نشكر الدكتور اسحق Oschry والدكتور آصف أوريت ساغي، لمساعدتهم مع FACS الفرز. وأيد هذا البحث من المنح لNE من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) تحت اتفاقية المنحة رقم [276890]، من جمعية السرطان إسرائيل (# 20110078)، وصندوق إسرائيل من بحوث السرطان (بحوث شهادة جائزة التنمية).

1. تشريح الأنسجة الثديية أو الجلد من الفئران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تشريح الأنسجة المطلوب من الفئران، وإعداد اللوازم والكواشف بعد: اللوازم: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدوات جراحة (غسلها بالمنظفات وتراجع بعد ذلك في الايثانول 70٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الستايروفوم سطح للراحة خلال الماوس على تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبابيس أو الإبر لعقد الفئران خلال تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عاء زجاجي مع غطاء لعملية الهضم، التي تحتوي على قضيب تحريك مغناطيسي (تعقيمها). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمام الماء عند 37 ° C، تحتوي على النمام المغناطيسي الغاطسة وكمية كافية من الماء لغمر الجرة الهضم، في حين يستريح على لوحة ضجة. </li></ul> الكواشف: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FACS العازلة I: (4 ° C): الفوسفات مخزنة المالحة في Dulbecco CMF (المغنيسيوم الكالسيوم مجاني) + 0.5٪ BSA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كولاجيناز الحل (على الفور قبل الاستخدام): 0.05 غ كولاجيناز II 0.05 غ كولاجيناز IV 0.01 جرام ديوكسي ريبونيوكلياز 20مل العازلة FACS I. نضع الحل كولاجيناز على الجليد حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PharmLyse (الكاشف الأمونيوم كلوريد Lysing). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخزين المؤقت للفوسفات Dulbecco المالحة CMF + 1٪ FCS: FACS العازلة II. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الغدد الثديية (انظر أيضا 17). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء إناث الفئران باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون (CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على سطح الستايروفوم، ضع الماوس على ظهرها ويعلقون بقوة جميع الأطراف الأربعة باستخدام الإبر قياس 25 (الشكل 1A). رش بسخاء الماوس مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط، سحب ما يصل الجلد في البطن في خط الوسط وجعل شق صغير مع مقص حاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا من شق، قطع الجلد تصل إلى عنق الحيوان مع تجنب ثقب تجاويف البطن أو الصدر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الجلد على الأرجل الخلفية من شق خط الوسط نحو المحطة، مما أدى إلى &quot;شكل Y&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الجلد بعيدا عن الجسم الماوس وماهيتها، وفضحالغدد الثديية تعلق على الجانب السفلي من الجلد (1B الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام Q-نصائح لفصل بلطف الجلد من الغدد الثديية في حين خفض الأنسجة حرف عطف مع مقص حاد صغير لفصل الغدة الثديية نحو العمود الفقري من الفأرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغدد البطن (# 4، 5) هي أفضل لهذا البروتوكول. يمكنك أيضا استخدام الغدة الثديية 2 الثانية، ولكن نأخذ في الاعتبار أن تقع هذه الغدد في تشريحيا مقربة من العضلة الصدرية التي قد يكون من الصعب فصل، مما أدى إلى خلايا المنشأ الأنسجة المختلطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: عند تشريح أنسجة الورم، فمن المستحسن لإزالة المناطق نخرية. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الأنسجة الجلدية: أسهل طريقة للحصول على أنسجة الجلد، دون الحاجة إلى التعامل مع إزالة الشعر هو استخدام ميكي ماوس. إذا كنت بحاجة لكمية أكبر من النسيج، يمكنك يحلق الشعر من الجذع الماوس وتشريح الجلد. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران باستخدام CO 2 طnhalation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص حاد، وقطع الأذنين ومكان على الفور في جرة تحتوي على الهضم وحدة تخزين صغيرة (~ 0.5 مل) من PBS على الجليد. </li></ul></li></ol> 2. الغدة الثديية إعداد / الجلد تعليق خلية واحدة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الغدد الثديية / الجلد في جرة تحتوي على الهضم وحدة تخزين صغيرة من PBS على الجليد. إذا الأنسجة الدموية هو غسل X2 مع PBS، ومن ثم تجاهل PBS الزائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المفروم جيدا مع مقص منحني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة (ملاحظة: هذه الكمية من حل كولاجيناز سوف تنأى بكفاءة حوالي 5 غرام من الأنسجة الثديية أو ورم وآذان من ما يصل الى 15 الفئران) 20 مل حل كولاجيناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة على الفور تحريك في 37 ° C حمام مائي، واحتضان لمدة 15 دقيقة مع التحريك بمعدل المتوسطة. </li></ul> ملاحظة: أوقات الحضانة الأمثل قد تختلف إذا هضم الأنسجة الأخرى. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوقف رد الفعل، إضافة 30 مل الباردة DMEM + 10٪ FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سترافي خليط الأنسجة / وسائل الإعلام من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر وضعت على رأس أنبوب مخروطي 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في أنبوب مخروطي لمدة 5 دقائق في 450 XG في 4 درجات مئوية. </li></ul> 3. أحمر الدم خلايا يزيس ملاحظة: هذه الخطوة غير ضرورية إذا كانت الفئران القلب perfused مع PBS قبل التضحية بها. