이 작품은 의학 연구위원회와 마리 퀴리 국제 재 통합 기금 제도 (JKV까지)에 의해 지원되었다.

1. cDNA 표현 클론를 선택 <ol><li> cDNA 라이브러리는 96 - 웰 형식으로 글리세롤 주식의 단일 박테리아 클론으로 제공됩니다. Norgen CP7200의 선택기 메뉴에서 Rearray 명령을 사용하여 96 deepwell (1 ML 잘) 판의 1.5 ML의 LB / A로 소스 플레이트와 예방에서 박테리아 클론을 선택합니다. </li><li> 가스 투과성의 밀폐와 deepwell 판을 봉쇄하고 흔드는에서 37 ° C에서 하루 아침에 품다. </li></ol> 2. cDNA 표현 도서관의 작성 <ol><li> 테이블 탑 원심 분리기에 판 어댑터를 사용 20 분에 2,000 rpm으로 박테리아를 포함하는 deepwell 판을 봐. </li><li> 박테리아 펠렛은 그대로두고, 우물에서 미디어를 대기음. </li><li> 그림 2와 같이 실험실 자동화 워크 스테이션의 데크를 구성합니다. 플라스미드 준비 솔루션은 골짜기 1-5로 배포되고 deepwell 판은 갑판에 배치됩니다. 용출 솔루션 multiwell 트로프deepwell 판에 인접 배치됩니다. 팁은 팁 랙에로드됩니다. </li><li> 진공 매니 폴드를 조립. 플라스미드 바인딩 플레이트는 매니 폴드 내부에 배치되어 있으며 플라스미드 필터 플레이트는 매니 폴드의 상단에 위치합니다. </li><li> 아래로 pipetting과에 250 μl 솔루션 1 (Resuspension 버퍼)로 알약을 Resuspend. </li><li> 250 μl 솔루션 2 (용해 버퍼)의 추가에 의해 박테리아를 Lyse. 플레이트는 봉인하고 완전한는 혼합 수 있도록 거꾸로되어 있습니다. </li><li> 2 분 타이머를 시작합니다. </li><li> 350 μl 솔루션 3 (Neutralisation 버퍼)를 추가합니다. 판을 봉쇄와 3 번 반전. </li><li> 플라스미드 필터 플레이트에 세균 lysates을 전송합니다. </li><li> 5 분에 진공을 적용합니다. </li><li> 필터 플레이트를 제거하고 매니 폴드 상단에 구속력 판을 놓습니다. 1 분에 진공을 적용합니다. </li><li> 추가 세척 (AW) 버퍼 500 μl를 추가합니다. </li><li> 2 분에 진공을 적용합니다. </li><li> 세탁 버퍼 해결 방법 4 900 μl를 추가합니다. 2 분에 진공을 적용합니다. </li><li> 반복의2.14 tep. 추가 15 분에 진공을 적용합니다. </li><li> 매니 폴드 내부의 DNA 수집 판을 놓습니다. 바인딩 플레이트에 용출 버퍼 100 μl를 추가하고 2 분에 품다. </li><li> 10 분에 진공. </li><li> Nanodrop 8000을 사용하여 수집 플레이트 및 측정 DNA 농도를 제거합니다. 일반적으로 ~의 수율은 100 NG / μl이 방법으로 예상 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 셀 심는 <ol><li> HEK293 세포는 trypsinized 및 계산됩니다. </li><li> 2 X 10 4 셀은 ThermoFisher 96 - 웰 multidrop을 사용하여 PerkinElmer의 Viewplate의 각도에 투여합니다. </li><li> 세포는 37 하룻밤 incubated 아르 ° C 5 % CO 2. </li></ol> 4. Transfection <ol><li> 25 μl 혈청이없는 미디어의 당 잘 96 - 웰 플레이트 원형 바닥에 cDNA의 100 NG 100 NG GFP-Grb2 플라스미드 DNA의 믹스를 준비합니다. </li><li> 물론 당 0.5 μl Transfectin를 포함하는 25 μl 혈청이없는 미디어를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 믹스 및 타이머 구경 시작R 30 분. </li><li> 부드러운 분배 방법을 사용하여 셀에 Transfectin / cDNA 믹스의 50 μl를 전송합니다. 또는 transfection 믹스는 접시에 처음 투여 한 후 세포가 상단에 추가 할 수 있습니다 (역 transfection). </li><li> 37 세포가 하루 아침에 길러 ° C 5 % CO 2. </li></ol> 5. 이미지 수집 <ol><li> 오페라 소프트웨어를 시작합니다. 실험 설정의 화면 스냅 샷은 그림 3에 표시됩니다. &quot;구성&quot;탭을 선택하고 20x 객관적이고 정확한 판 유형을 선택합니다. &quot;칼라&quot;를 확인하는 것은 다른 판 유형 초점을 할 수 있도록 목적에 올바른 값으로 설정되어 있습니다. </li><li> &#39;현미경&#39;탭을 선택합니다. 로 FITC (488 레이저) 및 노출 2로 노출 정의 1 UV (365 레이저). 두 노출에 UV 필터를 활성화 및 카메라 1과 카메라 2 노출 2 노출 1 지정할 수 있습니다. 노출 1, 노출이 40 밀리 초 800 밀리 초에 대한 노출 시간을 설정합니다. </li><li> &#39;현미경&#39;탭을 선택합니다. 전자를 정의UV (365 레이저)로 FITC (488 레이저) 및 노출이 같은 xposure 1. 두 노출에 UV 필터를 활성화 및 카메라 1과 카메라 2 노출 2 노출 1 지정할 수 있습니다. 노출 1, 노출이 40 밀리 초 800 밀리 초에 대한 노출 시간을 설정합니다. </li><li> 노출 1을 선택합니다. 높이 0 μm에 초점을 설정합니다. &quot;포커스&quot;를 선택하십시오. 일단 초점을 맞추고, 카메라 1 노출. 노출 비행기를 최적화하고 &quot;촬영 높이&quot;를 클릭하여 초점 높이를 조정합니다. ~ 3,000의 최대 픽셀 강도를 제공 노출 시간 및 레이저 파워를 변경합니다. 노출 매개 변수를 저장합니다. 노출 2 반복합니다. </li><li> &quot;실험 정의 &#39;탭을 선택합니다. 레이아웃 및 sublayout을 만듭니다. 드래그 및 관련 레이아웃, 노출, 참조 이미지, skewcrop 파일과 sublayout을 놓습니다. 실험을 저장합니다. </li><li> &quot;자동 실험 &#39;탭을 선택하고 이미지를 획득. </li></ol> 6. (ImageJ 1.46h 버전을 기반으로합니다.) 이미지 분석 <ol><li> 를 사용하여 독점 PerkinElmer을 변환합니다. 플렉스 파일은 태그가 지정된 이미지 형식으로. TIF 파일Flex2Volocity 그럼 아카펠라 스크립트. </li><li><ol><li> 스택의 결과, 이미지 시퀀스로 ImageJ에서 이미지를 가져옵니다. </li><li> Hyperstack 메뉴 항목에 이미지 / Hyperstack / 스택을 선택하여 2 채널 hyperstack에 스택을 변환합니다. 