1. MEA Preparazione <ol><li> MEA per l&#39;uso negli esperimenti di elettroporazione possono essere fabbricati usando la tecnica standard di fotolitografia come descritto in precedenza 18 o acquistati direttamente da fornitori di produttori MEA come i sistemi multicanale <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> e Alpha MED Scientific, Inc. <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com)</a> . Le MEA utilizzati nei nostri esperimenti sono stati realizzati in-house presso l&#39;impianto camera pulita in Arizona State University, che è gestito dal Centro per la Ricerca Elettronica dello Stato Solido (CSSER). I MEA utilizzati nei nostri esperimenti avuto 32 elettrodi indio ossido di stagno in un 8 del 4 array con dimensioni elettrodi diametro 50-200 micron all&#39;interno di un vetro 1 cm di diametro interno bene. Bene il vetro è stato incollato sul usando MEA polidimetilsilossano (PDMS). </li><li> Sterilizzare il MEA in autoclave prima cella seeding. Altri metodi di sterilizzazione come un ammollo in 70% etanolo, trattamento UV e trattamento con acqua calda come descritto altrove può anche essere utilizzato fintanto che non compromettere l&#39;integrità del MEA. </li><li> Trasferire il autoclavato MEA di una cappa a flusso laminare e metterla in un piatto polistirene standard sterile Petri. Prima della semina di cellule sulla MEA, sterilizzare la cappa a flusso laminare per accendere la luce UV per 20 min. Se la MEA è sensibile alla luce UV coprire la piastra Petri contenente la MEA con foglio di alluminio sterile mentre la cappa a flusso è sotto illuminazione UV. </li></ol> 2. Cellule semina sul MEA <ol><li> Cellule raccolto da una linea cellulare di esecuzione aderenti cellule di mammifero usando Tripsina / EDTA e alzarle una concentrazione di 100-200 cellule / microlitro in media ml 1 cella per placcatura. Nei nostri esperimenti abbiamo avuto successo nella coltura delle cellule NIH 3T3 fibroblasti linea, linea di cellule HeLa e primari neuroni corticali e ippocampali sulla MEA. </li><li&gt; Mettere a 20-30 ml di goccia media con celle del MEA. Trasferire la piastra di Petri con la MEA per l&#39;incubatore. È importante garantire che la dimensione della goccia cella è sufficiente a coprire tutti gli elettrodi sulla MEA. </li><li> 2 ore dopo la semina delle cellule trasferire la capsula di Petri con la MEA dall&#39;incubatore a cappa a flusso laminare e aggiungere delicatamente 400-500 microlitri di pre supporti riscaldati (37 ° C) al MEA bene. Controllare al microscopio per assicurare che le cellule siano ancora attaccato e distribuito uniformemente sulla superficie MEA. Trasferire il MEA per l&#39;incubatrice. Il periodo di attesa 2 ore prima dell&#39;aggiunta di supporto assicura tempo sufficiente per le cellule di aderire alla superficie MEA. Aggiunta del supporto delle cellule troppo presto dopo la semina le cellule possono lavare via le cellule. Se le cellule non aderiscono sulla MEA, la sua superficie può essere trattata con fattori di adesione cellulare quali aspolylysine, fibronectina e laminina per migliorare l&#39;adesione delle cellule. Nei nostri esperimenti sulle cellule HeLa che di solito trattare la superficie con MEA fibronectin (10 pg / ml) per 1-2 ore. </li><li> 8-12 ore dopo la semina delle cellule, eseguire 1-2 lavaggi con PBS per rimuovere le cellule morte. Medie cellulare può sostituire ogni 24-48 ore, se necessario. In un tipico esperimento, le cellule sono pronte per la trasfezione di solito 24-48 ore dopo la semina. Per mantenere la coerenza in termini di efficienza elettroporazione si consiglia di attendere fino a quando la cultura è almeno l&#39;80% confluenti prima di elettroporazione. </li></ol> 3. Specifici per un sito trasfezione di siRNA <ol><li> Preparare una soluzione di acido nucleico. Per la trasfezione siRNA, preparare una soluzione di 1-2 siRNA pM elettroporazione in tampone ghiacciato elettroporazione per ottenere un volume finale di 200-400 