1. Préparation MEA <ol><li> AME pour une utilisation dans des expériences d&#39;électroporation peuvent être fabriqués en utilisant la technique de photolithographie standard comme décrit précédemment 18 ou acheté directement auprès des fournisseurs des fabricants AME tels que les systèmes multi-canaux <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> et Alpha MED scientifique, Inc <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com)</a> . Les AME utilisées dans nos expériences ont été fabriqués en interne à l&#39;installation de salle blanche dans l&#39;Arizona State University, qui est administré par le Center for Solid State Electronics Research (CSSER). Les AME utilisées dans nos expériences a eu 32 électrodes d&#39;indium oxyde d&#39;étain dans une matrice 8 par 4 avec des diamètres de 50 à 200 um d&#39;électrodes dans un verre de 1 cm de diamètre intérieur bien. Le verre et a été collé sur le polydiméthylsiloxane MEA en utilisant (PDMS). </li><li> Stériliser la MEA dans un autoclave avant cellule seeding. D&#39;autres méthodes de stérilisation comme un trempage dans de l&#39;éthanol à 70%, le traitement UV et traitement de l&#39;eau chaude comme décrit par ailleurs peut aussi être utilisé aussi longtemps qu&#39;elles ne compromettent pas l&#39;intégrité de la MEA. </li><li> Transférer la MEA autoclave à une hotte à flux laminaire et le placer dans un plat de Pétri en polystyrène norme stérile. Avant l&#39;ensemencement des cellules sur la MEA, la stérilisation de la hotte à flux laminaire par la mise sous lumière UV pendant 20 min. Si la MEA est sensible à la lumière UV couvrir la boîte de Petri contenant du MEA avec une feuille d&#39;aluminium tandis que la hotte stérile écoulement est sous éclairage UV. </li></ol> 2. Les cellules d&#39;ensemencement sur la MEA <ol><li> Récolte des cellules d&#39;une lignée cellulaire fonctionnement des cellules de mammifères adhérentes à l&#39;aide de trypsine / EDTA et de les élever à une concentration de 100-200 cellules / ul dans 1 ml milieux cellulaires pour le placage. Dans nos expériences, nous avons réussi à cultiver NIH 3T3 lignée de cellules fibroblastes, lignée cellulaire HeLa et primaires neurones corticaux et hippocampiques sur l&#39;AEM. </li><li&gt; Déposer une goutte 20-30 ul de médias avec des cellules de l&#39;AEM. Transférer la boîte de Pétri avec l&#39;AEM à l&#39;incubateur. Il est important de veiller à ce que la taille des gouttes de cellule est suffisamment grand pour recouvrir toutes les électrodes sur la MEA. </li><li> 2 h après l&#39;ensemencement des cellules de transfert de la boîte de Pétri avec la MEA de l&#39;incubateur pour hotte à flux laminaire et ajouter doucement pi 400-500 de pré supports chauffés (37 ° C) à la MEA bien. Vérifiez sous le microscope pour s&#39;assurer que les cellules sont encore attachés et uniformément répartie sur la surface de la MEA. Transfert à l&#39;arrière MEA à l&#39;incubateur. La période de 2 heures d&#39;attente avant l&#39;addition du support garantit suffisamment de temps aux cellules d&#39;adhérer à la surface de la MEA. Ajout de milieux cellulaires trop tôt après l&#39;ensemencement des cellules peut laver les cellules. Si les cellules n&#39;adhèrent pas bien à la MEA, sa surface peut être traitée avec des facteurs de fixation cellulaire tel aspolylysine, la fibronectine, la laminine et d&#39;améliorer l&#39;adhérence cellulaire. Dans nos expériences, nous avons généralement de cellules HeLa traiter la surface avec MEA fibronectin (10 pg / ml) pendant 1-2 heures. </li><li> 8-12 heures après l&#39;ensemencement des cellules, effectuez 1-2 lavages avec du PBS pour éliminer les cellules mortes. Milieu cellulaire peuvent être remplacées tous les 24 à 48 heures selon les besoins. Dans une expérience typique, les cellules sont généralement prêt pour la transfection 24-48 heures après l&#39;ensemencement. Pour assurer la cohérence de l&#39;efficacité d&#39;électroporation, il est recommandé d&#39;attendre que la culture est au moins 80% de confluence avant électroporation. </li></ol> 3. Spécifique au site transfection de siRNA <ol><li> Préparer une solution d&#39;acide nucléique. Pour transfection de siRNA, préparer une solution uM 1-2 siARN électroporation dans le tampon d&#39;électroporation glacée pour atteindre