانوغرام&gt; الشكل 4. GFP-Grb2 إزفاء من التعبير [كدنا]. GFP-Grb2 ينتقل من التعريب وحشوية السائد لدخلول؛ جسيم داخلي مثل الهياكل على overexpression من مستقبلات عامل النمو عبر الغشاء وinternalizes لاحقا إلى الإندوسومات. على اليسار، وتظهر الصور المجهري للخلايا التي تم M6 COS عابر مع GFP-Grb2 (أعلى) أو GFP-Grb2 بالإضافة إلى EGFR (أسفل). شارك في التعبير عن النتائج EGFR في نقل GFP-Grb2 لدخلول؛ جسيم داخلي مثل الهياكل. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" /> الشكل 5. مثال [كدنا] الناجم عن إزفاء من GFP-Grb2. وDynamin2 GTPase، التي تشارك في Grb2 بوساطة الإلتقام، يعيد GFP-Grb2 لدخلول؛ جسيم داخلي مثل الهياكل (دائري). في هذه التجربة، وGFP-Grb2 شارك في transfected مع DNM2 إلى خلايا HEK293T. كانت ملطخة الخلايا مع هويشت 33342 تم الحصول عليها بعد 24 ساعة والصور على مكتب مستشار رئيس الوزراءرا LX. يتم عرض؛ حقل واحد من عرض من قناة (GFP) والأشعة فوق البنفسجية والخضراء (هويشت 33342 الأزرق).