microlitri. In questo articolo il video che dimostrano la trasfezione di cellule HeLa con Alexa 488 coniugato strapazzate sequenza di siRNA. </li><li> Trasferire il MEA con le cellule dal termostato a cappa sterile a flusso laminare. Rimuovere il supporto delle cellule del MEA ed eseguire un lavaggio con PBS. Successivamente, aggiungere 200-400 microlitri della ice freddo 1 pM elettroporazione soluzione siRNA al pozzo. </li><li> Applicare anodici impulsi quadri elettrici agli elettrodi mirati (Fare riferimento al punto 4 per la determinazione dei parametri ottimali di impulso elettrico). Nei nostri esperimenti abbiamo utilizzato un Instruments pragmatiche 2414A generatore di forme d&#39;onda per generare impulsi elettrici e un sistema dual-inline-package (DIP) 16 clip passante di entrare in contatto con i rilievi dei titoli di MEA. Il generatore di forme d&#39;onda può essere connesso alla clip DIP demultiplexor tramite una scheda a circuito stampato per fornire selettività dei singoli elettrodi. Per l&#39;elettrodo di riferimento, posizionare un catodo di acciaio nei media cella. Riducendo l&#39;elettrodo di riferimento acciaio nei media è estremamente importante assicurare che non fa contatto con la superficie MEA. Al contatto, può causare danni alle cellule e il MEA. Si raccomanda di ridurre l&#39;elettrodo di riferimento a una posizione di 1 mm sopra le celle. Un distanziatore con un&#39;altezza di 1 mm può essere posizionato nel pozzo per assistere nel posizionamento del refrimento elettrodo. Un approccio alternativo utilizzando un elettrodo di riferimento esterno è utilizzare elettrodi adiacenti come catodo-anodo coppie. </li><li> Subito dopo l&#39;applicazione degli impulsi elettrici agli elettrodi mirati sulla MEA, trasferire il ritorno alla MEA l&#39;incubatrice. Dopo un periodo di incubazione di 5 minuti, delicatamente sostituire il 75% del tampone di elettroporazione con pre-riscaldato (37 ° C) supporti cellulari. Successivamente, l&#39;imaging fluorescente può essere fatto per confermare la consegna di siRNA fluorescenti etichettato alle cellule. </li></ol> 4. Elettroporazione dei parametri di ottimizzazione <ol><li> Per determinare i parametri ottimali di impulsi elettrici per esperimenti di design elettroporazione, elettroporazione per un intervallo di valori di ampiezza dell&#39;impulso, durata dell&#39;impulso, e il numero di impulsi. Nella nostra esperienza con cellule HeLa, abbiamo osservato che un singolo impulso di tensione di ampiezza da 3 V a 9 V, e la durata di 1 msec a 10 msec per una dimensione di 100 pm elettrodo portato a elettroporazione successo con mila morte delle cellule Nimal. È nostra raccomandazione che un parametro variabile a un tempo e altri sono mantenute costanti. Per quantificare l&#39;efficienza di elettroporazione per ciascuno dei parametri di impulso, usiamo ioduro di propidio (PI), un colorante impermeant cella macchie materiale nucleico, e la metodologia basata assay vivo, come descritto nelle fasi 4,2-4,5. </li><li> Stabilire una coltura cellulare sulla MEA seguendo le indicazioni riportate ai punti 1 e 2. </li><li> Prima di preparare una elettroporazione 300-500 microlitri di 30 ug / ml soluzione PI in tampone ghiacciato elettroporazione e 400 pl di 4 um calcien AM soluzione in PBS. </li><li> Trasferire la MEA dall&#39;incubatore alla cappa a flusso laminare. Rimuovere il supporto delle cellule del MEA ed eseguire un lavaggio con PBS. Successivamente, aggiungere 300-500 microlitri del tampone freddo elettroporazione ghiaccio con PI. </li><li> Applicare impulsi elettrici con ampiezza di pulsazione desiderata e la durata agli elettrodi mirati (Le attrezzature utilizzate nei nostri esperimenti per la generazione e l&#39;applicazione del eletimpulso tric al MEA è descritto nel passaggio 3.3). Per l&#39;elettrodo di riferimento o abbassare un elettrodo di acciaio nel buffer elettroporazione nel MEA pozzo o utilizzare l&#39;elettrodo vicino come riferimento. Selettivamente