un volume final de 200-400 ul. Dans cet article, nous démontrons la vidéo transfection de cellules HeLa avec Alexa 488 conjugué brouillés séquence de siRNA. </li><li> Transférer la MEA avec des cellules de l&#39;incubateur à flux laminaire hotte stérile. Retirez le support de cellules de l&#39;AEM et d&#39;effectuer un lavage avec du PBS. Par la suite, ajouter 200-400 ul de la iCE froide solution à 1 uM électroporation siRNA pour le bien. </li><li> Appliquer anodiques carrés des impulsions électriques aux électrodes ciblées (Reportez-vous à l&#39;étape 4 pour déterminer les paramètres optimaux de l&#39;impulsion électrique). Dans nos expériences, nous avons utilisé un des instruments pragmatiques 2414A générateur de signaux pour générer des impulsions électriques et d&#39;un double-inline-paquet (DIP) 16 circlip d&#39;axe de prendre contact avec les plots de connexion MEA. Le générateur de forme d&#39;onde peut être relié à l&#39;élément DIP via une carte de circuit imprimé démultiplexeur pour fournir une sélectivité d&#39;électrodes individuelles. Pour l&#39;électrode de référence, placer une cathode en acier dans les milieux cellulaires. Tout en réduisant l&#39;électrode de référence en acier dans les médias, il est extrêmement important de veiller à ce qu&#39;il n&#39;entre pas en contact avec la surface de la MEA. En cas de contact, il peut causer des dommages aux cellules et l&#39;AME. Il est recommandé d&#39;abaisser l&#39;électrode de référence à une position de 1 mm au-dessus des cellules. Une entretoise avec une hauteur de 1 mm peut être placé dans le puits pour faciliter le placement de l&#39;arbitrerence électrode. Une approche alternative à l&#39;utilisation d&#39;une électrode de référence externe est d&#39;utiliser des électrodes voisines comme cathode-anode paires. </li><li> Immédiatement après l&#39;application des impulsions électriques aux électrodes ciblées sur l&#39;AEM, AEM transférer l&#39;arrière de l&#39;incubateur. Après une période d&#39;incubation de 5 min, doucement remplacer 75% de la mémoire tampon d&#39;électroporation avec préchauffées (37 ° C) milieu cellulaire. Plus tard, l&#39;imagerie fluorescente peut être fait pour confirmer la livraison de siRNA marquées par fluorescence dans les cellules. </li></ol> 4. Optimisation des paramètres d&#39;électroporation <ol><li> Pour déterminer les paramètres optimaux d&#39;impulsions électriques pour l&#39;électroporation, expériences d&#39;électroporation de conception pour une plage de valeurs de l&#39;amplitude d&#39;impulsion, durée d&#39;impulsion, et le nombre d&#39;impulsions. Dans notre expérience avec des cellules HeLa, nous avons observé qu&#39;une seule impulsion de tension d&#39;amplitude de 3 V à 9 V, et la durée de 1 ms à 10 ms pour une taille d&#39;électrode de 100 um ont conduit à une électroporation avec succès kmnimal mort cellulaire. Il est de notre recommandation selon laquelle un paramètre de faire varier à la fois et d&#39;autres sont maintenus constants. Pour quantifier l&#39;efficacité d&#39;électroporation pour chacun des paramètres d&#39;impulsion, nous utilisons l&#39;iodure de propidium (PI), un colorant imperméant cellule que le matériel nucléique taches, et la méthodologie de test en direct basée, comme décrit dans les étapes 4.2 à 4.5. </li><li> Mettre en place une culture de cellules de la MEA en suivant les instructions indiquées dans les étapes 1 et 2. </li><li> Avant de préparer une électroporation ul 300-500 de 30 pg / ml solution PI dans le tampon d&#39;électroporation glacée et 400 ul de 4 uM calcien AM solution dans du PBS. </li><li> Transférer la MEA de l&#39;incubateur de la hotte à flux laminaire. Retirez le support de cellules de l&#39;AEM et d&#39;effectuer un lavage avec du PBS. Par la suite, ajouter 300-500 ul du tampon d&#39;électroporation glacée avec PI. </li><li> Appliquer des impulsions électriques d&#39;amplitude d&#39;impulsion désirée et la durée des électrodes ciblées (Le matériel utilisé dans nos expériences pour générer et d&#39;appliquer l&#39;électrique impulsion à l&#39;AEM est décrite à l&#39;étape 3.3). Pour l&#39;électrode de référence soit abaisser une électrode d&#39;acier dans le tampon d&#39;électroporation dans la MEA bien ou d&#39;utiliser l&#39;électrode voisine comme référence. En appliquant