<ol>
	<li>Sastry, L., Cao, T., King, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Grb2-protein+complexes+in+human+cancer+cells.">Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).</li><li>Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+Grb2+by+Bcr/Abl+and+epidermal+growth+factor+receptor:+a+novel+regulatory+mechanism+for+tyrosine+kinase+signaling.">Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling.</a> Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).</li><li>Bisson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+reveals+the+dynamics+of+signaling+through+the+GRB2+adaptor.">Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor.</a> Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).</li><li>Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Feynman+trajectories:+determining+the+path+of+a+protein+using+fixed-endpoint+assays.">The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).</li><li>Yamazaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Grb2+in+EGF-stimulated+EGFR+internalization.">Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization.</a> J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).</li><li>Antczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain-Based+Biosensor+Assay+to+Screen+for+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+Modulators.">Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators.</a> in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).</li><li>Su, J., Batzer, A., Sap, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+phosphatase+R-PTP-alpha+is+tyrosine-phosphorylated+and+associated+with+the+adaptor+protein+Grb2.">Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2.</a> J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).</li><li>Hertog, J. d. e. n., Tracy, S., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+receptor+protein-tyrosine+phosphatase+alpha+on+Tyr789,+a+binding+site+for+the+SH3-SH2-SH3+adaptor+protein+GRB-2+in+vivo.">Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo.</a> Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).</li><li>Miki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Ash/Grb-2+with+dynamin+through+the+Src+homology+3+domain.">Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain.</a> J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).</li><li>Seedorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+binds+to+SH3+domains+of+phospholipase+C+gamma+and+GRB-2.">Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2.</a> J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).</li><li>Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+expression+cloning.">Developments in expression cloning.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الاستنساخ التعبير هو أداة قوية التي استخدمت في الماضي لتحديد المكونات الخلوية رواية مثل مستقبلات مستضدات الفيروسات وخلايا الدم 12. هنا، نحن تصف طريقة لتسهيل التعرف على الرواية المفترضة مستقبلات نقل الإشارة التي تربط لGrb2. هناك بضع خطوات حاسمة في البروتوكول. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد البلازميد الآلي فإنه من الضروري للغاية أن يكون إعادة تعليق بيليه كاملة من البكتيريا. في بعض الأحيان، فمن الضروري أن تدرج خطوة صارمة أو تهز مزيد من خلط مع ماصات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى حل 2 و 3، واستكمال خلط أمر ضروري، ونحن قد وجدت أن قلب يدويا لوحة مختومة هو أكثر كفاءة من استخدام وسيلة شاكر الآلي. وينبغي تجنب Pipetting في هذه الخطوة لأنه يؤدي إلى قص من الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في جميع الخطوات فراغ، على المرء أن تأكد من أن يتم تصريف السائل تمامامن لوحة. العائدات المنخفضة على خلاف ذلك وينتظر أن تتم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على شطف، فمن الشائع جدا أن يسقط شطافة شكل في الجزء السفلي من لوحة الربط البلازميد. هذه القطرات تحتاج إلى جمعها في لوحة شطف، لذلك فمن المستحسن أن يتم رفع لوحة البلازميد ملزم بعناية ويتم نقل أي بعناية قطرات متبقية في أسفل لوحة شطافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال ترنسفكأيشن، وقت تشكيل المعقدة أمر بالغ الأهمية. نتمسك عادة إلى 20-30 دقيقة. أوقات أطول تصل إلى 1 ساعة على ما يرام دون انخفاض في العائد، في حين لا ينصح أقصر الأوقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالمجهري، واختيار التكبير هو المهم. على النظام LX أوبرا المستخدمة هنا، القرار في 20X كافية للحصول على صور عالية الجودة. إذا كانت هناك حاجة الصور دقة أعلى، يمكن تغيير الهدف، ولكن من أجل الحصول على أرقام ذات دلالة إحصائية من الخلايا، هناك حاجة لعدد أكبر من المجالات واكتساب أضعاف. بشكل عام، ونحن نهدفللحصول على ما لا يقل عن 100 خلية لكل بئر تصويرها. </li></ol> وقد استخدم الفحص إزفاء Grb2 من قبل مجموعات أخرى لتحديد جزيء صغير مثبطات كيناز تفعيل EGFR 6. في هذه الحالة، يتم تنشيط EGFR على وجه التحديد مع يجند تسبب تجنيد Grb2 إلى غشاء البلازما. ويمكن بعد ذلك تعطيل هذا التفاعل يتم التحقيق باستخدام مركبات جزيء صغير. وبالمثل، فإنه يمكن تصور أن يمكن استخدام شاشات سيرنا الذاتية لتحديد الجينات المشاركة في EGFR-Grb2 إشارات أو غيرها من عامل النمو Grb2 ملزم المستقبلات مثل C-KIT أو مستقبلات إرثروبويتين. وبالتالي، هناك العديد من التطبيقات المحتملة لهذه التقنية. ويمكن تطبيق نهج مماثل لأنظمة مراسل GFP الموسومة لجزيئات أخرى مثل محول حالات العسر الشديد، أو جاب IRS. واحد الميزة الرئيسية لاستخدام هذا الفحص خلية القاعدة في خلايا الثدييات هو أنه يمكن تحديد الرطوبة من الناحية الفسيولوجيةالتفاعلات evant. الفحص هو قراءات لتشكيل البروتين معقدة، ولكن الأهم من ذلك، يتم رصد التفاعلات ذات الصلة في موقع شبه الخلوية الصحيح. وفي هذا الصدد، يتغلب على هذه التقنية الفنية من غيرها من وسائل التفاعل البروتين البروتين مثل الخميرة الهجين اثنين أو في المقايسات المختبر. وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن التفاعلات غير مباشرة قد يؤدي أيضا إلى تجنيد Grb2. وبالمثل، قد يكون ذلك حافزا ليصل النسخي تنظيم الشركاء ملزمة التعبير [كدنا]. للتمييز بين هذه الاحتمالات، فمن الضروري لتنفيذ المقايسات المناسبة الثانوي للتمييز بين الآثار المباشرة وغير المباشرة ملزمة. في الختام، إزفاء جزيء GFP-محول فحص وعود قدرة عالية على فحص الجينوم على نطاق والتطبيقات اكتشاف المخدرات.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> [كدنا] مكتبة </td><td> أوريجنس </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LB + أمبير </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> الغاز نفاذية الأختام </td><td> ThermoScientific </td><td> AB-0718 </td><td></td></tr><tr><td> Nucleospin 96 طقم البلازميد </td><td> Macherey-ناجل </td><td> 740625،4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad </td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> الجزيئية مجسات </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 واو TC </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td> هدسون </td><td></td><td> Norgren CP7200 </td></tr><tr><td> حرية ايفو </td><td> TECAN </td><td></td><td> مع فراغ مشعب </td></tr><tr><td> Multidrop 384 </td><td> الحرارية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> أوبرا LX </td><td> PerkinElmer </td><td></td><td></td></tr></table>

a high-content imaging workflow to study grb2 signaling complexes by expression cloning

