1. MEA إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن إما للاستخدام في الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف التجارب الصعق الكهربائي و تكون ملفقة باستخدام معيار تقنية ضوئيه كما هو موضح سابقا 18 أو شراؤها مباشرة من البائعين من الشركات المصنعة مثل أنظمة MEA قناة موضوع <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> وألفا MED العلمية المحدودة، <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com)</a> . ملفقة والاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المستخدمة في التجارب لدينا في المنزل في منشأة غرفة نظيفة في جامعة ولاية أريزونا، والتي تدار من قبل مركز بحوث الإلكترونيات الحالة الصلبة (CSSER). كان الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المستخدمة في تجاربنا أقطاب أكسيد الإنديوم 32 القصدير في قدرها 8 بنسبة 4 مجموعة مع أحجام الإطارات 50-200 ميكرون الكهربائي داخل الزجاج 1 سم القطر الداخلي أيضا. الزجاج والمستعبدين جيدا على استخدام polydimethylsiloxane MEA (PDMS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم MEA في الأوتوكلاف قبل خلية قeeding. وسائل أخرى للتعقيم مثل تمرغ في الايثانول 70٪، ويمكن أيضا علاج الأشعة فوق البنفسجية ومعالجة المياه الساخنة كما هو موضح في أماكن أخرى يمكن استخدامها طالما أنها لا تعرض للخطر سلامة MEA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل MEA تعقيمها إلى الصفحي هود تدفق ووضعه في معيار البوليسترين طبق بتري معقمة. قبل البذر الخلايا على وMEA، تعقيم تدفق الصفحي هود تحول على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة. إذا كان MEA حساسة للضوء الأشعة فوق البنفسجية تغطية طبق بتري تحتوي على رقائق الألومنيوم مع MEA عقيمة في حين أن التدفق تحت غطاء محرك السيارة الإضاءة فوق البنفسجية. </li></ol> 2. بذر خلايا في الشرق الأوسط وأفريقيا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الحصاد من خط الخلية تشغيل خلايا الثدييات تمسكا باستخدام التربسين / EDTA ورفعها إلى تركيز من 100-200 خلية / ميكرولتر في 1 مل سائل الإعلام خلية للطلاء. في تجاربنا نجحنا في زراعة NIH 3T3 خط الخلية الليفية، هيلا خط الخلية الأولية والخلايا العصبية القشرية وقرن آمون في MEA. </li><li&gt; ضع قطرة 20-30 ميكرولتر من وسائل الاعلام مع الخلايا على وMEA. نقل طبق بتري مع MEA إلى الحاضنة. من المهم للتأكد من أن حجم الانخفاض خلية كبيرة بما يكفي لتغطية جميع الأقطاب على MEA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 ساعة بعد البذر ونقل الخلايا طبق بتري مع MEA من الحاضنة إلى غطاء محرك السيارة وتدفق الصفحي إضافة بلطف ميكرولتر من قبل وسائل الإعلام 400-500 درجة حرارة (37 ° C) إلى MEA جيدا. تحقق تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا لا تزال تعلق وتنتشر بالتساوي على سطح MEA. نقل مرة أخرى إلى MEA الحاضنة. الانتظار ساعة 2 قبل فترة إضافة وسائل الإعلام تضمن ما يكفي من الوقت للخلايا الالتزام مع سطح MEA. يمكن إضافة وسائل الإعلام خلية قريبا جدا بعد البذر الخلايا يغسل الخلايا. إذا الخلايا لا يلتزمون بشكل جيد على MEA، يمكن علاج سطحه مع عوامل مثل مرفق الخلية aspolylysine، فبرونيكتين، وlaminin لتحسين التصاق الخلية. في تجاربنا الخلية هيلا تعاملنا مع السطح عادة MEA مع fibronectiن (10 ميكروغرام / مل) لمدة 1-2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 8-12 ساعة بعد البذر الخلايا، نفذ 1-2 يغسل مع PBS لإزالة أي خلايا ميتة. يمكن استبدال كل خلية متوسطة 24-48 ساعة حسب الحاجة. في تجربة نموذجية، وعادة ما تكون الخلايا جاهزة للساعة 24-48 ترنسفكأيشن بعد البذر. للحفاظ على التناسق في كفاءة الصعق الكهربائي فمن المستحسن الانتظار حتى الثقافة لا يقل عن 80٪ متموجة قبل الصعق الكهربائي. </li></ol> 3. مواقع محددة ترنسفكأيشن من سيرنا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول