עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר הרפואי וערכת מארי קירי הבינלאומי Reintegration גרנט (לJKV).

1. בחירת שיבוטי cDNA Expression <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספריית cDNA מסופקת כשיבוטי חיידקים בודדים במניות גליצרול בפורמט 96 היטב. באמצעות פקודת Rearray בתפריט של בורר Norgen CP7200, לאסוף שיבוטי חיידקים מצלחת המקור ולחסן לLB 1.5 מ&quot;ל / מגבר ב96-deepwell (1 מ&quot;ל היטב) צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את צלחות deepwell עם חותם גז חדיר ודגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס במטרף. </li></ol> 2. הכנת ספריית הביטוי cDNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את צלחות deepwell המכילות את החיידקים ב2000 סל&quot;ד במשך 20 דקות באמצעות מתאמי צלחת בצנטריפוגה בראש הטבלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תקשורת מהבארות, ומשאיר את גלולת החיידקים ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הסיפון של תחנת עבודת אוטומצית המעבדה כפי שמוצג באיור 2. פתרונות להכנת פלסמיד מופצים לשקתות 1-5 וצלחת deepwell ממוקמת על הסיפון. שוקת multiwell עם פתרון elutionממוקם בסמוך לצלחת deepwell. טיפים נטענים לתוך מדפי טיפ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב את סעפת הוואקום. הצלחת המחייבת פלסמיד ממוקמת בתוך הסעפת וצלחת מסנן פלסמיד ממוקמת בחלק העליון של הסעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כדורים עם פתרון 250 μl 1 (חיץ Resuspension) על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse את החיידקים על ידי תוספת של 250 פתרוני μl 2 (חיץ תמוגה). הצלחת היא חתומה ומתהפכת כדי לאפשר ערבוב מוחלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת טיימר 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון μl 350 3 (חיץ Neutralisation). לאטום את הצלחת ולהפוך 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את lysates החיידקים לצלחות סינון פלסמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ואקום למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מסנן הצלחת ומניח את הצלחת על גבי הכריכה של הסעפת. החל ואקום לדקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של שטיפה נוספת (AW) חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ואקום עבור 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 900 ​​μl של פתרון חיץ לשטוף 4. החל ואקום עבור 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על זהטפ 2.14. החל ואקום ל15 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צלחת אוסף דנ&quot;א בתוך הסעפת. הוסף 100 μl של חיץ elution לצלחת המחייבת ודגירה במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבק למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת צלחת איסוף וריכוז הדנ&quot;א מידת שימוש Nanodrop 8000. בדרך כלל תשואה של ~ 100 ng / μl ניתן לצפות בשיטה זו. </li></ol> 3. זריעת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HEK293 תאים trypsinized ונספרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 10 4 תאי x הם חלקו לכל אחד גם מViewplate PerkinElmer באמצעות ThermoFisher 96-multidrop היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מודגרת לילה על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2. </li></ol> 4. Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת של דנ&quot;א 100 ng-GFP Grb2 פלסמיד עם 100 ננוגרם של cDNA ב25 בינוני μl סרום נטול כל גם בתחתית צלחת 96-גם עגולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 25 תקשורת סרום נטול μl המכילה Transfectin μl 0.5 לטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב ולהתחיל טיימר fo30 דקות r. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 50 μl תמהיל cDNA / Transfectin לתאים באמצעות שיטה מחלק עדינה. לחלופין, תערובת transfection ניתן לוותר אל תוך צלחות ולאחר מכן תאים נוספים בחלק העליון (transfection ההפוך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאי לילה על 37 מעלות צלזיוס וCO 2% 5. </li></ol> 5. יבוא תמונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל תוכנת אופרה. תמונת מסך של הגדרת הניסוי מוצגת באיור 3. בחר בכרטיסיית &quot;ההגדרות&quot; ובחר 20x אובייקטיבי וסוג הצלחת הנכונה. ודא &quot;צווארון&quot; מוגדר הערך הנכון במטרה לאפשר להתמקדות בסוגים שונים צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;מיקרוסקופ&quot;. הגדר חשיפת 1 כFITC (488 ליזר) וחשיפה 2 כUV (365 ליזר). הפעל פילטר UV על שתי החשיפות ולהקצות חשיפה 1 עד 1 מצלמה וחשיפה 2 למצלמה 2. הגדרת זמני חשיפה עד 800 אלפיות שניים לחשיפת 1 ו 40 אלפיות לחשיפה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;מיקרוסקופ&quot;. הגדרת דוארxposure 1 כFITC (488 ליזר) וחשיפה 2 כUV (365 ליזר). הפעל פילטר UV על שתי החשיפות ולהקצות חשיפה 1 עד 1 מצלמה וחשיפה 2 למצלמה 2. הגדרת זמני חשיפה עד 800 אלפיות שניים לחשיפת 1 ו 40 אלפיות לחשיפה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חשיפה 1. קבע את המוקד לגובה 0 מיקרומטר. בחר &quot;פוקוס&quot;. ברגע ממוקד, תחשוף מצלמה 1. התאם את גובה המוקד כדי לייעל את מטוס החשיפה ולחץ על &quot;גובה לקחת&quot;. לשנות את זמני החשיפה וכוח הליזר לתת עוצמת פיקסל מקסימלי של ~ 3000. שמור את פרמטרי חשיפה. חזור לחשיפה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;הגדרת ניסוי&quot;. ליצור את הפריסה וsublayout. גרור ושחררת את הפריסה, חשיפה, הפניה לתמונה, קובץ skewcrop הרלוונטי וsublayout. שמור ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;אוטומטית ניסוי&quot; ולרכוש תמונות. </li></ol> 6. ניתוח תמונה (מבוסס על גרסת 1.46h ImageJ.) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת PerkinElmer הקניינית. קבצים להגמיש לפורמט תמונה שתייג. Tif קובץ באמצעותתסריט Flex2Volocity Acapella. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא תמונות בImageJ כרצף תמונות, וכתוצאה מהערימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המר את הערימה לערוץ 2 hyperstack ידי בחירת התמונה / Hyperstack / סטאק לפריט תפריט Hyperstack. מספר הפרוסות חייב להיות מוגדר למחצית הערימה המיובאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל את ערוץ ה-GFP באמצעות תמונה / פקודה כפולה: סמן את תיבת סימון hyperstack הכפולה ולציין ערוצים: 1-1. להלן ישתמש במחסנית הכפולה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תהליכים / ניגודיות שפר עם פיקסלים רוויים 0.01%, באמצעות היסטוגרמה מחסנית ולהמיר 8 ביט עם Image/Type/8-bit. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר פילוח 15 פיקסל רדיוס מקומי מסתגל באמצעות אלגוריתם Bernsen עם סף ניגוד (פרמטר 1) ש &#39;= 30. סמן את תיבת סימון האובייקטים הלבנים על רקע שחורה בתפריט הסף המקומי / האוטומטית של תמונה / התאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרת איכות פילוח: ליצור שכבת קו מתאר אובייקט מפולחת על תמונות המקוריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Featuמחדש חילוץ על ידי ניתוח חלקיקים: אזור מדידה, אומר ועצמה כוללת של כל אברון. שמירת קבצי תוצאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ תוצאת התכונות במחקר וליצור היסטוגרמה. </li></ol> 7. נציג תוצאות בתנאים נורמלים Grb2 הוא מקומי בכל רחבי התא. לאחר הגירוי של הקולטן לגורם צמיחה זה translocates לממברנת הפלזמה וגם הופכים להפנים לתוך endosomes כפי שמוצג באיור 4. הביטוי של הקולטן פני תא מסוגל Grb2 המחייב הוא מספיק כדי לגרום לטרנסלוקציה זו. בניסוי הקרנה טיפוסי, לא חל שינוי בלוקליזציה GFP-Grb2 הוא ציין. עם זאת, כאשר חלבון מתבטא שGrb2 מתגייסים לאתר משנה הסלולר, יש שינוי