1. MEA הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MEAs לשימוש בניסויי electroporation או יכול להיות מפוברק באמצעות טכניקת photolithography סטנדרטית כפי שתואר לעיל 18 או לרכוש ישירות מספקים של יצרני MEA כגון מערכות מרובות ערוצים <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> ואלפא MED מדעי, Inc <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com).</a> את MEAs משמש בניסויים שלנו היו מפוברק בתוך הבית במתקן החדר הנקי באוניברסיטת אריזונה, המנוהלת על ידי המרכז למחקר האלקטרוניקה של מצב מוצק (CSSER). את MEAs משמש בניסויים שלנו היה 32 אלקטרודות תחמוצת אינדיום בדיל ב8 על ידי 4 מערך עם גדלי קוטר אלקטרודה 50-200 מיקרומטר בתוך זכוכית 1 סנטימטר קוטר פנימית טובה. הזכוכית גם הייתה קשורה בMEA באמצעות polydimethylsiloxane (PDMS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר MEA בחיטוי לפני התא שלeeding. שיטות אחרות של עיקור כגון השריה באתנול 70%, טיפול בקרינת UV וטיפול במים חם כמתואר במקום אחר יכולים לשמש גם כזמן הם לא מתפשרים על היושרה של MEA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת MEA autoclaved למכסה מנוע זרימה למינרית ומניח אותו בצלחת פטרי סטנדרטית סטרילי קלקר. לפני זריעת תאים בMEA, לעקר את מכסה מנוע הזרימה למינרית ידי הפעלת אור UV במשך 20 דקות. אם MEA הוא רגיש לאור UV לכסות את צלחת פטרי המכילה MEA ברדיד האלומיניום סטרילי תוך מכסה מנוע הזרימה הוא תחת תאורת UV. </li></ol> 2. תאי זריעה על MEA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי אסיף משורת תאי הפעלה של תאי יונקי חסיד באמצעות טריפסין / EDTA ולהעלות אותם לריכוז של 100-200 תאים / μl ב1 תקשורת סלולרית מ&quot;ל לציפוי. בניסויים שלנו היינו מוצלח בקו culturing NIH 3T3 fibroblasts תא, שורת תאי הלה ונוירונים בקליפת מוח וההיפוקמפוס עיקריים על MEA. </li><li&gt; הנח טיפת 20-30 μl של תקשורת עם תאים בMEA. להעביר את צלחת פטרי עם MEA לחממה. חשוב לוודא שגודל טיפת התא הוא גדול מספיק כדי לכסות את כל אלקטרודות על MEA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 שעות לאחר זריעת התאים להעביר את צלחת פטרי עם MEA מהחממה למכסה מנוע זרימה למינרית ועדינות להוסיף μl 400-500 של תקשורת חממה מראש (37 ° C) לMEA היטב. בדקו מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שתאים עדיין מחוברים ובאופן שווה על משטח MEA. להעביר בחזרה MEA לחממה. תקופת ההמתנה 2 שעות לפני התוספת של תקשורת מבטיחה מספיק זמן לתאים לדבוק עם משטח MEA. בנוסף לתקשורת סלולרית מוקדם מדי לאחר זריעת התאים יכול לשטוף את התאים. אם תאים אינם דבקים גם בMEA, פני השטח שלו יכולים להיות מטופלים עם גורמי התקשרות סלולרית aspolylysine כזה, פיברונקטין, וlaminin כדי לשפר את הידבקות תא. בניסויי תא הלה אנו בדרך כלל טיפול במשטח MEA עם fibronectin (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) עבור 1-2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 8-12 שעות לאחר זריעת התאים, לבצע 1-2 שטיפות עם PBS כדי להסיר את כל תאים מתים. מדיום סלולרי יכול להחליף כל 24-48 שעות לפי צורך. בניסוי טיפוסי, התאים הם בדרך כלל מוכנים ל24-48 שעות לאחר transfection זריעה. כדי לשמור על עקביות ביעילות electroporation מומלץ להמתין עד שהתרבות היא לפחות 80% confluent לפני electroporation. </li></ol> 3. Transfection אתר ספציפי של siRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסת חומצת גרעין. לtransfection siRNA, להכין פתרון electroporation siRNA מיקרומטר 1-2 במאגר electroporation קרח קר כדי להשיג נפח סופי של 200-400 μl. במאמר זה אנו מדגימים וידאו transfection של תאי הלה עם מקושקש רצף מצומדת Alexa 488 של siRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת MEA עם תאים מן החממה למכסה מנוע זרימה למינרית סטרילי. הסר את התקשורת הסלולרית מMEA ולבצע שטיפה עם PBS. לאחר מכן, להוסיף 200-400 μl שליפתרון ספירה קרה 1 מיקרומטר siRNA electroporation לטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פולסים חשמליים רבועים anodic את האלקטרודות הממוקדת (עיין בשלב 4 לקביעת פרמטרים אופטימליים של פולס החשמלי). בניסויים שלנו השתמשנו במכשירים פרגמטיים מחולל צורת הגל 2414A ליצור פולסים חשמליים ו- חבילה כפולה מוטבעת (מח&quot;ש) 16 קליפ סיכה ליצור קשר עם מגיני אג&quot;ח MEA. מחולל צורת הגל יכול להיות מחובר לקליפ מח&quot;ש באמצעות לוח מעגל מודפס demultiplexor לספק הסלקטיביות של אלקטרודות הבודדה. לאלקטרודה ההשוואתית, הנח קתודת פלדה בתקשורת הסלולרית. תוך הפחתת אלקטרודה השוואתי פלדה בתקשורת זה מאוד חשוב כדי לוודא שהוא לא עושה את המגע עם פני שטח MEA. עם הקשר, זה יכול לגרום לניזק לתאים ומאה. מומלץ להוריד את האלקטרודה ההתייחסות למיקום של 1 מ&quot;מ מעל לתאים. Spacer עם גובה של 1 מ&quot;מ ניתן להציב גם לסייע בהשמה של השופטהאלקטרודה העדפות. גישה חלופית לשימוש באלקטרודה הפניה חיצונית היא להשתמש באלקטרודות שכנות כמו זוגות קתודה-האנודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר החלה בפולסים החשמליים לאלקטרודות הממוקדת על MEA, להעביר בחזרה MEA לחממה. לאחר תקופת דגירה של 5 דקות, בעדינות להחליף 75% ממאגר electroporation עם (37 ° C) תקשורת סלולרית מראש טריה. מאוחר יותר, ניאון