조각의 수는 수입 스택의 반으로 설정해야합니다. </li><li> 이미지 / 중복 명령을 사용하여 GFP 채널을 중복 : 중복 hyperstack 확인란을 선택합니다 및 채널 지정 : 1-1하십시오. 향후 중복 스택을 사용합니다. </li></ol></li><li> 프로세스를 선택 / 0.01 % 포화 픽셀과 대비를 향상, 스택 히스토그램을 사용하고 Image/Type/8-bit와 8 비트를 변환합니다. </li><li> 반대로 임계 값 (매개 변수 1) Q = 30으로 Bernsen 알고리즘을 사용하여 15 픽셀 반경 현지 적응 세분화를 정의합니다. 이미지 / 조정 / 자동 지역 임계 값 메뉴에서 검정색 배경 확인란에 흰색 개체을 선택합니다. </li><li> 세분화 품질 관리 : 원본 이미지에 분할 객체 윤곽 오버레이를 생성합니다. </li><li> Featu입자를 분석하여 추출 다시 : 측정 지역, 그리고 각 세포 기관의 총 강도. 결과 파일을 저장합니다. </li><li> R의 기능에 결과 파일을 열고 막대 그래프를 생성합니다. </li></ol> 7. 대표 결과 정상 상태에서는 Grb2은 전체 셀에 걸쳐 현지화되어 있습니다. 성장 인자 수용체의 자극하면 그것은 플라즈마 막에 translocates 및도 4에 도시 된 바와 같이 이후 endosomes에 internalized 있습니다. 바인딩 Grb2 할 수있는 세포 표면 수용체의 표현이 translocation을 유발하기에 충분합니다. 전형적인 심사 실험에서 GFP-Grb2 현지화에 변화가 관찰되지 않습니다. 그러나, 단백질이 표현 될 때 하위 휴대 사이트에 모집의 Grb2는 형광 현미경으로 쉽게 시각화 할 수 있습니다 현지화에 변화가 있다는 것을. endosome과 같은 구조로 GFP-Grb2의 relocalization에서 EGFR 결과의 예를 들어, 표현 (그림4). 따라서, 게놈 전체 라이브러리를 적용 할 때, 그것은 소설 Grb2 바인딩 세포 표면 단백질을 식별 할 수있는 예상 할 수 있습니다. 이 방법은 세포 표면 단백질의 검출에 국한되지 않습니다. 예를 들어, Dynamin2는 GFP-Grb2는 endosome과 같은 모집합니다 (그림 5) 표시의 하위 세포의 현지화에 변화를 유도한다. Dynamin2는 Grb2의 C-터미널 SH3 도메인에 바인딩이 복잡한 9,10의 endocytosis에 관한 일을하고있다. 따라서, 이러한 방식은 일반적으로 단백질 바인딩 단지의 식별을 가능하게하고 SH2 도메인에 대한 상호 작용 파트너의 식별에 국한되지 않습니다. translocation 여러 가지 종류가 다른 세포질 기공을 갖는 구조 또는 핵에가 endosomes하는 등 플라즈마 막에 현지화로 예상 할 수 있습니다. 따라서,이 모든 이미지도 눈으로 검사를하는 것이 좋습니다. 그러나, 많은 세트를 검사 할 때하는 것은 자동을 cDNAs이미지 분석 알고리즘이 더 실용적입니다. 이 경우, 알고리즘의 조합은 세포 모양 변경을 식별 할 수 shuttling 핵 및 일반 형태학 알고리즘을 식별 할 수 endosomes, 세포질 / 핵 감지를 식별 할 장소 검색으로 바람직하다. 서로 다른 phenotypic 검출 방법의 사용은 다른 11 개 상세하게 설명되어 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" /> 그림 1. 실험의 전체 구조. 실험 내용 cDNA 라이브러리의 증폭 및 준비, 무료 오픈 소프트웨어 IMAGEJ를 사용하여 cDNA 벡터 플러스 기자 구조, 이미지 수집 및 이미지 분석의 transfection으로 시작하는 완벽한 높은 콘텐츠를 검사 워크 플로우를. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" /> 에프Tecan 덱의 igure 2. 구성. (1) 왼쪽에 다섯 100 ML 골짜기는 버퍼 1 (40 ML), 2 (40 ML), 3 (50 ML), AW (60 ML)와 A4 (100 ML)로 가득해야합니다. 트로프의 A4는 절차를 수행하는 동안 한 번 다시 작성해야합니다. (2) 진공 매니 폴드는이 예에서 위치 14에 위치해 있습니다. (3) 세균 펠릿있는 deepwell 판은 25 ML의 용출 버퍼로 용출 버퍼 트로프 옆에 위치 30에 위치하고 있습니다. (4) 8 채널 머리에 일회용 팁 위치 40 작성해야하는 채널 머리를 왼쪽과 도움말에 팁 랙에로드해야합니다. 이 실험에 사용 된 Tecan FreedomEvo 액체 처리기는 500 μl 주사기가 구비되어 있습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" /> 그림오페라 LX에 이미지 수집 3. 자동화. A) 구성 탭 (1)을 선택합니다. 실험 (2)에 필요한 레이저 라인을 활성화합니다. 이미지 획득 (3)의 카메라를 선택합니다. 실험 (4)의 플레이트 종류와 목적 렌즈를 선택합니다. B) 현미경 탭 (1)을 선택합니다. 광원 및 노출 1 (2,3)에 대한 노출 시간을 정의합니다. 물론 하나를 집중와 높이 (4) 걸릴. C) 실험 정의 탭 (1)을 선택합니다. 드래그 앤 노출, skewcrop, 참조, 레이아웃 및 sublayout 파일 (2) 놓습니다. 드래그하고 실험 파일 (3) 놓습니다. D) 자동 실험 (1)를 선택합니다. 드래그 앤 실험 파일 (2) 놓습니다. 해당 바코드 (3) 할당합니다. 시작 버튼 (4)을 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" /> <strocDNA 표현에 의한 것이다&gt; 그림 4. GFP-Grb2의 translocation. GFP-Grb2의 transmembrane의 성장 인자 수용체의 overexpression시 endosome과 같은 구조에 지배적 인 세포질 현지화에서 relocates과 이후 endosomes에 물질이. 왼쪽에서 COS M6 세포의 현미경 이미지는 transiently GFP-Grb2 (상단) 또는 GFP-Grb2 플러스 EGFR (아래)와 transfected 않은 표시됩니다. endosome과 같은 구조로 GFP-Grb2의 이전에 EGFR 결과의 공동 표현. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" /> 그림 5. GFP-Grb2의 cDNA 유발 translocation의 예. Grb2로 인한 endocytosis에 관여하는 GTPase Dynamin2는 endosome과 같은 구조 (원)에 GFP-Grb2을 relocates. 이 실험에서 GFP-Grb2는 HEK293T 셀에 DNM2와 공동으로 transfected되었습니다. 24 H 및 이미지는 Ope에 인수 된 후 셀은 Hoechst 33342 물들되었습니다RA LX. 하나의 녹색 (GFP) 채널의 시야와 UV (파란색, Hoechst 33342)이 표시됩니다.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