حمض النووي. لترنسفكأيشن سيرنا، إعداد سيرنا 1-2 ميكرومتر في حل الصعق الكهربائي العازلة الجليد الباردة الصعق الكهربائي للوصول الى الحجم النهائي من 200-400 ميكرولتر. في هذه المقالة نحن لشرح الفيديو ترنسفكأيشن من خلايا هيلا مع 488 اليكسا تسلسل مخلوط مترافق من سيرنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل MEA مع الخلايا من الحاضنة إلى الصفحي هود العقيمة التدفق. إزالة وسائل الإعلام خلية من MEA وإجراء غسيل مع PBS. بعد ذلك، أضف 200-400 ميكرولتر من أنام الباردة سيرنا ميكرومتر 1 حل الصعق الكهربائي إلى البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق نبضات كهربائية انوديك مربع لالأقطاب المستهدفة (راجع الخطوة 4 لتحديد أفضل المعايير للنبض الكهربائية). في تجاربنا استخدمنا الأدوات الواقعية 2414A مولد الموجي لتوليد النبضات الكهربائية والمزدوجة المضمنة-حزمة (DIP) 16 دبوس مشبك لاجراء اتصالات مع منصات السندات MEA. يمكن توصيل المولد الموجي لمقطع DIP عن طريق لوحة الدوائر المطبوعة لتقديم demultiplexor الانتقائية من الأقطاب الكهربائية على حدة. لالإلكترود المرجعي، ضع الكاثود الصلب في وسائل الإعلام الخلية. وفي الوقت نفسه تخفيض الإلكترود المرجعي الصلب في وسائل الإعلام من المهم للغاية للتأكد من أنه لا يجعل الاتصال مع سطح MEA. عند الاتصال، فإنه يمكن أن يسبب الضرر للخلايا وMEA و. فمن المستحسن لخفض القطب إشارة إلى موقف من 1 مم فوق الخلايا. يمكن وضعها A التبادل مع ارتفاع 1 مم في البئر للمساعدة في وضع المرجعerence القطب. نهج بديل لاستخدام القطب الكهربائي مرجع خارجي هو استخدام الأقطاب الكهربائية المجاورة والأنود الكاثود أزواج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد تطبيق نبضات كهربائية إلى الأقطاب الكهربائية على استهداف MEA، نقل مرة أخرى إلى MEA الحاضنة. بعد فترة حضانة المرض من 5 دقائق، استبدل بلطف 75٪ من المخزن المؤقت مع الصعق الكهربائي قبل تحسنت (37 ° C) وسائل الاعلام الخلية. في وقت لاحق، ويمكن القيام الفلورسنت التصوير للتأكد من تسليم سيرنا الموسومة fluorescently إلى الخلايا. </li></ol> 4. الصعق الكهربائي معلمة الأمثل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد الأمثل المعلمات نبض الكهربائية ل، الصعق الكهربائي و الصعق الكهربائي و التجارب التصميم لمجموعة من القيم من السعة النبض، النبض مدة، وعدد النبضات. في تجربتنا مع خلايا هيلا، لاحظنا أن الجهد نبض واحد من السعة في الفترة من 3 إلى 9 V V، ومدة من 1 إلى 10 ميللي ثانية ميللي ثانية لحجم الإلكترود من 100 ميكرومتر أدى إلى الصعق الكهربائي و ناجحة مع ميلنيمال زنزانة الموت. فمن توصيتنا أن تكون متنوعة معلمة واحدة في وقت واحد والبعض الآخر يتم الاحتفاظ المستمر. لquantitate كفاءة الصعق الكهربائي لكل من المعلمات نبض، ونحن نستخدم يوديد propidium (PI)، صبغة impermeant الخلية التي بقع المواد النووية، ومقرها حي منهجية الفحص، كما هو موضح في الخطوات 4،2-4،5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأسيس ثقافة الخلية على MEA اتباع الإرشادات الموضحة في الخطوات 1 و 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الصعق الكهربائي و إعداد ميكرولتر من 30 ميكروغرام 300-500 / مل حل PI في المخزن المؤقت الجليد الباردة الصعق الكهربائي و 400 ميكرولتر من 4 ميكرومتر calcien AM الحل في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل MEA من الحاضنة إلى الصفحي هود التدفق. إزالة وسائل الإعلام خلية من MEA وإجراء غسيل مع PBS. بعد ذلك، أضف 300-500 ميكرولتر من العازلة الصعق الكهربائي الجليد الباردة مع PI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق نبضات كهربائية مع السعة ومدة النبض المطلوب لالأقطاب المستهدفة (والمعدات المستخدمة في تجاربنا لتوليد الكهرباء وتطبيقيوصف نبض tric إلى MEA في الخطوة 3.3). لالإلكترود المرجعي خفض إما القطب الصلب في المخزن المؤقت الصعق الكهربائي في MEA جيدا أو استخدام القطب