sélectivement des impulsions d&#39;amplitudes variables ou des durées différentes à électrodes multiples expériences peuvent être réalisées sur le même dispositif. Par exemple, sur une électrode 32 MEA, 8 expériences peuvent être réalisées en séparant les électrodes 32 en 8 groupes, chacun composé de 4 électrodes. Chacun des 8 groupes peuvent ensuite être stimulé par une impulsion de tension rectangulaire unique d&#39;une durée de 5 ms avec des amplitudes différentes dans 3 V-6 V Plage par incréments de 0,5 V et un groupe peut être utilisé comme un contrôle. </li><li> Immédiatement après l&#39;application des impulsions de tension transférer la MEA à l&#39;incubateur pendant 5 min. Ensuite, retirer délicatement de 75% de la mémoire tampon d&#39;électroporation de la MEA bien et le remplacer par les médias de cellules chaudes. Transfert à l&#39;arrière MEA à l&#39;incubateur. </li><li> Après une période d&#39;incubation de 2-4 heuresremplacer les supports de cellules dans le MEA bien avec 300-500 ul de 4 uM calcéine AM solution dans du PBS. Transfert à l&#39;arrière de l&#39;incubateur MEA pendant encore 30 minutes. </li><li> Après l&#39;incubation des cellules avec la calcéine AM, la calcéine AM remplacer solution dans le puits avec du PBS MEA après deux lavages avec du PBS. Obtenir des images fluorescentes de cellules à l&#39;aide d&#39;un microscope optique avec des filtres pour PI (excitation / émission - 535 nm/617 nm) et calcéine AM (excitation / émission - 490 nm/520 nm). L&#39;absorption de PI, en raison de l&#39;électroporation, la destruction des cellules à fluorescence rouge et la calcéine AM provoque des cellules qui sont vivants à fluorescence verte. Trois scénarios possibles qui peuvent être observés sont: 1) des cellules vivantes (électroporation et une fluorescence rouge et vert), 2) des cellules vivantes, mais pas électroporation (une fluorescence verte juste) et 3) les cellules mortes en raison de l&#39;électroporation (une fluorescence rouge seulement) . La viabilité cellulaire a été calculé en pour cent du nombre total de cellules vivantes sur l&#39;électrode et l&#39;eff électroporationicacité a été calculé comme pour cent du nombre total de cellules chargées de PI / siRNA. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs La figure 1 montre la charge spécifique au site de cellules HeLa avec PI. On peut constater que seules les cellules sur l&#39;électrode démontrent une absorption de PI (figure 1B). Un test direct effectué après électroporation a été utilisé pour évaluer la viabilité des cellules (figure 1A). L&#39;efficacité d&#39;électroporation et la viabilité des cellules pour l&#39;exemple représenté à la figure 1 sont 81,8% et 96,1% respectivement. La viabilité des cellules à haute efficacité et d&#39;électroporation peut être obtenue en optimisant les paramètres d&#39;impulsion d&#39;électroporation. Spécifique au site transfection de cellules HeLa avec le siRNA marquées par fluorescence pour une impulsion d&#39;électroporation optimisé (8 V, 1 msec) est montré dans la figure 2. L&#39;efficacité d&#39;électroporation pour le siRNA à 8 ms V, 1 a été jugée 74,4 ± 16,0% etla viabilité des cellules a été jugée 87,9 ± 8,4% (toutes les données représentées sous forme de moyenne ± écart type, n = 5). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" /> Figure 1. Site-spécifique de livraison de PI dans les cellules HeLa sur une électrode de 200 um (6 V, 5 ms). A) Calcien dosage basé direct effectué 2 heures après l&#39;électroporation. Cellules vivantes sont indiqués par une fluorescence verte. B) Rouge fluorescence montre l&#39;absorption par les cellules de la PI sur l&#39;électrode. C) Une image superposée de A et B. Les flèches blanches indiquent les cellules qui électroporation et vivant. Les flèches noires indiquent les cellules qui sont morts. Le cercle blanc en A, B et C indique le contour de l&#39;électrode. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" /> Figure 2. La transfection de cellules HeLa avec scrambl marquées par fluorescencee séquence de siRNA. A) l&#39;image des cellules HeLa sur une électrode de 100 um transfectées avec Alexa 488 siARN étiquetés (8 V, 1 ms). B) l&#39;image de noyaux de cellules colorées avec du DAPI. Le cercle blanc marque le bord de l&#39;électrode.