בלוקליזציה שיכולה להיות בקלות דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לדוגמה, ביטוי של תוצאות EGFR בrelocalization של ה-GFP-Grb2 למבני endosome דמויים (איור4). לפיכך, בעת החלת ספרייה הגנום, ניתן לצפות שחלבונים בתא שטח Grb2 מחייב רומן יכולים להיות מזוהים. שיטה זו אינה מוגבלת לזיהוי של חלבונים בתא שטח. לדוגמה, Dynamin2 גורם לשינוי בלוקליזציה משנה הסלולר של ה-GFP-Grb2 הצגת הגיוס endosome דמוי (איור 5). Dynamin2 נקשר לתחום של Grb2 SH3 C-מסוף ומעורב באנדוציטוזה של 9,10 המורכב זו. לפיכך, גישה זו מאפשרת זיהוי של קומפלקסים מחייבים חלבון כלליים ואינו מוגבל לזיהוי של שותפים לאינטראקצית תחום SH2. סוגים שונים של כמה טרנסלוקציה ניתן לצפות כגון לוקליזציה לממברנת הפלזמה, לendosomes, מבנים אחרים cytoplasmic שלפוחי או לגרעין. לכן, מומלץ כי כל התמונות גם נבדקות על ידי עין. עם זאת, כאשר מיון קבוצות גדולות של cDNAs אוטומטיאלגוריתם ניתוח תמונה הוא יותר מעשי. במקרה זה, בשילוב של אלגוריתמים רצוי, כגון זיהוי מקום לזהות זיהוי endosomes, ציטופלסמה / גרעין לזהות אלגוריתמים מורפולוגיים הלוך גרעיניים וכלליים כדי לזהות שינויי צורה סלולריות. השימוש בשיטות זיהוי שונים פנוטיפי אלה נדון בפירוט רב יותר במקום אחר 11. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" /> איור 1. תכנית כוללת של הניסוי. פרטי ניסוי זרימת עבודה גבוהת הקרנת תוכן מלאה החל מההגברה והכנת ספריית cDNA, transfection של וקטורי cDNA תוספת בונת כתב, רכישת תמונה וניתוח תמונה באמצעות תוכנת IMAGEJ הפתוח ללא תשלום. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" /> Figure 2. תצורה של סיפון טקאן. (1) בצד השמאלי, חמש 100 מיליליטר שקתות צריכות להיות מלאה עם חוצצים 1 (40 מ&quot;ל), 2 (40 מ&quot;ל), 3 (50 מ&quot;ל), AW (60 מ&quot;ל) וA4 (100 מ&quot;ל). A4 השוקת יהיה צורך מחדש מולא פעם אחת במהלך ההליך. (2) סעפת הוואקום ממוקמת בעמדה 14 בדוגמה זו. (3) צלחת deepwell עם כדורי חיידקים נמצאת בעמדה 30, ליד שוקת חיץ elution עם חיץ 25 מ&quot;ל elution. (4) טיפים חד פעמים לראש הערוץ 8-צריכים להיות טעונים במדפי טיפ על צד השמאל ועצות לראש רב צריכים להיות מלא בעמדה 40. מטפל נוזל FreedomEvo טקאן המשמש בניסוי זה מצויד עם 500 מזרקי μl. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" /> דמות3. אוטומצית רכישה של תמונה על אופרת LX. א) בחר בכרטיסיית התצורה (1). הפעל את קווי הליזר הדרושים לניסוי (2). בחר את המצלמות לרכישת תמונה (3). בחר את סוג הצלחת והעדשה אובייקטיבית לניסוי (4). B) בחר בכרטיסיית מיקרוסקופ (1). הגדר את מקור האור וזמן חשיפה לחשיפת 1 (2,3). להתמקד באחד וגם לקחת גובה (4). ג) בחר בכרטיסיית הגדרת הניסוי (1). גרור ושחררת חשיפה, skewcrop, קבצי sublayout (2) התייחסות, ופריסה. גרור ושחררת את קובץ הניסוי (3). ד) בחר ניסוי אוטומטי (1). גרור ושחררת קובץ ניסוי (2). להקצות ברקוד המתאים (3). התחל רכישת תמונה על ידי לחיצה על הכפתור התחל (4). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" /> <strong&gt; איור 4. טרנסלוקציה GFP-Grb2 ידי ביטוי cDNA. מיקומם GFP-Grb2 מלוקליזציה cytoplasmic שלטת למבני endosome דמויים על ביטוי יתר של קולטן גורם גדילת הטרנסממברני ולאחר מכן מפנה לendosomes. בצד השמאל, תמונות מיקרוסקופיה של M6 תאי COS מוצגות שtransfected זמנית עם GFP-Grb2 (למעלה) או GFP-Grb2 תוספת EGFR (למטה). שיתוף ביטוי לתוצאות EGFR בהעתקה של ה-GFP-Grb2 למבני endosome דמויים. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" /> איור 5. דוגמה לטרנסלוקציה cDNA המושרה של GFP-Grb2. GTPase Dynamin2, העוסק באנדוציטוזה Grb2 בתיווך, מיקומם GFP-Grb2 למבני endosome דמויים (מוקף בעיגול). בניסוי זה, GFP-Grb2 היה שיתוף transfected עם DNM2 לתוך תאי HEK293T. תאים הוכתמו Hoechst 33342 אחרי 24 שעות ותמונות נרכשו על אופra LX. תחום אחד מבט של הערוץ הירוק (GFP) ו UV (כחול; Hoechst 33342) מוצג.