الكهربائي المجاور كمرجع. يمكن من خلال تطبيق انتقائي نبضات من سعة متفاوتة أو فترات مختلفة لأقطاب إجراء تجارب متعددة على نفس الجهاز. على سبيل المثال، على 32 MEA القطب، يمكن إجراء التجارب عن طريق تقسيم 8 الأقطاب 32 في 8 مجموعات، تتكون كل منها من 4 الأقطاب الكهربائية. ويمكن بعد كل مجموعة من المجموعات 8 ينبغي أن يحفزه نبضة الجهد مستطيل واحد لمدة 5 ميللي ثانية مع سعة متفاوتة في 3 V-6 مجموعة V V بزيادات 0.5 و مجموعة واحدة يمكن استخدامها كمجموعة تحكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد تطبيق نبضات الجهد لنقل MEA الحاضنة لمدة 5 دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة بلطف 75٪ من المخزن المؤقت الصعق الكهربائي من MEA جيدا واستبدالها مع وسائل الاعلام الخلية الدافئ. نقل مرة أخرى إلى MEA الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة حضانة من 2-4 ساعةاستبدال وسائل الإعلام خلية في MEA جيدا مع 300-500 ميكرولتر من 4 ميكرومتر AM Calcein الحل في برنامج تلفزيوني. نقل مرة أخرى إلى MEA حاضنة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة الخلايا مع Calcein AM، يستعاض عن Calcein AM الحل في الشرق الأوسط وأفريقيا بشكل جيد مع PBS يغسل بعد سنتين مع PBS. الحصول على الصور من الفلورسنت الخلايا باستخدام المجهر الضوئي مع المرشحات للمع PI (الإثارة / الانبعاث - 535 نانومتر nm/617) وCalcein AM (الإثارة / الانبعاث - 490 نانومتر nm/520). امتصاص PI، وذلك بسبب الصعق الكهربائي، ليتألق يسبب الخلايا الحمراء ويسبب AM Calcein الخلايا التي هي على قيد الحياة ليتألق الخضراء. ثلاثة سيناريوهات المحتملة التي يمكن ملاحظتها هي 1) خلية electroporated وعلى قيد الحياة (وسوف يتألق كل من الأحمر والأخضر)، 2) الخلايا على قيد الحياة ولكن ليس electroporated (سوف يتألق الخضراء فقط) و 3) والخلايا الميتة بسبب الصعق الكهربائي (يتألق الأحمر فقط) . تم حساب بقاء الخلية كنسبة مئوية من إجمالي عدد الخلايا على قيد الحياة على القطب وممثل المؤسسة الصعق الكهربائيتم حساب iciency كنسبة مئوية من إجمالي عدد خلايا محملة PI / سيرنا. </li></ol> 5. ممثل النتائج ويظهر الشكل 1 تحميل مواقع محددة من الخلايا الحله مع PI. ويمكن ملاحظة أن الخلايا فقط على القطب إثبات وجود امتصاص PI (الشكل 1B). أجريت مقايسة الحية واستخدمت الصعق الكهربائي و آخر لتقييم الجدوى من الخلايا (الشكل 1A). كفاءة الصعق الكهربائي وبقاء الخلية للمثال هو مبين في الشكل 1 هي 81.8٪ و٪ 96.1 على التوالي. ويمكن تحقيق عالية الكفاءة وبقاء الخلية الصعق الكهربائي عن طريق تحسين المعلمات نبض الصعق الكهربائي. ويرد في مواقع محددة ترنسفكأيشن من الخلايا الحله مع سيرنا الموسومة fluorescently لنبض الصعق الكهربائي الأمثل (8 V، 1 ميللي ثانية) في الشكل 2. تم العثور على كفاءة الصعق الكهربائي لسيرنا في 8 مللي ثانية V 1، ليكون 74،4٪ 16.0 ± وتم العثور على بقاء الخلية لتكون 87.9 ± 8.4٪ (كل البيانات ممثلا يعني ± الانحراف المعياري، N = 5). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" /> الشكل 1. بمواقع محددة تسليم PI في خلايا هيلا على القطب ميكرومتر 200 (6 V، 5 ميللي ثانية). A) إجراء فحص Calcien الحية (2) تستند الصعق الكهربائي و آخر ساعة. يشار إلى الخلايا على قيد الحياة من قبل مضان أخضر. B) الأحمر مضان يدل على امتصاص من قبل خلايا PI على القطب. C) صورة فرضه من A B. والأسهم البيضاء تشير إلى الخلايا التي هي وelectroporated على قيد الحياة. الأسهم السوداء تشير إلى الخلايا التي قد لقوا حتفهم. دائرة الابيض في B، C ويشير مخطط القطب. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" /> الشكل 2. ترنسفكأيشن من خلايا هيلا مع الموسومة fluorescently scrambl(ه) من تسلسل سيرنا. A) صورة خلايا هيلا على القطب ميكرومتر 100 transfected مع سيرنا 488 اليكسا الموسومة (8 V، 1 ميللي ثانية). B) صورة نوى الخلايا ملطخة دابي. الدائرة البيضاء يصادف حافة القطب.