applicando impulsi di ampiezza variabile o durate di elettrodi diversi esperimenti multipli può essere eseguita sul dispositivo stesso. Per esempio, su un elettrodo MEA 32, 8 esperimenti possono essere eseguiti suddividendo i 32 elettrodi in 8 gruppi, ognuno composto da 4 elettrodi. Ciascuno degli 8 gruppi possono essere stimolato da un singolo impulso rettangolare di durata tensione 5 msec con ampiezze diverse in 3 V-6 gamma V in incrementi di 0,5 V e un gruppo può essere utilizzato come controllo. </li><li> Immediatamente dopo l&#39;applicazione di impulsi di tensione trasferire il MEA per l&#39;incubatore per 5 min. Successivamente, rimuovere delicatamente il 75% del tampone di elettroporazione dal MEA pozzo e sostituirlo con supporti cellulari caldi. Trasferire il MEA per l&#39;incubatrice. </li><li> Dopo un periodo di incubazione di 2-4 hrsostituzione del supporto di cella nella MEA bene con 300-500 ml di 4 mM calceina AM soluzione in PBS. Trasferire il MEA di incubatrice per altri 30 min. </li><li> Dopo l&#39;incubazione delle cellule con calceina AM, sostituire la calceina AM soluzione nel MEA bene con PBS dopo due lavaggi con PBS. Ottenere immagini fluorescenti di cellule utilizzando con un microscopio ottico con filtri per la PI (eccitazione / emissione - 535 nm/617 nm) e calceina AM (eccitazione / emissione - 490 nm/520 nm). L&#39;assorbimento di PI, a causa di elettroporazione, induce le cellule a fluorescenza rossa e la AM Calcein induce le cellule che sono vivi a fluorescenza verde. Tre possibili scenari che si possono osservare sono: 1) cellule elettroporate e vivo (si fluorescenza sia rosso e verde), 2) cellule vive, ma non elettroporate (sarà solo fluorescenza verde) e 3) le cellule morte a causa di elettroporazione (sarà solo fluorescenza rossa) . La vitalità cellulare è stata calcolata come percentuale del numero totale di cellule vive sull&#39;elettrodo e l&#39;eff elettroporazioneiciency è stata calcolata come percentuale del numero totale di cellule caricate con PI / siRNA. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi La figura 1 mostra il sito-specifica caricamento di cellule HeLa con PI. Si può osservare che le cellule solo sull&#39;elettrodo dimostrano un assorbimento di PI (Figura 1B). Un test dal vivo eseguita elettroporazione messaggio è stato utilizzato per valutare la vitalità delle cellule (Figura 1A). L&#39;efficienza elettroporazione e la vitalità cellulare per l&#39;esempio mostrato nella figura 1 sono 81,8% e 96,1% rispettivamente. Vitalità cellulare ed efficienza elettroporazione può essere ottenuto ottimizzando i parametri di impulso di elettroporazione. Sito-specifica trasfezione di cellule HeLa con siRNA fluorescente etichettato per un impulso di elettroporazione ottimizzato (8 V, 1 msec) è mostrato in Figura 2. L&#39;efficienza elettroporazione per il siRNA a 8 V, 1 msec è risultato essere 74,4 ± 16,0% evitalità cellulare è risultato essere 87,9 ± 8,4% (tutti i dati rappresentati come media ± deviazione standard, N = 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" /> Figura 1. Sito-specifica consegna di PI in cellule HeLa su un elettrodo 200 micron (6 V, 5 msec). A) Calcien saggio basato vivo eseguita due ore dopo l&#39;elettroporazione. Cellule vive sono indicati con fluorescenza verde. B) Red fluorescenza dimostra l&#39;assorbimento da parte delle cellule del PI sull&#39;elettrodo. C) Una immagine sovrapposta di A e B. Le frecce bianche indicano cellule che sono elettroporata e vivo. Le frecce nere indicano cellule che sono morti. Il cerchio bianco in A, B e C indica la sagoma dell&#39;elettrodo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" /> Figura 2. Trasfezione di cellule HeLa con scrambl fluorescente etichettatoLa sequenza di siRNA. A) Immagine di cellule HeLa su un elettrodo di 100 um trasfettate con Alexa 488 siRNA tag (8 V, 1 msec). B) Immagine di nuclei di cellule colorate con DAPI. Il cerchio bianco segna il bordo dell&#39;elettrodo.