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف باستخدام ماصة الزجاج تعلق على فراغ، دون الإخلال بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لليز RBC، إعادة تعليق بيليه الخلية في 10 مل حل PharmLyse واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحييد الحل PharmLyse عن طريق إضافة ما يقرب من 40 مل من FACS العازلة I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في أنبوب مخروطي مع الخلايا لمدة 5 دقائق في 450 XG في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف. </li></ul> 4. حظر لنادي الذاتية <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: خلايا العد لتحديد حجم مناسب للخطوات التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا في إعادة تعليق1-3 مل العازلة FACS I (اعتمادا على عدد الخلايا، وكمية من الأجسام المضادة التي تريد استخدامها). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة FcBlock (الماوس المضادة للCD16/CD32) لتصل إلى 1:50 التخفيف (10 ميكروغرام / مل)، واحتضان على الجليد لمدة 10-20. لا حاجة لغسل قبالة FcBlock. </li></ul> 5. تلطيخ <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخراج 100 ميكرولتر مأخوذة لأنابيب إيبندورف لاستخدامها كعنصر تحكم من الامم المتحدة والملون والضوابط لون واحد (وفقا لعدد من الأجسام المضادة الفلورسنت المستخدمة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتسمية الخلايا الليفية: إضافة المضادة للPDGFRα (مترافق مباشرة إلى fluorophore) إلى التخفيف من 1:50 (10 ميكروغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتسمية السكان الخلية الأخرى (الخلايا المناعية مثل الخلايا البلعمية، الخلايا البطانية الخ): إضافة أجسام مضادة مناسبة مترافق fluorescently إلى علامات السطحية، إلى تخفيف 1:50. </li></ul> ملاحظة: على الرغم من PDGFRα هو علامة قوية لالليفية، فمن المستحسن أن تدرج الأجسام المضادة للخلايا المناعية والخلايا الظهارية في ORDإيه لاستبعاد أي ضعف سكان الإيجابية وبالتالي تعزيز نقاء الخلايا الليفية معزولة. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة لكل من لون واحد السيطرة أنابيب إيبندورف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا الأجسام المضادة مع ل1 ساعة على الجليد في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لغسل: ملء الأنابيب العازلة FACS مع الأول وتدور لمدة 5 دقائق في 450 XG في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف، resuspend في الخلايا FACS العازلة الأول لتركيز حوالي 2 × 6 10 خلايا / مل، أو أيهما أنسب تركيز لفرز مع فارز الخاص FACS المتاحة. </li></ul> اختياري: يمكن معلق الخلايا في FACS العازلة II لمدة الفرز. هذا قد تحسين بقاء الخلية. ومع ذلك، قد تعرض إلى عوامل في مصل الدم لديهم تأثير التعبير الجيني، والتي ينبغي اختبار، وأخذها في الاعتبار. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا المسمى في أنابيب FACS مع فلتر الأعلى: الخلايا في أنابيب التصفية لمنع كتل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبعاد الخلايا الميتةق، إضافة 7AAD (0.5 ميكروغرام / مل) أو Propidium يوديد (PI) لعينات (باستثناء لسيطرة الامم المتحدة الملطخة). </li></ul> ملاحظة: لتجنب إضاعة الخلايا، يمكنك إضافة إلى 7AAD/PI عينة من الامم المتحدة والملون بعد أن سجل في FACS، واستخدام مرة أخرى كما 7AAD فقط السيطرة. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الجليد بينما عينات تحليل. </li></ul> 6. عزل الخلايا عن طريق FACS (ملاحظة: هذا الجزء من البروتوكول يتطلب معرفة سابقة في تشغيل فارز FACS، على سبيل المثال BD AriaII FACS، أو المساعدة من فني المهرة). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام برنامج فارز FACS (BD FACSDiva)، وإعداد المخططات التحليل المناسب لتحليل مبعثر إلى الأمام (FSC)، مبعثر الجانب (SSC)، 7AAD، FITC، PE وأي fluorophore الأخرى المستخدمة لخلايا تسمية (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تحميل كل عينة إلى فارز الخلية، دوامة لفترة وجيزة ل resuspend الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ من خلال تحليل عينة غير ملوثين في أودير لضبط النابضة للسكان الخلية الكلي، إلى بوابة الخروج الحطام الخلية، وتحديد تألق ذاتي أو تلطيخ الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل عينة غير ملوثين + 7AAD لتحديد وبوابة سكان الخلايا الحية من السكان خلية الإجمالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل كل عنصر تحكم لتحديد لون واحد ومعايرة معلمات مثل التعويض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل العينة الملون لتحديد موقف من البوابات للفرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تم تعيين المعلمات وبوابات للسكان الخلية المطلوبة، تبدأ فرز السكان الخلية المسمى في أنابيب إيبندورف أنابيب مخروطية أو 15 مل تحتوي على مستنبت أو RNA العازلة تحلل (مثل RLT عازلة أو Trizol). </li></ul> ملاحظة: إذا فرز عدد كبير من الخلايا، فمن غير المستحسن لفرز مباشرة إلى المخزن المؤقت تحلل الحمض النووي الريبي، حيث بلغ حجم كبير من السائل غمد المصاحبة للخلايا في إضعاف المخزن المؤقت تحلل وتقليل العائد. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور أسفل الخلايا فوريابعد انتهاء الفرز اعل، ونقل إلى متوسطة طازجة أو RNA العازلة تحلل، وهذا يتوقف على الغرض من التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا الفرز من أجل الثقافة الخلايا المعزولة، نفذ نوع العقيمة. لتحسين الانتعاش من الخلايا، استخدم الفينول الحمراء مجانا DMEM + 5٪ FCS بدلا من FACS العازلة II وجمع الخلايا في مستنبت مع FCS 20٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم الفرز زراعة الخلايا الليفية، alwaysplate على لوحات الكولاجين والمغلفة بشكل مباشر أبدا على البلاستيك وينتج عن هذا التنشيط يؤدي إلى الخلايا الليفية التغيرات في التعبير الجيني لها. </li></ul>