<ol>
	<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+gene+expression+by+small+double-stranded+RNAs+in+invertebrate+and+vertebrate+systems.">Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742 (2001).</li><li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550 (2002).</li><li>Lee, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+small+interfering+RNAs+targeted+against+HIV-1+rev+transcripts+in+human+cells.">Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).</li><li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3'+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells.">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li><li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells.">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li><li>Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA-mediated+gene+silencing+in+vitro+and+in+vivo.">siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).</li><li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA.">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15, 1311 (1987).</li><li>Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection:+a+highly+efficient,+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure.">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413 (1987).</li><li>Raptis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=applications+of+electroporation+of+adherent+cells+in+situ,+on+a+partly+conductive+slide.">applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide.</a> Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+mammalian+cells:+optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation.">Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).</li><li>Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+on+siRNA+delivery+with+nonviral+carriers.">Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1017 (2011).</li><li>Ziauddin, J., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarrays+of+cells+expressing+defined+cDNAs.">Microarrays of cells expressing defined cDNAs.</a> Nature. 411, 107-110 (2001).</li><li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+gene+transfer+by+electroporation+into+adherent+cells+on+plasmid+DNA-loaded+electrodes.">Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes.</a> Nucleic Acids Res. 32, e187 (2004).</li><li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-Layer+Assembly+of+Poly+(ethyleneimine)+and+Plasmid+DNA+onto+Transparent+Indium?+Tin+Oxide+Electrodes+for+Temporally+and+Spatially+Specific+Gene+Transfer.">Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer.</a> Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsystem+for+transfection+of+exogenous+molecules+with+spatio-temporal+control+into+adherent+cells.">Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells.</a> Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-chip+for+spatially+controlled+transfection+of+nucleic+acid+payloads+into+cells+in+a+culture.">Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture.</a> Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+array+(MEA)+platform+for+targeted+neuronal+transfection+and+recording.">Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording.</a> Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).</li><li>Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+introduction+of+nucleic+acids+into+mammalian+cells+grown+in+microwell+arrays.">Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).</li><li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+high-throughput+electroporation+microchip+applicable+for+siRNA+delivery.">An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery.</a> Lab Chip. 11, 163-172 (2010).</li><li>Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+high-throughput+electroporation+chips.">Efficient and high-throughput electroporation chips.</a> , (2011).</li><li>Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+electroporation+of+surface-bound+siRNAs+in+microwell+arrays.">In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays.</a> Lab Chip. 12, 939-947 (2012).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo.">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li><li>Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-induced+gene+silencing+by+local+electroporation+in+targeting+brain+region.">RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region.</a> J. Neurophysiol. 93, 594 (2005).</li><li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+electroporation:+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications.">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).</li><li>Boukany, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells.">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في هذه المقالة نحن الفيديو شرح استخدام MEA لمواقع محددة من خلايا هيلا ترنسفكأيشن مع سيرنا مخلوط تسلسل. واحدة من مزايا هذه التكنولوجيا هو انطباقها على خطوط مختلفة من الخلايا بما في ذلك خطوط الخلايا الأولية. وقد أظهرت مختبرنا سابقا استخدام هذه التكنولوجيا لمواقع محددة ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> خلية الإعلام: المتقدمة MEM الجلوتامين L-200 ملي مول البنسلين / الستربتوميسين المصل البقري الجنين </td><td> Gibco / إينفيتروجن Himedia المختبرات / VWR Lonza المجموعة المحدودة Gibco / إينفيتروجن </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> خلية الإعلام التركيب: 2٪ FBS، Pennstrep 2٪ الجلوتامين L-و 2٪ في المقدمة MEM </td></tr><tr><td> التربسين EDTA </td><td> Mediatech، وشركة </td><td> 25-053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech، وشركة </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> سارعت الكسا 488 و رودامين الموسومة sequسينعقد سيرنا </td><td> QIAGEN، وشركة </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> الصعق الكهربائي العازلة </td><td> Biorad المختبرات </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> مولد الموجي </td><td> واقعي </td><td> 2414A </td><td> ويمكن استخدام أي الموجي / مولد النبض التي يمكن أن توفر النبضات المطلوب. </td></tr></table>