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G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+electroporation:+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications.">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).</li><li>Boukany, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells.">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans cet article, nous démontrons vidéo de l&#39;utilisation de la MEA pour le site spécifique à la transfection de cellules HeLa avec brouillés séquence de siRNA. Un des avantages de cette technologie est son applicabilité à différentes lignées cellulaires, y compris des lignées de cellules primaires. Notre laboratoire a précédemment démontré que l&#39;utilisation de cette technologie pour le site spécifique à la transfection de culture neuronale hippocampique primaire de rat E18 vieux jour et cellules...

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Milieux cellulaires: MEM avancée L-glutamine 200 mM Pénicilline / Streptomycine Sérum de veau fœtal </td><td> Gibco / Invitrogen HiMedia Laboratories / VWR Lonza Group Ltd Gibco / Invitrogen </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> Cellule composition des milieux: 2% de FBS, Pennstrep 2% de L-glutamine et 2% à l&#39;avance MEM </td></tr><tr><td> Trypsine EDTA </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 25 à 053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 21-040 CV- </td><td></td></tr><tr><td> Alexa 488 et la rhodamine étiqueté brouillés Sequrence siRNA </td><td> Qiagen, Inc </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon d&#39;électroporation </td><td> Biorad Laboratories </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> Générateur de signaux </td><td> Pragmatique </td><td> 2414A </td><td> Toute forme d&#39;onde / générateur d&#39;impulsions pouvant fournir des impulsions souhaitées peuvent être utilisées. </td></tr></table>