<ol>
	<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+cancer.">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression.">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 21, 19-25 (2010).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+stromal+fibroblasts+in+tumors.">Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors.</a> Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).</li><li>Ostman, A., Augsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+and+tumor+growth--bystanders+turning+into+key+players.">Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 19, 67-73 (2009).</li><li>Allinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+tumor+microenvironment+in+breast+cancer.">Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer.</a> Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).</li><li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression.">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li><li>Orimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1/CXCL12+secretion.">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li><li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+interactions+with+the+tumor+stroma.">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).</li><li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent+Manner.">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner.</a> Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li><li>Neumann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+and+passaging+alters+gene+expression+pattern+and+proliferation+rate+in+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts.">Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts.</a> Arthritis research &amp; therapy. 12, R83 .</li><li>Sherr, C. J., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+mitotic+clock+or+culture+shock.">Cellular senescence: mitotic clock or culture shock.</a> Cell. 102, 407-410 (2000).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+complexity+in+breast+cancer+predicts+overall+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy.">Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).</li><li>Pahler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+tumor-promoting+inflammation:+impairment+of+macrophage+recruitment+evokes+a+compensatory+neutrophil+response.">Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response.</a> Neoplasia. 10, 329-340 (2008).</li><li>Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+paracrine+PDGF+signaling+in+the+proangiogenic+tumor+stroma+revealed+by+pharmacological+targeting.">Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting.</a> PLoS Med. 5, e19 (2008).</li><li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+myofibroblasts+contribute+to+the+mesenchymal+stem+cell+niche+and+promote+tumor+growth.">Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth.</a> Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).</li><li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Mammary+Gland+Development+and+Function+in+Mouse+Models.">Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models.</a> J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).</li><li>Xouri, G., Christian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+tumor+stroma+fibroblasts.">Origin and function of tumor stroma fibroblasts.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 21, 40-46 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