high efficiency, site-specific transfection of adherent cells with sirna using microelectrode arrays (mea)

حققت اكتشاف المسار رني في حقيقيات النوى والتطور اللاحق للعملاء رني، مثل سيرنا وshRNA، وهي طريقة فعالة جدا لإسكات جينات معينة 1-8 لعلم الجينوم الوظيفي والعلاج. ومن التحديات الرئيسية المشاركة في الدراسات القائمة على رني هو تسليم من وكلاء رني إلى الخلايا المستهدفة. التقنيات التقليدية التسليم غير الفيروسية، مثل الصعق الكهربائي ومعظم أساليب ترنسفكأيشن الكيميائية غالبا ما تفتقر إلى المراقبة الضرورية المكانية على التسليم وتحمل الكفاءة ترنسفكأيشن الفقراء 9-12. وقد أدت التطورات الحديثة في طرائق نقل المواد الكيميائية مثل الدهون الموجبة، والبوليمرات الموجبة والجسيمات النانوية في تعزيز الكفاءة ترنسفكأيشن غاية 13. ومع ذلك، هذه التقنيات لا تزال دون توفر السيطرة المكانية دقيقة على التسليم التي يمكن أن المنمنمة الفئات استفادة هائلة التكنولوجيات الفائقة الإنتاجية والدراسات خلية واحدة من خلايا والتحقيق خلايا التفاعلات. NT &quot;مكنت&gt; التطورات التكنولوجية الحديثة في إيصال الجينات عالية الإنتاجية ترنسفكأيشن من الخلايا الملتصقة 14-23، أغلبية التي تستخدم الصعق الكهربائي الميكروسكيل. الصعق الكهربائي و يقدم الميكروسكيل دقيقة المكانية والزمانية السيطرة على تسليم (إلى الخلايا واحدة) وتبين أنه لتحقيق الكفاءة العالية 19، 24-26. بالإضافة إلى ذلك، النهج القائم الصعق الكهربائي و لا تحتاج إلى فترة طويلة من الحضانة (عادة 4 ساعات) مع المجمعات سيرنا وDNA عند الضرورة في الطرق الكيميائية ومقرها ترنسفكأيشن يؤدي إلى الدخول المباشر من سيرنا عارية وDNA لا يمكن أن يتحقق في جزيئات الخلية السيتوبلازم. ونتيجة لذلك التعبير الجيني في وقت مبكر من ست ساعات بعد ترنسفكأيشن 27. مختبرنا أظهرت في السابق استخدام صفائف مسرى مكروي (MEA) لمواقع محددة في ترنسفكأيشن تمسكا الثقافات خلايا الثدييات 17-19. في النهج القائم MEA، ويتحقق تسليم حمولة الوراثية عبر electroporati الصغيرة النطاق المترجمةعلى من الخلايا. تطبيق من نبض الكهربائية لأقطاب مختارة يولد المجال الكهربائي المحلي الذي يؤدي إلى الصعق الكهربائي من الخلايا الموجودة في المنطقة من الأقطاب الإلكترونية المبرمجة. مراقبة مستقلة من الأقطاب الكهربائية الدقيقة يوفر السيطرة المكانية والزمانية على ترنسفكأيشن وتمكن أيضا تجارب متعددة ترنسفكأيشن القائمة التي سيتم تنفيذها على نفس الثقافة زيادة الإنتاجية والحد من ثقافة التجريبية إلى ثقافة التنوع. نحن هنا وصف الإعداد التجريبية وبروتوكول لترنسفكأيشن من استهداف خلايا هيلا ملتصقة مع سيرنا الموسومة fluorescently تسلسل باستخدام الصعق الكهربائي و مخلوط. ويمكن أيضا نفس البروتوكول استخدامها لترنسفكأيشن من ناقلات البلازميد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للبروتوكول الموصوفة هنا مدد بسهولة إلى مجموعة متنوعة من خطوط خلايا الثدييات مع تعديلات طفيفة. توافر التجارية الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مع كل من القطب أنماط محددة مسبقا والعرف جعل هذا الأسلوب للوصول رس مختبرات معظم البحوث الأساسية مع خلية المعدات الثقافة.