high efficiency, site-specific transfection of adherent cells with sirna using microelectrode arrays (mea)

La découverte de la voie de RNAi chez les eucaryotes et le développement ultérieur des agents ARNi, comme siRNA et shRNA, ont atteint une méthode puissante pour faire taire des gènes spécifiques 1-8 pour la génomique fonctionnelle et la thérapeutique. Un défi majeur impliqué dans les études basées sur l&#39;ARNi est la délivrance d&#39;agents ARNi dans les cellules ciblées. Les techniques traditionnelles de livraison non viraux, tels que l&#39;électroporation en vrac et les méthodes de transfection chimiques n&#39;ont souvent pas le contrôle nécessaire spatiale sur la livraison et payer des efficacités de transfection pauvres 9-12. Les progrès récents dans les méthodes de transfection chimiques tels que les lipides cationiques, les polymères cationiques et les nanoparticules ont donné lieu à des efficacités de transfection hautement améliorées 13. Toutefois, ces techniques continuent à ne pas offrir un contrôle précis de l&#39;espace au-dessus de livraison qui peut grandement bénéficier miniaturisé technologies à haut débit, des études unicellulaires et les enquêtes sur les interactions cellule-cellule. nt &quot;&gt; Les récents progrès technologiques dans la prestation des gènes ont permis de transfection à haut débit de cellules adhérentes 14-23, dont une majorité d&#39;utiliser l&#39;électroporation microscopique. électroporation Microscale offre spatio-temporelle précise le contrôle de la livraison (jusqu&#39;à des cellules individuelles) et a été montré d&#39;atteindre des rendements élevés 19, 24-26. De plus, les approches basées sur l&#39;électroporation ne nécessitent pas une longue période d&#39;incubation (environ 4 heures) avec des complexes ADN et de siRNA comme nécessaire dans les méthodes de transfection à base de produits chimiques et de conduire à l&#39;entrée directe de l&#39;ADN nu et siRNA molécules dans le cytoplasme de la cellule. Comme expression d&#39;un gène conséquence peut être atteint dès six heures après la transfection 27. Notre laboratoire a précédemment démontré que l&#39;utilisation de réseaux de microélectrodes (MEA) pour le site spécifique de transfection dans des cultures de cellules mammaliennes adhérentes 17-19. Dans la MEA approche basée sur la livraison de la charge utile génétique est réalisée via localisée à micro-échelle electroporatisur des cellules. Une application de l&#39;impulsion électrique à des électrodes sélectionnées génère locale du champ électrique qui mène à l&#39;électroporation de cellules présentes dans la zone des électrodes stimulées. Le contrôle indépendant des électrodes de commande fournit des micro-spatiale et temporelle au cours de la transfection et permet également de multiples expériences de transfection à base à effectuer sur la même culture qui augmente le débit et la réduction de culture expérimentale à la variabilité culture. Ici, nous décrivons le dispositif expérimental et le protocole de transfection ciblée des cellules HeLa adhérentes avec une fluorescence marquée brouillés siRNA de séquence en utilisant l&#39;électroporation. Le même protocole peut également être utilisée pour la transfection des vecteurs plasmidiques. En outre, le protocole décrit ici peut être facilement étendu à une variété de lignées cellulaires de mammifères avec des modifications mineures. La disponibilité commerciale de ces accords avec des configurations d&#39;électrodes à la fois prédéfinis et personnalisés font de ce t technique accessiblelaboratoires de recherche avec la plupart des o équipement de culture cellulaire de base.

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High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Les détails article pour le protocole spécifique de site de transfection de siRNA séquence brouillée dans une culture de cellules de mammifères adhérentes à l&#39;aide d&#39;une matrice de micro-électrodes (MEA).

Rendement élevé, spécifique au site transfection de cellules adhérentes avec l&#39;aide siARN réseaux de microélectrodes (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

high-efficiency-site-specific-transfection-adherent-cells-with-sirna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

13.4K vues.  Arizona State University. Les détails article pour le protocole spécifique de site de transfection de siRNA séquence brouillée dans une culture de cellules de mammifères adhérentes à l'aide d'une matrice de micro-électrodes (MEA).

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Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

Livraison de gènes et transfection de cellules humaines de cancer du pancréas en utilisant facteur de croissance épidermique ciblant les récepteurs des base de gélatine nanovecteurs Conçu

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Recherche

Bio-ingénierie

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &amp;#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

Site spécifique génie chromosome bactérien: ΦC31 intégrase médiation Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Ingénierie bactéries adhérentes en créant un simple synthétique Curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Commande de cellules simples et simple Embryons en 3D Confinement: un nouveau dispositif de criblage à haut débit

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

Silicium poreux microparticules pour la livraison de siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects. 
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

Livraison de siRNA thérapeutique du SNC Utilisation cationique et anionique Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

Évaluation globale de l’efficacité et l’innocuité de la délivrance de médicaments ciblés Placenta en utilisant trois méthodes complémentaires

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of electrophysiological activity for long periods. However, the property of sensing signals from all sources around every microelectrode can become unfavorable when trying to understand communication and signal propagation in neuronal circuits. In a neuronal network, several neurons can be simultaneously activated and can generate overlapping action potentials, making it difficult to discriminate and track signal propagation. Considering this limitation, we have established an in vitro setup focused on assessing electrophysiological communication, which is able to isolate and amplify axonal signals with high spatial and temporal resolution. By interfacing microfluidic devices and MEAs, we are able to compartmentalize neuronal cultures with a well-controlled alignment of the axons and microelectrodes. This setup allows recordings of spike propagation with a high signal-to-noise ratio over the course of several weeks. Combined with specialized data analysis algorithms, it provides detailed quantification of several communication related properties such as propagation velocity, conduction failure, firing rate, anterograde spikes, and coding mechanisms.
This protocol demonstrates how to create a compartmentalized neuronal culture setup over substrate-integrated MEAs, how to culture neurons in this setup, and how to successfully record, analyze and interpret the results from such experiments. Here, we show how the established setup simplifies the understanding of neuronal communication and axonal signal propagation. These platforms pave the way for new in vitro models with engineered and controllable neuronal network topographies. They can be used in the context of homogeneous neuronal cultures, or with co-culture configurations where, for example, communication between sensory neurons and other cell types is monitored and assessed. This setup provides very interesting conditions to study, for example, neurodevelopment, neuronal circuits, information coding, neurodegeneration and neuroregeneration approaches.