بينما التجارب التي أجريت في زراعة الأنسجة يمكن أن يكون بالمعلومات واقتراح المبادئ الوظيفية التي يمكن التحقق منها في الجسم الحي، ومن المعروف أن تحدث تغييرات كبيرة في التعبير الجيني للخلايا في الثقافة 11،12. وضعنا من أجل تجنب خطوة زراعة الأنسجة عند التنميط ا?...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; اسم كاشف</strong</td&gt;<td<strong&gt; شركة</strong</td&gt;<td<strong&gt; كتالوج عدد</strong</td&gt;<td<strong&gt; التعليقات (اختياري)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 41965</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS</td&gt;<td&gt; البيولوجي للصناعات</td&gt;<td&gt; 02-023-1A</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; كولاجيناز II</td&gt;<td&gt; ورثينجتون</td&gt;<td&gt; LS4176</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; كولاجيناز IV</td&gt;<td&gt; ورثينجتون</td&gt;<td&gt; LS4188</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ديوكسي ريبونيوكلياز</td&gt;<td&gt; ورثينجتون</td&gt;<td&gt; LS2007</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PharmLyse</td&gt;<td&gt; BD</td&gt;<td&gt; 555899</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; مصفاة الخلية 70 ميكرومتر</td&gt;<td&gt; SPL</td&gt;<td&gt; 93070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; تنقية مكافحة الماوس CD16/CD32</td&gt;<td&gt; BD Pharmingen</td&gt;<td&gt; 553142</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; عن طريق المسبار (7AAD)</td&gt;<td&gt; البريد العلوم البيولوجية</td&gt;<td&gt; 00-6993-50</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; مكافحة الماوس CD140a-PE (PDGFRa)</td&gt;<td&gt; البريد العلوم البيولوجية</td&gt;<td&gt; 12-1401-81</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; مكافحة الماوس F4/80- FITC</td&gt;<td&gt; Cederlane</td&gt;<td&gt; CL8940F</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM ث / س الفينول الأحمر</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 31053</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; نوع الكولاجين I</td&gt;<td&gt; BD العلوم البيولوجية</td&gt;<td&gt; 354236</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by fluorescence activated cell sorting (facs)