Watch this Scientific Journal Video about High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA at JoVE.com

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

تفاصيل المقال بروتوكول لمواقع محددة ترنسفكأيشن من مخلوط تسلسل سيرنا في ثقافة خلايا الثدييات تمسكا باستخدام مجموعة ومسرى مكروي (MEA).

عالية الكفاءة، ومواقع محددة ترنسفكأيشن من الخلايا تمسكا مع سيرنا باستخدام صفائف مسرى مكروي (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

high-efficiency-site-specific-transfection-adherent-cells-with-sirna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

13.4K Views.  Arizona State University. تفاصيل المقال بروتوكول لمواقع محددة ترنسفكأيشن من مخلوط تسلسل سيرنا في ثقافة خلايا الثدييات تمسكا باستخدام مجموعة ومسرى مكروي (MEA).

Video: High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

تسليم الجينات والخلايا البشرية في ترنسفكأيشن سرطان البنكرياس باستخدام مستقبلات عامل نمو البشرة استهداف الجيلاتين المستندة Nanovectors المهندسة

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &amp;#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

موقع محدد الهندسة الكروموسوم البكتيري: ΦC31 كاسيت الموفقة تبادل Integrase (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

الهندسة البكتيريا تمسكا من إنشاء واحدة الاصطناعية Curli OPERON

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

طلب خلايا واحدة والأجنة واحدة في 3D الحبس: جهاز جديد لفحص المحتوى العالي

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

مسامية السيليكون المجهرية الدقيقة لتسليم سيرنا التداوي

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects. 
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

تسليم العلاجية سيرنا إلى الجهاز العصبي المركزي عن طريق الموجبة وأنيوني الليبوزومات

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

تقييم شامل لفعالية وسلامة إيصال الأدوية المستهدفة للمشيمة باستخدام ثلاثة أساليب تكميلية

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of electrophysiological activity for long periods. However, the property of sensing signals from all sources around every microelectrode can become unfavorable when trying to understand communication and signal propagation in neuronal circuits. In a neuronal network, several neurons can be simultaneously activated and can generate overlapping action potentials, making it difficult to discriminate and track signal propagation. Considering this limitation, we have established an in vitro setup focused on assessing electrophysiological communication, which is able to isolate and amplify axonal signals with high spatial and temporal resolution. By interfacing microfluidic devices and MEAs, we are able to compartmentalize neuronal cultures with a well-controlled alignment of the axons and microelectrodes. This setup allows recordings of spike propagation with a high signal-to-noise ratio over the course of several weeks. Combined with specialized data analysis algorithms, it provides detailed quantification of several communication related properties such as propagation velocity, conduction failure, firing rate, anterograde spikes, and coding mechanisms.
This protocol demonstrates how to create a compartmentalized neuronal culture setup over substrate-integrated MEAs, how to culture neurons in this setup, and how to successfully record, analyze and interpret the results from such experiments. Here, we show how the established setup simplifies the understanding of neuronal communication and axonal signal propagation. These platforms pave the way for new in vitro models with engineered and controllable neuronal network topographies. They can be used in the context of homogeneous neuronal cultures, or with co-culture configurations where, for example, communication between sensory neurons and other cell types is monitored and assessed. This setup provides very interesting conditions to study, for example, neurodevelopment, neuronal circuits, information coding, neurodegeneration and neuroregeneration approaches.