نقل الإشارة من قبل مستقبلات عامل النمو أمر ضروري لخلايا للحفاظ على الانتشار والتمايز ويتطلب رقابة مشددة. يبدأ نقل الإشارة من قبل ملزم ليجند الخارجية إلى مستقبلات عبر الغشاء وتفعيل أجهزة الطرد المركزي يشير المصب. A المنظم الرئيسي للإشارة مولد للتفتل هو Grb2، وهو بروتين وحدات تتألف من المجال الداخلي (SRC التماثل 2) SH2 يحيط بها اثنان SH3 المجالات التي تفتقر النشاط الأنزيمي. ويرتبط جوهري Grb2 مع الابن GTPase-OF-Sevenless (SOS) عبر المجال الخاص به SH3 N-الطرفية. المجال SH2 من Grb2 يربط لمستقبلات عامل النمو في بقايا التيروزين فسفرته اقتران بالتالي تنشيط مستقبلات لسلسلة SOS-MAP-رأس إشارات كيناز. وبالإضافة إلى ذلك، وقد وصفت الأدوار الأخرى للGrb2 كمنظم الإيجابية أو السلبية لمستقبلات الإشارات والإلتقام. تكوين وحدات من Grb2 يشير إلى أنه يمكن إرساء لمجموعة متنوعة من المستقبلات وtransducه يشير إلى جانب عدد وافر من مسارات مختلفة 1-3. الموصوفة هنا هو الفحص المجهري بسيطة التي تراقب تجنيد Grb2 إلى غشاء البلازما. أنها مقتبسة من الفحص الذي يقيس التغيرات في شبه الخلوية توطين الفلورية الخضراء البروتين (GFP)-الموسومة Grb2 ردا على التحفيز 4-6. مستقبلات غشاء البلازما التي تربط Grb2 مثل تنشيط البشرة مستقبلات عوامل النمو (EGFR) تجنيد GFP-Grb2 إلى غشاء البلازما على التعبير [كدنا] والانتقال بعد ذلك إلى حجرات endosomal في الخلية. من أجل تحديد البروتين في الجسم الحي من المجمعات Grb2، يمكن استخدام هذه التقنية لإجراء الجينوم على نطاق عالية محتوى الشاشة يعتمد على التغيرات في توطين الفرعي الخلوية Grb2. موصوفة إعداد استنساخ [كدنا] التعبير، والحصول على الصور ترنسفكأيشن بالتفصيل أدناه. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى المستخدمة لالجينومية تحديد الشركاء التفاعل البروتين، مثل الخميرة HY اثنينbrid، وهذا الأسلوب يسمح التصور من مجمعات البروتين في خلايا الثدييات في الموقع الفرعي الخلوية من التفاعل من قبل الفحص المجهري على أساس بسيط. يمكن بالتالي يتم تقييم كل من الميزات النوعية، مثل أنماط الترجمة، فضلا عن قوة الكمي للتفاعل.

Watch this Scientific Journal Video about A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning at JoVE.com

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

يوصف أسلوب الفرز الفائق المحتوى لتحديد مستقبلات عبر الغشاء الرواية يشير المختصة. هذا الأسلوب هو قابل للتشغيل الآلي على نطاق واسع ويسمح التنبؤات حول<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; ملزمة البروتين وتوطين الفرعي الخلوية مجمعات البروتين في خلايا الثدييات.

سير عمل التصوير عالي المحتوى لدراسة Grb2 مجمعات اشارة عن طريق الاستنساخ التعبير

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

a-high-content-imaging-workflow-to-study-grb2-signaling-complexes

Research

JoVE Journal

Biology

10.5K Views.  University College London. يوصف أسلوب الفرز الفائق المحتوى لتحديد مستقبلات عبر الغشاء الرواية يشير المختصة. هذا الأسلوب هو قابل للتشغيل الآلي على نطاق واسع ويسمح التنبؤات حول في الجسم الحي ملزمة البروتين وتوطين الفرعي الخلوية مجمعات البروتين في خلايا الثدييات.

Video: A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

مرحبا - C : طريقة لدراسة الهندسة المعمارية ثلاثي الأبعاد للخريطة جينوم.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة</emالعضلات الكبار>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

في تحليل المختبر من PDZ التي تعتمد على المجمعات ضخم الجزيئات CFTR اشارة

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

قياس معدل الأيض في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; باستخدام قياس التنفس

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

سير العمل عالية المحتوى، الكمي خلية فردية من نيون علامات من المجاهر البيانات العالمي، بدعم من برمجيات المصدر المفتوح

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

التصوير إعادة التنظيم المكاني لMAPK اشارة المسار باستخدام نظام التعبير عابر التبغ

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...