سرطان الخلايا الليفية المرتبطة (سي أي إف إس) هي نوع من الخلايا أبرز داخل الورم سدى من العديد من أنواع السرطان، سرطان الثدي في وجه الخصوص، وكثيرا ما يرتبط وجودهم بارز مع 1،2 بسوء التشخيص. سي أي إف إس هي حيوانية تنشيط الخلايا الليفية اللحمية، وكثير منها تعبر عن علامة الأرومة الليفية العضلية α-SMA 3. سي أي إف إس الأنسجة الليفية تنبع من المحلية وكذلك من خلايا نخاع العظام المستمدة من المعينين داخل الورم تطوير واعتماد النمط الظاهري CAF تحت تأثير الورم المكروية 4. عرضت سي أي إف إس لتسهيل بدء الورم، والنمو والتقدم من خلال الإشارات التي تشجع انتشار الخلايا السرطانية، الأوعية الدموية، وغزو 5-8. أثبتنا أن سي أي إف إس تعزيز نمو الورم عن طريق الوساطة الورم المعززة للالتهاب، بدءا من المراحل المبكرة ما قبل الورمية 9. رغم وجود أدلة متزايدة من سي أي إف إس تلعب دورا رئيسيا في تسهيل نمو الورم،وكانت دراسة سي أي إف إس تحديا الجارية نظرا لعدم وجود علامات محددة CAF وعدم التجانس العظمى من هذه الخلايا، مع العديد من الأنواع الفرعية تتعايش في المكروية ورم 10. وعلاوة على ذلك، ودراسة الخلايا الليفية في المختبر يعوقها حقيقة أن في كثير من الأحيان يتم تبديل الشخصي التعبير الجيني في مجال زراعة الأنسجة 11،12. لمعالجة هذه المشكلة والسماح منحازة التنميط التعبير الجيني من الخلايا الليفية الماوس من الطازجة والأنسجة البشرية، وضعنا طريقة يعتمد على البروتوكولات السابقة للفرز الخلايا مضان المنشط (FACS) 13،14. نهجنا تعتمد على استخدام PDGFRα كعلامة سطح الخلايا الليفية لعزل من الماوس الطازجة والأنسجة البشرية. وأعرب تماما من قبل كل من الخلايا الليفية PDGFRα العادية ومقاهي 9،15. هذا الأسلوب يسمح للسكان العزل نقية من الخلايا الليفية الطبيعية وسي أي إف إس، بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على α-SMA + تنشيط myofibroblasts. يمكن أن تكون معزولة الخلايا الليفية ثمتستخدم لتوصيف ومقارنة لتطور التعبير الجيني التي تحدث في أثناء سي أي إف إس تكون الأورام. في الواقع، نحن وغيرنا عن التنميط التعبير عن الخلايا الليفية معزولة من قبل الخلية فرز 16. تم تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح لعزل السكان وإنشاء ملف عالي التخصيب من الخلايا الليفية من أنسجة الجلد، الثديية والبنكرياس والرئة. وعلاوة على ذلك، لدينا أسلوب يسمح أيضا زراعة الخلايا فرزها، من أجل إجراء تجارب الفنية وتجنب التلوث من قبل خلايا الورم، والتي غالبا ما تكون عقبة كبيرة عندما تحاول سي أي إف إس الثقافة.

باستخدام PDGFRα كعلامة لنتائج الخلايا الليفية في عزلة السكان عالي التخصيب من الخلايا الليفية الأنسجة. كان مستوى نقاء 99٪ بعد الفرز، كما كميا بعد تحليل نوع (الشكل 2A). تقدير النسبة المئوية للتلوث غير الليفية الخلايا عن طريق التعبير النسبية للجينات الخلية التحكم ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS at JoVE.com

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

سرطان الخلايا الليفية المرتبطين بها (سي أي إف إس) تسهيل بدء الورم، والنمو والتقدم من خلال الإشارات التي تشجع انتشار الأسلحة النووية، الأوعية الدموية، والتهاب. نحن هنا وصف طريقة لعزل السكان نقية من الخلايا الليفية الطبيعية وسي أي إف إس من الماوس الطازجة والأنسجة البشرية عن طريق الفرز الخلية، وذلك باستخدام PDGFRα كعلامة السطح.