הדמיה ניתן לעשות כדי לאשר את המשלוח של siRNA מתויג fluorescently לתאים. </li></ol> 4. אופטימיזציה של פרמטרי electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את הפרמטרים החשמליים דופק האופטימליים לelectroporation, ניסויי electroporation עיצוב לטווח ערכים של משרעת דופק, דופק משך הזמן, ומספר הפעימות. מניסיוננו עם תאי הלה, שהבחנו כי דופק יחיד מתח של משרעת מ 3 עד 9 הוולט V, ומשך זמן מיום 1 באלפיות עד 10 אלפית לגודל של 100 מיקרומטר האלקטרודה הוביל לelectroporation המוצלח עם מייליםמוות של תאים nimal. ההמלצה שלנו הוא שפרמטר אחד להיות מגוון בזמן ואחרים נשארים קבוע. כדי לכמת את יעילות electroporation לכל אחד מהפרמטרים הדופקים, אנחנו משתמשים ביודיד propidium (PI), צבע impermeant תא שכתמי חומר גרעין, ומתודולוגיה מבוססת assay חייה, כפי שמתואר בצעדים 4.2-4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים תרבית תאים בMEA ביצוע ההוראות המפורטות בשלבי 1 ו 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני electroporation להכין 300-500 μl של פתרון PI מ&quot;ל 30 מיקרוגרם / במאגר electroporation קר כקרח ו400 μl של 4 מיקרומטר calcien AM פתרון ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת MEA מהחממה למכסה מנוע הזרימה למינרית. הסר את התקשורת הסלולרית מMEA ולבצע שטיפה עם PBS. לאחר מכן, להוסיף 300-500 μl למאגר electroporation הקר כקרח עם בלש פרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פולסים חשמליים עם משרעת דופק רצוי ואת משך זמן לאלקטרודות הממוקדות (ציוד המשמש בניסויים שלנו ליצירה ויישום elecדופק tric לMEA מתואר בשלב 3.3). לאלקטרודה ההשוואתית להנמיך האלקטרודה פלדה למאגר electroporation בMEA היטב או להשתמש באלקטרודה השכנה כהפניה. על ידי יישום סלקטיבי פולסים של אמפליטודות או משכים שונים לאלקטרודות שונות ניסויים מרובים יכולים להתבצע באותו המכשיר. לדוגמה, על האלקטרודה MEA 32, 8 ניסויים יכולים להתבצע על ידי פיצול 32 אלקטרודות ב8 קבוצות, כל אחד בהיקף של 4 אלקטרודות. כל אחד 8 קבוצות אז יכול להיות מגורה על ידי דופק יחיד מלבני מתח של משך 5 אלפיות עם עוצמות המשתנות בטווח 3 V V-6 במרווחים של 0.5 V וקבוצה אחת יכול לשמש כביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר החלת פולסי המתח להעביר MEA לחממה למשך 5 דקות. לאחר מכן, בעדינות להסיר 75% ממאגר electroporation מMEA היטב ולהחליף אותו בתקשורת סלולרית החמה. להעביר בחזרה MEA לחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת דגירה של 2-4 שעותלהחליף את התקשורת הסלולרית בMEA היטב עם 300-500 μl של 4 מיקרומטר Calcein AM הפתרון ב PBS. להעביר בחזרה MEA לחממה עבור 30 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה של התאים עם Calcein הבוקר, להחליף Calcein AM פתרון בMEA היטב עם PBS לאחר שתי שטיפות עם PBS. להשיג תמונות ניאון של תאים באמצעות עם מיקרוסקופ אופטי עם פילטרים לצרכן (עירור / פליטה - 535 nm/617 ננומטר) וCalcein הבוקר (עירור / פליטה - 490 nm/520 ננומטר). הספיגה של PI, בשל electroporation, גורמת לתאים לזרוח אדומים וCalcein הבוקר גורם לתאים הנמצאים בחיים כדי לזרוח ירוק. שלושה תרחישים אפשריים שניתן לצפות הם 1) סלולריים electroporated וחיים (יהיה לזרוח גם אדום וירוק), 2) תאים בחיים אבל לא electroporated (יהיה לזרוח רק ירוק) ו3) תאים עקב electroporation מתים (יהיו לזרוח רק אדום) . כדאיויות התא הייתה מחושבת כאחוז מהמספר הכולל של תאי חיים על האלקטרודה וEFF ​​electroporationiciency חושב כאחוזים מהמספר הכולל של תאים העמוסים PI / siRNA. </li></ol> 5. נציג תוצאות איור 1 מציג את טעינת אתר הספציפית של תאי הלה עם בלש פרטי. זה יכול להיות ציין כי תאים יחידים על האלקטרודה להפגין ספיגה של PI (1B איור). Assay חיה המבוצע electroporation הודעה שמש להערכת הכדאיות של תאים (איור 1 א). יעילות electroporation וכדאיויות תא לדוגמה שמוצגת באיור 1 הם 81.8% ו96.1% בהתאמה. כדאיויות תא גבוהות ויעילות electroporation ניתן להשיג על ידי אופטימיזציה של פרמטרי דופק electroporation. transfection אתר ספציפי של תאי הלה עם siRNA מתויג fluorescently לדופק electroporation אופטימיזציה (8 V, 1 msec) מוצג באיור 2. יעילות electroporation לsiRNA בשעת 8 V, 1 msec נמצאה 74.4 ± 16.0% וכדאיויות תא נמצאו 87.9 ± 8.4% (כל הנתונים המיוצגים כמתכוון ± סטיית תקן, N = 5). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" /> איור 1. מסירת אתר ספציפי של צרכן בתאי הלה על האלקטרודה 200 מיקרומטר (6 V, 5 אלפיות השני). ) Calcien assay החי המבוסס בוצע electroporation הודעת שעות 2. תאי חיים מסומנים באמצעות פלואורסצנטי ירוקה. B) האדום פלואורסצנטי מדגים את הספיגה של PI על ידי תאים באלקטרודה. ג) תמונה של גבי וB. החיצים הלבנים מצביעה על תאים שelectroporated וחיים. החיצים השחורים מצביעים על תאים שמתו. העיגול הלבן ב, B ו-C מציין את קווי המתאר של האלקטרודה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" /> איור 2. Transfection של תאי הלה עם scrambl מתויג fluorescentlyרצף דואר של siRNA. א) תמונה של תאי הלה על האלקטרודה 100 מיקרומטר transfected עם אלכסה siRNA מתויג 488 (8 V, 1 אלפיות). B) תמונה של גרעיני תאים מוכתם בDAPI. העיגול הלבן מסמן את הקצה של האלקטרודה.