표현 복제는 바이러스 수용체와 혈액 세포 항원 12 소설 세포 구성 요소를 식별하기 위해 과거에 사용 된 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 Grb2에 바인딩 소설 putative 신호 전달 수용체의 식별을 용이하게하는 방법을 설명합니다. 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. <ol><li> 자동화 된 플라스미드 준비는 박테리아 펠렛의 완전한 resuspension가 절대적으로 중요합니다. 때때로, 그것은 엄격한 흔들림 단계 또는 피펫에 대한 추가 혼합을 포함 할 필요가 있습니다. </li><li> 솔루션 2와 3의 추가 후, 혼합 완료 필수적이며, 우리는 수동으로 반전 밀봉 된 판은 자동으로 흔드는의 사용을보다 효율적 것으로 나타났습니다. 이 DNA의 전단으로 이어질 것 같은 Pipetting이 단계에서 피해야한다. </li><li> 모든 진공 단계에서, 하나는 액체가 완전히 배수되어 있는지 확인합니다판에서. 그렇지 않으면 낮은 수율이 예상 할 수 있습니다. </li><li> 용출되면, 그것은 eluate는 플라스미드 바인딩 플레이트의 하단에있는 양식을 떨어 것이 매우 일반적입니다. 이 물방울 용출 판에서 수집 할 필요가 있으므로이 플라스미드 바인딩 플레이트가 신중하게 해제되어 하단에 잔여 물방울이주의 깊게 eluate 판으로 전송하는 것이 좋습니다. </li><li> transfection 동안, 복잡한 형성의 시간이 중요합니다. 우리는 보통 20-30 분을 준수합니다. 짧은 시간이 권장되지 않는 동안 한 H에 더 이상 시간까지는 생산량의 감소없이 잘됩니다. </li><li> 현미경의 경우 배율의 선택이 중요합니다. 여기에 사용 된 오페라 LX 시스템에서 20x의 해상도는 높은 품질의 이미지를 얻을 수 충분합니다. 높은 해상도의 이미지가 필요한 경우, 목표는 세포의 통계적으로 의미있는 번호를 받기 위해 변경하지만, 할 수 필드와 높은 수집 시간 더 많은 정보가 필요합니다. 일반적으로, 우리는 목표물론 당 이미지로 최소 100 세포를합니다. </li></ol> Grb2의 translocation 분석은 EGFR 키나아제 활성화 6 작은 분자 억제제를 식별하는 다른 그룹에 의해 사용되었습니다. 이 경우 EGFR은 특히 리간드는 플라즈마 막에 Grb2 모집의 원인으로 활성화됩니다. 이 상호 작용의 중단 그 다음 작은 분자 화합물을 사용하여 조사 할 수 있습니다. 마찬가지로, 그것은 siRNA 화면이 EGFR-Grb2 신호 또는 C-KIT 또는 erythropoietin 수용체와 같은 다른 Grb2 바인딩 성장 인자 수용체에 참여 내생 유전자를 식별하기 위해 고용 할 수 envisaged 할 수 있습니다. 따라서,이 기법에 대해 여러 가능성이 응용 프로그램이 있습니다. 유사한 접근 방식은 이러한 SHC, 갭 또는 IRS와 같은 다른 어댑터 분자에 대한 GFP 태그 기자 시스템에 적용 할 수 있습니다. 포유류의 세포에서이 셀 기반 분석을 사용하여 중 하나 큰 장점은 생리 학적으로 상대의 식별을 가능하게하는 것입니다evant 상호 작용을 확인할 수 있습니다. 분석은 단백질 복잡한 형성을위한 표시 장치이지만, 더 중요한 것은 관련 상호 작용이 올바른 하위 세포의 사이트에서 모니터링됩니다. 이런 점에서,이 기술은 효모 - 두 하이브리드 또는 체외 assays에서와 같은 다른 단백질 단백질 상호 작용 방법과 유물을 극복. 그것은 간접적 인 상호 작용도 Grb2 모집 될 수,하지만 주목해야한다. 마찬가지로, 바인딩 파트너의 전사까지 규제는 cDNA 식에 의해 유도 될 수 있습니다. 이러한 가능성을 구별하려면, 직접 및 간접 구속력 효과를 구별 할 수있는 적절한 보조 assays를 수행 할 필요가 있습니다. 결론적으로, GFP-어댑터 분자 translocation 분석은 게놈 전체 검사 및 약물 발견 응용 프로그램에 대한 높은 가능성을 약속드립니다.