عزل الخلايا الليفية عادي والسرطان يرتبط بها من الأنسجة الطازجة من الإسفار خلية المنشط الفرز (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

isolation-normal-cancer-associated-fibroblasts-from-fresh-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

35.5K Views.  Tel Aviv University. سرطان الخلايا الليفية المرتبطين بها (سي أي إف إس) تسهيل بدء الورم، والنمو والتقدم من خلال الإشارات التي تشجع انتشار الأسلحة النووية، الأوعية الدموية، والتهاب. نحن هنا وصف طريقة لعزل السكان نقية من الخلايا الليفية الطبيعية وسي أي إف إس من الماوس الطازجة والأنسجة...

Video: Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

عزل وتنقية ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الطرفية بواسطة حبة فرز المغناطيسي

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

مضان الفرز الخلية النباتية المنشط من Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification of bacterial taxa that transform specific pools of DOC in nature poses a technical challenge. 
Here we describe an approach that couples bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation, fluorescence activated cell sorting (FACS), and 16S rRNA gene-based molecular analysis that allows culture-independent identification of bacterioplankton capable of degrading a specific DOC compound in aquatic environments. Triplicate bacterioplankton microcosms are set up to receive both BrdU and a model DOC compound (DOC amendments), or only BrdU (no-addition control). BrdU substitutes the positions of thymidine in newly synthesized bacterial DNA and BrdU-labeled DNA can be readily immunodetected 1,2. Through a 24-hr incubation, bacterioplankton that are able to use the added DOC compound are expected to be selectively activated, and therefore have higher levels of BrdU incorporation (HI cells) than non-responsive cells in the DOC amendments and cells in no-addition controls (low BrdU incorporation cells, LI cells). After fluorescence immunodetection, HI cells are distinguished and physically separated from the LI cells by fluorescence activated cell sorting (FACS) 3. Sorted DOC-responsive cells (HI cells) are extracted for DNA and taxonomically identified through subsequent 16S rRNA gene-based analyses including PCR, clone library construction and sequencing.

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Environmental bacterioplankton are incubated with a model dissolved organic carbon (DOC) compound and a DNA labeling reagent, bromodeoxyuridine (BrdU). Afterward, DOC-degrading cells are separated from the bulk community based on their elevated BrdU incorporation using fluorescence activated cell sorting (FACS). These cells are then identified by subsequent molecular analyses.

Bromodeoxyuridine (BrdU) التوسيم والفرز وبعد الإسفار خلية المنشط للتحديد ، ثقافة مستقلة عن العضوية الذائبة الكربون المهينة العوالق البكتيرية

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

عزل الخلايا الليفية بوابة الجرذ من قبل<em&gt; في الموقع</em&gt; الكبد الإرواء

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

تحليل خلية معينة من<em&gt; ل arabidopsis</em&gt; يترك طريق الإسفار خلية المنشط الفرز

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

تحليل معلقات خلية معزولة من الأنسجة الصلبة من قبل الطيفي التدفق الخلوي

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

مغناطيسية تنشيط الخلية فرز الاستراتيجيات الرامية إلى عزل وتنقية الزليلي المستمدة من سائل الخلايا الجذعية الوسيطة من طراز الأرنب

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

خليه واحده الطموح الصغير كاستراتيجية بديله لفرز الخلايا المنشطة الفلورية لفصل خليط الفيروسات العملاقة

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

فلورسينس تنشيط فرز الخلايا لعزل سكان الخلايا Scleractinian

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

عزل وتوصيف الإكسوسومات من الخلايا الليفية العضلية الهيكلية

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...