This protocol aims to demonstrate how to combine in vitro microelectrode arrays with microfluidic devices for studying action potential transmission in neuronal cultures. Data analysis, namely the detection and characterization of propagating action potentials, is performed using a new advanced, yet user-friendly and freely available, computational tool.

Interfaçage Microfluidics microélectrode tableaux pour étudier la Communication neuronale et la Propagation des signaux axonale

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural underpinnings of brain disease and injury. As electrodes are miniaturized to the scale of individual cells, a corresponding rise in the interface impedance limits the quality of recorded signals. Additionally, conventional electrode materials are stiff, resulting in a significant mechanical mismatch between the electrode and the surrounding brain tissue, which elicits an inflammatory response that eventually leads to a degradation of the device performance. To address these challenges, we have developed a process to fabricate flexible microelectrodes based on Ti3C2 MXene, a recently discovered nanomaterial that possesses remarkably high volumetric capacitance, electrical conductivity, surface functionality, and processability in aqueous dispersions. Flexible arrays of Ti3C2 MXene microelectrodes have remarkably low impedance due to the high conductivity and high specific surface area of the Ti3C2 MXene films, and they have proven to be exquisitely sensitive for recording neuronal activity. In this protocol, we describe a novel method for micropatterning Ti3C2 MXene into microelectrode arrays on flexible polymeric substrates and outline their use for in vivo micro-electrocorticography recording. This method can easily be extended to create MXene electrode arrays of arbitrary size or geometry for a range of other applications in bioelectronics and it can also be adapted for use with other conductive inks besides Ti3C2 MXene. This protocol enables simple and scalable fabrication of microelectrodes from solution-based conductive inks, and specifically allows harnessing the unique properties of hydrophilic Ti3C2 MXene to overcome many of the barriers that have long hindered the widespread adoption of carbon-based nanomaterials for high-fidelity neural microelectrodes.

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

We describe here a method for fabricating Ti3C2 MXene microelectrode arrays and utilizing them for in vivo neural recording.

Fabrication de Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays pour In Vivo Neural Recording

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided a unique opportunity to study the complex interplay among different cardiovascular cell types that drives tissue development and disease. In the area of cardiac tissue models, several sophisticated three-dimensional (3D) approaches use induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) to mimic physiological relevance and native tissue environment with a combination of extracellular matrices and crosslinkers. However, these systems are complex to fabricate without microfabrication expertise and require several weeks to self-assemble. Most importantly, many of these systems lack vascular cells and cardiac fibroblasts that make up over 60% of the nonmyocytes in the human heart. Here we describe the derivation of all three cardiac cell types from iPSCs to fabricate cardiac microtissues. This facile replica molding technique allows cardiac microtissue culture in standard multi-well cell culture plates for several weeks. The platform allows user-defined control over microtissue sizes based on initial seeding density and requires less than 3 days for self-assembly to achieve observable cardiac microtissue contractions. Furthermore, the cardiac microtissues can be easily digested while maintaining high cell viability for single-cell interrogation with the use of flow cytometry and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). We envision that this in vitro model of cardiac microtissues will help accelerate validation studies in drug discovery and disease modeling.

Here, we describe an easy-to-use methodology to generate 3D self-assembled cardiac microtissue arrays composed of pre-differentiated human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells. This user-friendly and low cell requiring technique to generate cardiac microtissues can be implemented for disease modeling and early stages of drug development.

Fabrication de réseaux de microtissus cardiaques 3D à l’aide de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales dérivés de l’iPSC humain

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...