<ol>
	<li>Sastry, L., Cao, T., King, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Grb2-protein+complexes+in+human+cancer+cells.">Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).</li><li>Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+Grb2+by+Bcr/Abl+and+epidermal+growth+factor+receptor:+a+novel+regulatory+mechanism+for+tyrosine+kinase+signaling.">Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling.</a> Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).</li><li>Bisson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+reveals+the+dynamics+of+signaling+through+the+GRB2+adaptor.">Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor.</a> Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).</li><li>Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Feynman+trajectories:+determining+the+path+of+a+protein+using+fixed-endpoint+assays.">The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).</li><li>Yamazaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Grb2+in+EGF-stimulated+EGFR+internalization.">Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization.</a> J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).</li><li>Antczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain-Based+Biosensor+Assay+to+Screen+for+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+Modulators.">Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators.</a> in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).</li><li>Su, J., Batzer, A., Sap, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+phosphatase+R-PTP-alpha+is+tyrosine-phosphorylated+and+associated+with+the+adaptor+protein+Grb2.">Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2.</a> J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).</li><li>Hertog, J. d. e. n., Tracy, S., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+receptor+protein-tyrosine+phosphatase+alpha+on+Tyr789,+a+binding+site+for+the+SH3-SH2-SH3+adaptor+protein+GRB-2+in+vivo.">Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo.</a> Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).</li><li>Miki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Ash/Grb-2+with+dynamin+through+the+Src+homology+3+domain.">Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain.</a> J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).</li><li>Seedorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+binds+to+SH3+domains+of+phospholipase+C+gamma+and+GRB-2.">Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2.</a> J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).</li><li>Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+expression+cloning.">Developments in expression cloning.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שיבוט ביטוי הוא כלי רב עצמה שהיה בשימוש בעבר כדי לזהות מרכיבים תאיים רומן כגון קולטנים וירוסים ואנטיגנים תאי דם 12. כאן, אנו מתארים שיטה כדי להקל על זיהוי של קולטנים רומן משוער אותות transduction אשר נקלטים על Grb2. יש כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת פלסמיד אוטומטית זה בהחלט חיוני שיש resuspension המלא של גלולת החיידקים. לפעמים, יש צורך לכלול צעד קפדני רועד או יותר ערבוב עם pipettes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם התוספת של פתרון 2 ו 3, להשלים ערבוב חיוני ומצאנו כי באופן ידני היפוך הצלחת האטומה היא יעילה יותר מאשר השימוש בייקר אוטומטי. Pipetting יש להימנע בשלב זה כי הדבר יוביל להטיה של ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל צעדי הוואקום, יש לוודא שהנוזל סחוט לגמרימהצלחת. תשואות נמוכות אחרת הם צפויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על elution, שזה די נפוץ שeluate טיפי טופס שבתחתית של הצלחת המחייבת פלסמיד. טיפין אלו צריכות להיות שנאספו בצלחת elution, ולכן מומלצים שהצלחת המחייבת פלסמיד הוא הרימה בזהירות וכל טיפין שיורית בתחתית מועברות בזהירות לצלחת eluate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך transfection, עת ההיווצרות מורכבת היא קריטית. אנחנו בדרך כלל לדבוק 20-30 דקות. זמן ארוך יותר של עד 1 h הוא בסדר ללא ירידה בתשואה, ואילו זמנים קצרים אינם מומלצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיקרוסקופיה, הבחירה של גדלה היא חשובה. במערכת LX האופרה משמשת כאן, ברזולוציה של 20x מספיק כדי לקבל תמונות באיכות גבוהה. אם תמונות ברזולוציה גבוהה יותר נדרשות, המטרה יכולה להיות שונה, אבל כדי לקבל מספרים סטטיסטיים משמעותיים של תאים, מספר גבוה יותר של תחומים וזמני רכישה גבוהות יותר נדרשים. באופן כללי, אנו שואפיםכדי לקבל לפחות 100 תאים צפו בי לטוב. </li></ol> Assay טרנסלוקציה Grb2 כבר בשימוש על ידי קבוצות אחרות כדי לזהות מעכבי מולקולה קטנות של הפעלת EGFR קינאז 6. במקרה זה, EGFR מופעל במיוחד עם ליגנד גורם לגיוס Grb2 קרום הפלזמה. שיבוש של אינטראקציה זו ואז ניתן לחקור באמצעות תרכובות מולקולה קטנות. בדומה לכך, ניתן בחזונו כי מסכי siRNA יכולים להיות מועסקים על מנת לזהות גני אנדוגניים מעורבים ב- EGFR Grb2 איתות או קולטנים אחרים Grb2 מחייבים לגורם גדילה, כגון c-KIT או הקולטן אריתרופויאטין. לפיכך, יש יישומים פוטנציאליים רבים לטכניקה זו. גישה אנלוגית יכולה להיות מיושמת על מערכות כתב GFP-tagged למולקולות אחרות כגון מתאם הא&quot;ס, Gab או מס הכנסה. אחד יתרונות עיקריים של שימוש assay המבוסס התא הזה בתאי יונקים הם שהיא מאפשרת זיהוי של rel פיסיולוגיאינטראקציות evant. הבדיקה היא readout להיווצרות חלבון מורכבת, אבל חשוב יותר, האינטראקציות הרלוונטיות מנוטרות באתר הנכון משנה הסלולר. בהקשר זה, בטכניקה זו מתגברת על ממצאים מן שיטות אחרות אינטראקציה בין חלבונים כגון ושתיים היברידי שמרים או במבחני חוץ גופייה. יצוין כי, כי אינטראקציות עקיפות גם עלולות לגרום לגיוס Grb2. בדומה לכך, למעלה בקרת השעתוק של שותפים מחייבים עשויה להיגרם על ידי ביטוי cDNA. כדי להבחין בין האפשרויות הללו, יש צורך לבצע את המבחנים השניים המתאימים כדי להבחין בין השפעות מחייבות ישירות ועקיפות. לסיכום, assay טרנסלוקציה מולקולת GFP-המתאם מבטיח פוטנציאל גבוה להקרנת הגנום ויישומי גילוי סמים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> ספריית cDNA </td><td> Origene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LB + מגבר </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> חותמות גז חדיר </td><td> ThermoScientific </td><td> AB-0718 </td><td></td></tr><tr><td> Nucleospin 96 ערכת פלסמיד </td><td> Macherey-נגל </td><td> 740625.4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad </td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> בדיקות מולקולריות </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 F TC </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td> הדסון </td><td></td><td> Norgren CP7200 </td></tr><tr><td> החופש Evo </td><td> טקאן </td><td></td><td> עם סעפת ואקום </td></tr><tr><td> 384 Multidrop </td><td> Thermo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> האופרה LX </td><td> PerkinElmer </td><td></td><td></td></tr></table>