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> cDNA 라이브러리 </td><td> Origene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LB + A </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 가스 투과성의 물개 </td><td> ThermoScientific </td><td> AB-0718 </td><td></td></tr><tr><td> Nucleospin 96 플라스미드 키트 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625.4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad </td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> 분자 프로브 </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 F TC </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td> 허드슨 강 </td><td></td><td> Norgren CP7200 </td></tr><tr><td> 자유 에보 (Evo) </td><td> Tecan </td><td></td><td> 진공 매니 폴드와 </td></tr><tr><td> Multidrop 384 </td><td> 열 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 오페라 LX </td><td> PerkinElmer </td><td></td><td></td></tr></table>

a high-content imaging workflow to study grb2 signaling complexes by expression cloning

성장 인자 수용체의 신호 전달은 확산과 차별화를 유지하는 셀을 위해 필수적이며, 꼭 컨트롤이 필요합니다. 신호 전달은 transmembrane 수용체 및 다운 스트림 신호 폭포의 활성화에 외부 리간드의 결합에 의해 시작됩니다. mitogenic 신호의 핵심 레귤레이터는 Grb2, 효소 활동을 부족이 SH3 도메인으로 둘러싸인 내부 SH2 (SRC의 호몰 로지 2) 도메인으로 구성된 모듈 단백질입니다. Grb2는 constitutively의 N-말단 SH3 도메인을 통해 GTPase 쟁이 Sevenless (SOS)와 연결되어 있습니다. Grb2의 SH2 도메인 따라서 SOS - 라스 - MAP 키나제 신호 캐스케이드에 수용체 활성화를 커플 링 phosphorylated 티로신 잔류 물에서 성장 인자 수용체에 바인딩합니다. 또한, 신호 및 수용체의 endocytosis의 긍정적이거나 부정적인 레귤레이터와 같은 Grb2에 대한 다른 역할이 설명되어 있습니다. Grb2의 모듈 구성은 수용체와 transduc의 다양한 고정 할 수 있습니다하는 것이 좋습니다e는 1-3 다른 경로의 수많은 따라 신호. 여기에서 설명하는 것은 플라즈마 막에 Grb2 모집을 모니터링하는 간단한 현미경 분석이다. 그것은 녹색 형광 단백질의 하위 세포의 현지화 (GFP) 태그 자극 4-6에 대응 Grb2의 변화를 측정하는 분석에서 구성된다. 이러한 활성화 표피 성장 인자 수용체로 Grb2을 구속 플라즈마 막 수용체 (EGFR) 플라즈마 cDNA 표현시 멤브레인 및 이후 셀에 endosomal 구획에 옮겨 놓을 방법을 모집 GFP-Grb2. Grb2의 생체 단백질 단지에 식별하기 위해이 기술은 Grb2 하위 세포 현지화의 변화에 따라 게놈 차원 높은 콘텐츠를 화면을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. cDNA 표현 클론, transfection 및 이미지 수집의 준비는 아래에 자세히 설명되어 있습니다. 이러한 효모 - 두 HY 등의 단백질 상호 작용 파트너를 식별하는 데 사용되는 다른 게놈 방법에 비해brid,이 기술은 간단한 현미경 기반의 분석에 의한 상호 작용의 하위 휴대 사이트에서 포유류의 세포에 단백질 단지의 시각화 할 수 있습니다. 따라서 이러한 현지화의 패턴을 둘 질적 기능뿐만 아니라 상호 작용의 양적 강도로서 평가 될 수있다.

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A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

관할 transmembrane 수용체를 신호 소설의 식별을위한 높은 콘텐츠를 심사 방법은 설명되어 있습니다. 이 방법은 대규모 자동화 의무가 있으며, 수에 대한 예측<em&gt; 생체 내</em&gt; 단백질 바인딩과 포유류의 세포에 단백질 단지의 하위 세포 현지화.

표현 복제가 Grb2 신호 복합 단지를 공부하기 위해 높은 콘텐츠 이미징 워크 플로우

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

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10.6K 조회수.  University College London. 관할 transmembrane 수용체를 신호 소설의 식별을위한 높은 콘텐츠를 심사 방법은 설명되어 있습니다. 이 방법은 대규모 자동화 의무가 있으며, 수에 대한 예측 생체 내 단백질 바인딩과 포유류의 세포에 단백질 단지의 하위 세포 현지화.

비디오: A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

연구

생물학

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

PDZ-의존 CFTR의 Macromolecular 신호 단지의 체외 분석

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

대사율의 측정에<em&gt; 초파리</em&gt; Respirometry를 사용하여

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

표현 복제가 Grb2 신호 복합 단지를 공부하기 위해 높은 콘텐츠 이미징 워크 플로우

요약

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이 비디오의 챕터

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

PDZ-의존 CFTR의 Macromolecular 신호 단지의 체외 분석

대사율의 측정에

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한 워크 플로우

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