<ol>
	<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+gene+expression+by+small+double-stranded+RNAs+in+invertebrate+and+vertebrate+systems.">Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742 (2001).</li><li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550 (2002).</li><li>Lee, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+small+interfering+RNAs+targeted+against+HIV-1+rev+transcripts+in+human+cells.">Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).</li><li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3'+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells.">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li><li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells.">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li><li>Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA-mediated+gene+silencing+in+vitro+and+in+vivo.">siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).</li><li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA.">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15, 1311 (1987).</li><li>Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection:+a+highly+efficient,+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure.">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413 (1987).</li><li>Raptis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=applications+of+electroporation+of+adherent+cells+in+situ,+on+a+partly+conductive+slide.">applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide.</a> Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+mammalian+cells:+optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation.">Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).</li><li>Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+on+siRNA+delivery+with+nonviral+carriers.">Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1017 (2011).</li><li>Ziauddin, J., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarrays+of+cells+expressing+defined+cDNAs.">Microarrays of cells expressing defined cDNAs.</a> Nature. 411, 107-110 (2001).</li><li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+gene+transfer+by+electroporation+into+adherent+cells+on+plasmid+DNA-loaded+electrodes.">Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes.</a> Nucleic Acids Res. 32, e187 (2004).</li><li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-Layer+Assembly+of+Poly+(ethyleneimine)+and+Plasmid+DNA+onto+Transparent+Indium?+Tin+Oxide+Electrodes+for+Temporally+and+Spatially+Specific+Gene+Transfer.">Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer.</a> Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsystem+for+transfection+of+exogenous+molecules+with+spatio-temporal+control+into+adherent+cells.">Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells.</a> Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-chip+for+spatially+controlled+transfection+of+nucleic+acid+payloads+into+cells+in+a+culture.">Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture.</a> Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+array+(MEA)+platform+for+targeted+neuronal+transfection+and+recording.">Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording.</a> Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).</li><li>Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+introduction+of+nucleic+acids+into+mammalian+cells+grown+in+microwell+arrays.">Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).</li><li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+high-throughput+electroporation+microchip+applicable+for+siRNA+delivery.">An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery.</a> Lab Chip. 11, 163-172 (2010).</li><li>Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+high-throughput+electroporation+chips.">Efficient and high-throughput electroporation chips.</a> , (2011).</li><li>Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+electroporation+of+surface-bound+siRNAs+in+microwell+arrays.">In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays.</a> Lab Chip. 12, 939-947 (2012).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo.">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li><li>Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-induced+gene+silencing+by+local+electroporation+in+targeting+brain+region.">RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region.</a> J. Neurophysiol. 93, 594 (2005).</li><li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+electroporation:+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications.">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).</li><li>Boukany, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells.">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