a high-content imaging workflow to study grb2 signaling complexes by expression cloning

מעבר אותות על ידי קולטנים של גורמי גדילה חיונית לתאים כדי לשמור על שגשוג והתמיינות ודורש פיקוח הדוק. מעבר אותות הוא שיזם מחייב של יגנד חיצוני לקולט הטרנסממברני והפעלה של מפלי איתות במורד זרם. רגולטור מפתח של mitogenic איתות הוא Grb2, חלבון מודולרית המורכבים מתחום הפנימי SH2 (הומולוגית Src 2) ומשני צדים SH3 תחומים שאין בה פעילות אנזים. Grb2 קשור constitutively עם בן GTPase-Of-Sevenless (SOS) דרך SH3 התחום של N-המסוף. SH2 תחום Grb2 נקשר לקולטנים של גורמי גדילה בשאריות טירוזין phosphorylated כך צימוד ההפעלה קולטנית למפל איתות קינאז SOS-ראס-MAP. בנוסף, תפקידים אחרים לGrb2 כרגולטור חיובי או שלילי של איתות ואנדוציטוזה קולט כבר תארו. ההרכב המודולרי של Grb2 מציע כי ניתן לעגן למגוון של קולטנים וtransducדואר מאותת יחד שפע של מסלולים שונים 1-3. מתואר כאן היא בדיקה מיקרוסקופית פשוטה שמנטרת גיוס Grb2 לממברנת הפלזמה. זה מותאם מבדיקה שמודדת את השינויים בלוקליזציה משנה הסלולר של חלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP)-המתויג Grb2 בתגובה לגירוי 4-6. קולטני קרום פלזמה אשר נקלטות Grb2 כגון Factor קולטן הופעל הצמיחה אפידרמיס (EGFR) לגייס GFP-Grb2 לממברנת על ביטוי cDNA ולאחר מכן לעבור לתאי endosomal בתא. על מנת לזהות בקומפלקסי חלבוני vivo של Grb2, טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לבצע מסך הגנום גבוה תוכן המבוסס על שינויים בלוקליזציה משנה הסלולר Grb2. הכנת שיבוטי cDNA ביטוי, transfection ורכישת תמונה מתוארת בפירוט בהמשך. בהשוואה לשיטות אחרות הגנומי המשמשות לזיהוי שותפי אינטראקצית חלבון, כמו שמרים והשניים הי&quot;דbrid, טכניקה זו מאפשרת הדמיה של קומפלקסי חלבונים בתאי יונקים באתר המשנה הסלולר של אינטראקציה על ידי בדיקה מיקרוסקופית מבוססת פשוט. מכאן שתי תכונות איכותיות, כגון דפוסים של לוקליזציה ניתן להעריך, כמו גם את הכח כמותית של האינטראקציה.