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G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+electroporation:+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications.">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).</li><li>Boukany, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells.">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo il video che dimostrano l&#39;uso di MEA per il sito-specifica trasfezione di cellule HeLa con strapazzate sequenza di siRNA. Uno dei vantaggi di questa tecnologia è la sua applicabilità a diverse linee cellulari incluse linee cellulari primarie. Il nostro laboratorio ha già dimostrato l&#39;uso di questa tecnologia per il sito-specifica trasfezione di colture primarie neuronali dell&#39;ippocampo di ratto E18 dal giorno di vita e NIH-3T3 strapazzate con sequenze siRNA e GFP plasmide 18, 19.</...

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Cellulari media: Avanzata MEM L-Glutammina 200 mM Penicillina / streptomicina Siero fetale bovino </td><td> Gibco / Invitrogen Himedia Laboratori / VWR Lonza Group Ltd. Gibco / Invitrogen </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> Composizione cella media: 2% FBS, Pennstrep 2% L-glutammina e il 2% in Advance MEM </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 25-053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Alexa 488 e rodamina tagged strapazzate sequrienza siRNA </td><td> Qiagen, Inc. </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> Elettroporazione tampone </td><td> Biorad Laboratories </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> Generatore di forme d&#39;onda </td><td> Pragmatico </td><td> 2414A </td><td> Qualsiasi forma d&#39;onda / generatore di impulsi che può fornire gli impulsi desiderati possono essere utilizzati. </td></tr></table>