במאמר זה וידאו שמדגימים את שימוש MEA לtransfection אתר ספציפי של תאי הלה עם מקושקש רצף של siRNA. אחד היתרונות של טכנולוגיה זו היא תחולתו לשורות תאים שונות, כוללים שורות תאים ראשוניות. המעבדה שלנו הוכיחה בעבר את השימוש בטכנולוגיה זו לtransfection אתר ספציפי של התרבות העצבית ביפוקמפוס...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> תקשורת סלולרית: המתקדם MEM L-גלוטמין 200 מ&quot;מ פניצילין / סטרפטומיצין סרום שור עוברי </td><td> Gibco / Invitrogen Himedia מעבדות / VWR Lonza הקבוצה בע&quot;מ Gibco / Invitrogen </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> הרכב תא תקשורת: 2% FBS, 2% L-גלוטמין ו% 2 בPennstrep המתקדם MEM </td></tr><tr><td> טריפסין EDTA </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 25-053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Alexa 488 וrhodamine מתויג מקושקש sequsiRNA ence </td><td> Qiagen, Inc </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> מאגר electroporation </td><td> מעבדות Biorad </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> הגל גנרטור </td><td> פרגמטי </td><td> 2414A </td><td> כל גל / מחולל פעימות שיכולות לספק את הקטניות הרצויות יכול להיות בשימוש. </td></tr></table>