This protocol aims to demonstrate how to combine in vitro microelectrode arrays with microfluidic devices for studying action potential transmission in neuronal cultures. Data analysis, namely the detection and characterization of propagating action potentials, is performed using a new advanced, yet user-friendly and freely available, computational tool.

ميكروفلويديكس التواصل مع صفائف ميكروليكترودي لدراسة الاتصالات العصبية ونشر إشارة محواري

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural underpinnings of brain disease and injury. As electrodes are miniaturized to the scale of individual cells, a corresponding rise in the interface impedance limits the quality of recorded signals. Additionally, conventional electrode materials are stiff, resulting in a significant mechanical mismatch between the electrode and the surrounding brain tissue, which elicits an inflammatory response that eventually leads to a degradation of the device performance. To address these challenges, we have developed a process to fabricate flexible microelectrodes based on Ti3C2 MXene, a recently discovered nanomaterial that possesses remarkably high volumetric capacitance, electrical conductivity, surface functionality, and processability in aqueous dispersions. Flexible arrays of Ti3C2 MXene microelectrodes have remarkably low impedance due to the high conductivity and high specific surface area of the Ti3C2 MXene films, and they have proven to be exquisitely sensitive for recording neuronal activity. In this protocol, we describe a novel method for micropatterning Ti3C2 MXene into microelectrode arrays on flexible polymeric substrates and outline their use for in vivo micro-electrocorticography recording. This method can easily be extended to create MXene electrode arrays of arbitrary size or geometry for a range of other applications in bioelectronics and it can also be adapted for use with other conductive inks besides Ti3C2 MXene. This protocol enables simple and scalable fabrication of microelectrodes from solution-based conductive inks, and specifically allows harnessing the unique properties of hydrophilic Ti3C2 MXene to overcome many of the barriers that have long hindered the widespread adoption of carbon-based nanomaterials for high-fidelity neural microelectrodes.

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

We describe here a method for fabricating Ti3C2 MXene microelectrode arrays and utilizing them for in vivo neural recording.

تلفيق Ti3C2 MXene Microelectrode صفائف في فيفو التسجيل العصبي

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided a unique opportunity to study the complex interplay among different cardiovascular cell types that drives tissue development and disease. In the area of cardiac tissue models, several sophisticated three-dimensional (3D) approaches use induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) to mimic physiological relevance and native tissue environment with a combination of extracellular matrices and crosslinkers. However, these systems are complex to fabricate without microfabrication expertise and require several weeks to self-assemble. Most importantly, many of these systems lack vascular cells and cardiac fibroblasts that make up over 60% of the nonmyocytes in the human heart. Here we describe the derivation of all three cardiac cell types from iPSCs to fabricate cardiac microtissues. This facile replica molding technique allows cardiac microtissue culture in standard multi-well cell culture plates for several weeks. The platform allows user-defined control over microtissue sizes based on initial seeding density and requires less than 3 days for self-assembly to achieve observable cardiac microtissue contractions. Furthermore, the cardiac microtissues can be easily digested while maintaining high cell viability for single-cell interrogation with the use of flow cytometry and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). We envision that this in vitro model of cardiac microtissues will help accelerate validation studies in drug discovery and disease modeling.

Here, we describe an easy-to-use methodology to generate 3D self-assembled cardiac microtissue arrays composed of pre-differentiated human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells. This user-friendly and low cell requiring technique to generate cardiac microtissues can be implemented for disease modeling and early stages of drug development.

تصنيع صفائف الأنسجة الدقيقة القلبية 3D باستخدام الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشرية ، والخلايا الليفية القلبية ، والخلايا البطانية

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...