high efficiency, site-specific transfection of adherent cells with sirna using microelectrode arrays (mea)

La scoperta della via di RNAi in eucarioti e il conseguente sviluppo di agenti RNAi, come siRNA e shRNA, hanno raggiunto un metodo efficace per mettere a tacere i geni specifici 1-8 per la genomica funzionale e terapie. Una sfida importante coinvolto in studi basati su RNAi è la consegna di agenti RNAi alle cellule bersaglio. Tradizionali non virali tecniche di parto, come l&#39;elettroporazione di massa e metodi di trasfezione chimici spesso non hanno il controllo spaziale necessaria su consegna e permettere l&#39;efficienza di trasfezione poveri 9-12. I recenti progressi nei metodi di trasfezione chimici come lipidi cationici, polimeri cationici e nanoparticelle hanno portato ad efficienze di trasfezione altamente avanzate 13. Tuttavia, queste tecniche ancora non riescono a offrire un controllo preciso dello spazio sulla consegna che possono beneficiare immensamente miniaturizzata tecnologie high-throughput, studi cella singola e le indagini di interazioni cellula-cellula. nt &quot;&gt; I recenti progressi tecnologici nella consegna del gene hanno permesso alta produttività trasfezione di cellule aderenti 14-23, la maggioranza dei quali utilizzano elettroporazione microscala. elettroporazione Microscale offre spazio-temporale preciso controllo di consegna (fino a singole cellule) ed è stato dimostrato per ottenere alte efficienze 19, 24-26. Inoltre, approcci basati elettroporazione non richiedono un lungo periodo di incubazione (tipicamente 4 ore) con complessi siRNA e DNA come necessario in metodi di trasfezione base chimica e causare l&#39;immissione diretta di siRNA nudo e DNA molecole nel citoplasma cellulare. Di conseguenza espressione genica può essere ottenuto fino a sei ore dopo la trasfezione 27. nostro laboratorio ha precedentemente dimostrato l&#39;utilizzo di matrici di microelettrodi (MEA) per sito-specifica trasfezione aderenti in colture cellulari di mammifero 17-19. Nell&#39;approccio basato MEA, la consegna del carico utile genetica avviene tramite localizzato micro-scala electroporatisu di cellule. Una applicazione di impulsi elettrici agli elettrodi selezionati genera locale campo elettrico che conduce alla elettroporazione di cellule presenti nella regione degli elettrodi stimolati. Il controllo indipendente delle micro-elettrodi fornisce controllo spaziale e temporale sopra trasfezione e permette anche esperimenti di trasfezione multipli basati da eseguire sulla stessa cultura aumentando la produttività e riducendo sperimentale cultura a cultura variabilità. Qui si descrive l&#39;apparato sperimentale e il protocollo per la trasfezione mirata di aderenti cellule HeLa con una fluorescente tag criptato siRNA sequenza usando elettroporazione. Lo stesso protocollo può essere utilizzato anche per la trasfezione di vettori plasmidici. Inoltre, il protocollo qui descritto può essere facilmente estesa ad una varietà di linee cellulari di mammifero con modifiche secondarie. Disponibilità commerciale degli accordi ambientali multilaterali con i modelli di elettrodi sia predefiniti e personalizzati rendono questa t accessibile tecnicala maggior parte dei laboratori di ricerca o con attrezzature di base di coltura cellulare.

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High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

L&#39;articolo descrive il protocollo per sito-specifica di transfezione criptato sequenza di siRNA in una coltura cellulare di mammifero aderente utilizzando una matrice di microelettrodi (MEA).

Alta efficienza, sito-specifica trasfezione di cellule aderenti con siRNA mediante matrici microelettrodi (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

high-efficiency-site-specific-transfection-adherent-cells-with-sirna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

13.4K Views.  Arizona State University. L'articolo descrive il protocollo per sito-specifica di transfezione criptato sequenza di siRNA in una coltura cellulare di mammifero aderente utilizzando una matrice di microelettrodi (MEA).

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Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus replication. Here we present the application of this technology to uncovering host targets that specifically modulate the replication of Maraba virus, an oncolytic rhabdovirus, and vaccinia virus with the goal of enhancing therapy. While the protocol has been tested for use with oncolytic Maraba virus and oncolytic vaccinia virus, this approach is applicable to other oncolytic viruses and can also be utilized for identifying host targets that modulate virus replication in mammalian cells in general. This protocol describes the development and validation of an assay for high-throughput RNAi screening in mammalian cells, the key considerations and preparation steps important for conducting a primary high-throughput RNAi screen, and a step-by-step guide for conducting a primary high-throughput RNAi screen; in addition, it broadly outlines the methods for conducting secondary screen validation and tertiary validation studies. The benefit of high-throughput RNAi screening is that it allows one to catalogue, in an extensive and unbiased fashion, host factors that modulate any aspect of virus replication for which one can develop an in vitro assay such as infectivity, burst size, and cytotoxicity. It has the power to uncover biotherapeutic targets unforeseen based on current knowledge.