high efficiency, site-specific transfection of adherent cells with sirna using microelectrode arrays (mea)

הגילוי של מסלול RNAi באאוקריוטים והפיתוח הבא של סוכני RNAi, כגון siRNA וshRNA, השיג שיטה רבה עצמה להשתקת גנים מסוימים 1-8 לגנומיקה ותרופות תפקודיות. אתגר גדול המעורבים במחקרים מבוססים RNAi הוא המסירה של סוכני RNAi לתאים ממוקדים. טכניקות מסורתיות שאינן נגיפיות משלוח, כגון electroporation בתפזורת ושיטות transfection כימיים לעתים קרובות חוסר השליטה במרחב הנחוצה על משלוח ולהרשות יעילות transfection עניה 9-12. התקדמות בשיטות transfection כימיות כגון שומני קטיוני, פולימרי קטיוני חלקיקים הביאה ליעילות transfection משופרת מאוד 13. עם זאת, שיטות אלו עדיין לא הצליחו להציע שליטה מרחבית מדויקת במסירה שמאוד יכולים להועיל מיניאטורי טכנולוגיות תפוקה גבוהה, מחקרי תא בודדים וחקירות של אינטראקציות תא סלולרי. nt &quot;&gt; ההתקדמות טכנולוגית האחרונה במסירת הגן אפשר transfection תפוקה גבוהה של תאי חסיד 14-23, רובם משתמשים electroporation microscale. electroporation microscale מציע שליטה זמנית spatio מדויקת במסירה (עד תאים בודדים) והוכח כדי להשיג יעילות גבוהה, 19 24-26. בנוסף, גישות מבוססות electroporation אינן דורשות תקופה ממושכת של דגירה (בדרך כלל 4 שעות) עם קומפלקסי siRNA וה-DNA לפי צורך בשיטות transfection מבוססות כימיות ולגרום לכניסה ישירה של siRNA וDNA עירום מולקולות לתוך הציטופלסמה התא. כביטוי גני תוצאה יכולות להיות מושגת כבר בשש שעות לאחר transfection 27. המעבדה שלנו הוכיחה את השימוש במערכי microelectrode (MEA) עבור transfection אתר ספציפי בתרביות של תאי יונקי חסיד 17-19 בעבר. בגישה המבוססת MEA, מסירת המטען גנטי מושגת באמצעות electroporati המקומי מייקרו בקנה מידהבתאים. יישום של פולס חשמלי לאלקטרודות נבחרת יוצר שדה חשמלי מקומי שמוביל לelectroporation נוכחיים בתאים באזור של אלקטרודות מגורה. השליטה העצמאית של אלקטרודות מייקרו מספקת שליטת מרחב ובזמן על transfection וגם מאפשרת ניסויים מבוססים transfection מרובים להתבצע על אותה תרבות הגדלת התפוקה וההפחתה הניסיונית השתנות תרבות לתרבות. כאן אנו מתארים התקנה הניסיונית ופרוטוקול transfection הממוקד של תאי הלה חסיד עם siRNA מתויג fluorescently מקושקש רצף באמצעות electroporation. אותו פרוטוקול יכול לשמש גם עבור transfection של וקטורי פלסמיד. בנוסף, הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להרחיב בקלות למגוון רחב של שורות תאי יונקים עם שינויים קלים. זמינות מסחרית של MEAs עם דפוסים אלקטרודה מראש מוגדרים והן מותאמים אישית להפוך לא נגיש טכניקה זומעבדות o רוב המחקר עם ציוד תרבית תאים בסיסי.