Watch this Scientific Journal Video about A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning at JoVE.com

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

שיטת הקרנה גבוהה תוכן לצורך זיהוי של רומן איתות קולטנים הטרנסממברני מוסמכים מתוארת. שיטה זו היא נוחה לאוטומציה בקנה מידה גדולה ומאפשרת תחזיות לגבי<em&gt; In vivo</em&gt; חלבון מחייב ולוקליזציה משנה הסלולר של קומפלקסי חלבונים בתאי יונקים.

הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד Grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

a-high-content-imaging-workflow-to-study-grb2-signaling-complexes

Research

JoVE Journal

Biology

10.5K Views.  University College London. שיטת הקרנה גבוהה תוכן לצורך זיהוי של רומן איתות קולטנים הטרנסממברני מוסמכים מתוארת. שיטה זו היא נוחה לאוטומציה בקנה מידה גדולה ומאפשרת תחזיות לגבי In vivo חלבון מחייב ולוקליזציה משנה הסלולר של קומפלקסי חלבונים בתאי יונקים.

Video: A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

בניתוח מבחנה של PDZ תלויי macromolecular תסביכים CFTR לשידור אותות

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

מדידה של קצב חילוף החומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; באמצעות Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

זרימת עבודה עבור גבוהה תוכן, כימות תא יחידה של פלורסנט סמנים מUniversal מיקרוסקופים נתונים, הנתמכים על ידי תוכנות קוד פתוחות

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...