Here we describe a protocol for employing high-throughput RNAi screening to uncover host targets that can be manipulated to enhance oncolytic virus therapy, specifically rhabodvirus and vaccinia virus therapy, but it can be readily adapted to other oncolytic virus platforms or for discovering host genes that modulate virus replication generally.

Genome-wide RNAi Screening per identificare i fattori ospite che modulano la terapia Virus Oncolytic

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

Farmaco-indotta Sensibilizzazione della ciclasi: L&#39;ottimizzazione del dosaggio e miniaturizzazione per piccole molecole di siRNA e applicazioni di screening

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Bioingegneria

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

Poroso Silicon microparticelle per consegna di siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Immunologia e infezioni

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Biologia

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSIONE per lo screening RNAi in cellule di mammifero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

<meta charset="utf8"></head><body>Metodo TEEI per l'analisi dell'elettroporazione e la previsione della consegna in celle A431

Porous Substrate-Based Electroporation with Transepithelial Electrical Impedance Monitoring

Porous substrate electroporation (PSEP) is an emerging method of electroporation that provides high throughput and consistent delivery. Like many other types of intracellular delivery, PSEP relies heavily on fluorescent markers and fluorescent microscopy to determine successful delivery. To gain insight into the intermediate steps of the electroporation process, a PSEP platform with integrated transepithelial electrical impedance (TEEI) monitoring was developed. Cells are cultured in commercially available inserts with porous membranes. After a 12 h incubation period to allow for the formation of a fully confluent cell monolayer, the inserts are placed in transfection media located in the wells of the PSEP device. The cell monolayers are then subjected to a user-defined waveform, and delivery efficiency is confirmed through fluorescent microscopy. This workflow can be significantly enhanced with TEEI measurements between pulsing and fluorescent microscopy to collect additional data on the PSEP process, and this additional TEEI data is correlated with delivery metrics such as delivery efficiency and viability. This article describes a protocol for performing PSEP with TEEI measurements.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Ottimizzazione dell'elettroporazione del substrato poroso attraverso micro e nanocanali per un monitoraggio avanzato e la caratterizzazione

Porous substrate electroporation (PSEP) pairs consistent, high throughput delivery with high cell viability. Introduction of transepithelial electrical impedance (TEEI) measurements provides insight into the intermediate processes of PSEP and allows for label-free delivery. This article discusses a method for performing PSEP delivery experiments and TEEI measurement analysis simultaneously.

Elettroporazione basata su substrato poroso con monitoraggio dell'impedenza elettrica transepiteliale

Porous substrate electroporation (PSEP) is an emerging method of electroporation that provides high throughput and consistent delivery. Like many other ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

Flusso di lavoro per High-contenuti, Quantificazione singola cella di fluorescenti Marcatori da Universal Microscopio dati, supportati da Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Alta efficienza, sito-specifica trasfezione di cellule aderenti con siRNA mediante matrici microelettrodi (MEA)

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Genome-wide RNAi Screening per identificare i fattori ospite che modulano la terapia Virus Oncolytic

Farmaco-indotta Sensibilizzazione della ciclasi: L'ottimizzazione del dosaggio e miniaturizzazione per piccole molecole di siRNA e applicazioni di screening

Poroso Silicon microparticelle per consegna di siRNA Therapeutics

Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

L'utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull'espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

EsiRNA MISSIONE per lo screening RNAi in cellule di mammifero

Elettroporazione basata su substrato poroso con monitoraggio dell'impedenza elettrica transepiteliale

Elettroporazione basata su substrato poroso con monitoraggio dell'impedenza elettrica transepiteliale

Elettroporazione basata su substrato poroso con monitoraggio dell'impedenza elettrica transepiteliale

Flusso di lavoro per High-contenuti, Quantificazione singola cella di fluorescenti Marcatori da Universal Microscopio dati, supportati da Open Source Software