Watch this Scientific Journal Video about High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA at JoVE.com

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

את פרטי מאמר פרוטוקול transfection ספציפי לאתר של מקושקש רצף של siRNA בתרבית תאי יונקים חסידה באמצעות מערך microelectrode (MEA).

יעילות גבוהה Transfection, אתר ספציפי של תאים חסידים עם siRNA שימוש במערכי microelectrode (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

high-efficiency-site-specific-transfection-adherent-cells-with-sirna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

13.4K Views.  Arizona State University. את פרטי מאמר פרוטוקול transfection ספציפי לאתר של מקושקש רצף של siRNA בתרבית תאי יונקים חסידה באמצעות מערך microelectrode (MEA).

Video: High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

משלוח ין transfection ב אדם בתאי סרטן הלבלב באמצעות גורם גדילה עוריות קולטן במיקוד לטין מבוסס Nanovectors מתוכנן

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &amp;#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

הנדסת חיידקי חסיד ידי יצירת Curli אופרון סינטטי יחיד

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

הנקבובי הסיליקון microparticles למשלוח Therapeutics siRNA

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects. 
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

משלוח siRNA טיפולית על מערכת העצבים המרכזית באמצעות קטיוני anionic ליפוזומים

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

הערכה מקיפה של היעילות והבטיחות של משלוח סמים, ממוקדות השליה באמצעות שלוש שיטות משלימות

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of electrophysiological activity for long periods. However, the property of sensing signals from all sources around every microelectrode can become unfavorable when trying to understand communication and signal propagation in neuronal circuits. In a neuronal network, several neurons can be simultaneously activated and can generate overlapping action potentials, making it difficult to discriminate and track signal propagation. Considering this limitation, we have established an in vitro setup focused on assessing electrophysiological communication, which is able to isolate and amplify axonal signals with high spatial and temporal resolution. By interfacing microfluidic devices and MEAs, we are able to compartmentalize neuronal cultures with a well-controlled alignment of the axons and microelectrodes. This setup allows recordings of spike propagation with a high signal-to-noise ratio over the course of several weeks. Combined with specialized data analysis algorithms, it provides detailed quantification of several communication related properties such as propagation velocity, conduction failure, firing rate, anterograde spikes, and coding mechanisms.
This protocol demonstrates how to create a compartmentalized neuronal culture setup over substrate-integrated MEAs, how to culture neurons in this setup, and how to successfully record, analyze and interpret the results from such experiments. Here, we show how the established setup simplifies the understanding of neuronal communication and axonal signal propagation. These platforms pave the way for new in vitro models with engineered and controllable neuronal network topographies. They can be used in the context of homogeneous neuronal cultures, or with co-culture configurations where, for example, communication between sensory neurons and other cell types is monitored and assessed. This setup provides very interesting conditions to study, for example, neurodevelopment, neuronal circuits, information coding, neurodegeneration and neuroregeneration approaches.

This protocol aims to demonstrate how to combine in vitro microelectrode arrays with microfluidic devices for studying action potential transmission in neuronal cultures. Data analysis, namely the detection and characterization of propagating action potentials, is performed using a new advanced, yet user-friendly and freely available, computational tool.

התממשקות מיקרופלואידיקה עם מערכים Microelectrode ללמוד תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural underpinnings of brain disease and injury. As electrodes are miniaturized to the scale of individual cells, a corresponding rise in the interface impedance limits the quality of recorded signals. Additionally, conventional electrode materials are stiff, resulting in a significant mechanical mismatch between the electrode and the surrounding brain tissue, which elicits an inflammatory response that eventually leads to a degradation of the device performance. To address these challenges, we have developed a process to fabricate flexible microelectrodes based on Ti3C2 MXene, a recently discovered nanomaterial that possesses remarkably high volumetric capacitance, electrical conductivity, surface functionality, and processability in aqueous dispersions. Flexible arrays of Ti3C2 MXene microelectrodes have remarkably low impedance due to the high conductivity and high specific surface area of the Ti3C2 MXene films, and they have proven to be exquisitely sensitive for recording neuronal activity. In this protocol, we describe a novel method for micropatterning Ti3C2 MXene into microelectrode arrays on flexible polymeric substrates and outline their use for in vivo micro-electrocorticography recording. This method can easily be extended to create MXene electrode arrays of arbitrary size or geometry for a range of other applications in bioelectronics and it can also be adapted for use with other conductive inks besides Ti3C2 MXene. This protocol enables simple and scalable fabrication of microelectrodes from solution-based conductive inks, and specifically allows harnessing the unique properties of hydrophilic Ti3C2 MXene to overcome many of the barriers that have long hindered the widespread adoption of carbon-based nanomaterials for high-fidelity neural microelectrodes.

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

We describe here a method for fabricating Ti3C2 MXene microelectrode arrays and utilizing them for in vivo neural recording.

הייצור של Ti3C2 Mxene מערכים מיקרואלקטרודה בVivo הקלטה עצבית

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided a unique opportunity to study the complex interplay among different cardiovascular cell types that drives tissue development and disease. In the area of cardiac tissue models, several sophisticated three-dimensional (3D) approaches use induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) to mimic physiological relevance and native tissue environment with a combination of extracellular matrices and crosslinkers. However, these systems are complex to fabricate without microfabrication expertise and require several weeks to self-assemble. Most importantly, many of these systems lack vascular cells and cardiac fibroblasts that make up over 60% of the nonmyocytes in the human heart. Here we describe the derivation of all three cardiac cell types from iPSCs to fabricate cardiac microtissues. This facile replica molding technique allows cardiac microtissue culture in standard multi-well cell culture plates for several weeks. The platform allows user-defined control over microtissue sizes based on initial seeding density and requires less than 3 days for self-assembly to achieve observable cardiac microtissue contractions. Furthermore, the cardiac microtissues can be easily digested while maintaining high cell viability for single-cell interrogation with the use of flow cytometry and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). We envision that this in vitro model of cardiac microtissues will help accelerate validation studies in drug discovery and disease modeling.

Here, we describe an easy-to-use methodology to generate 3D self-assembled cardiac microtissue arrays composed of pre-differentiated human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells. This user-friendly and low cell requiring technique to generate cardiac microtissues can be implemented for disease modeling and early stages of drug development.

ייצור מערכי מיקרוטיסו לב תלת-ממדיים באמצעות קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם ב-IPSC, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...