אנו מודים לד&quot;ר יצחק וOschry ד&quot;ר אורית שגיאה, אסיף על עזרו במיון FACS. מחקר זה נתמך על ידי מענקים לNE מהתכנית השביעית של האיחוד האירופית Framework (FP7/2007-2013) תחת הסכם המענק n ° [276890], מהמלחמה בסרטן האגוד (# 20110078), ומישראל לחקר הסרטן בקרן (המחקר פרס פיתוח קריירה).

1. ביתור רקמת שד או עור מעכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ביתור הרקמה הרצויה מעכברים, להכין את הציוד וריאגנטים הבאים: ספקים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלי ניתוח (שטף עם חומר ניקוי ולאחר מכן טבל באתנול 70%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטח הקלקר לנוח על העכבר במהלך נתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיכות או מחטים להחזיק עכברים במהלך נתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנצנת זכוכית עם מכסה לעיכול, מכילה סרגל סערה מגנטי (autoclaved). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבט מים ב 37 ° C, המכיל stirrer מגנטי צולל ומספיק מים כדי להטביע את צנצנת העיכול, בזמן מנוחה על הצלחת והמערבבים. </li></ul> ריאגנטים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FACS חיצי: (4 ° C): פוספט של Dulbecco נאגר מלוח CMF (מגנזיום סידן חינם) + 0.5% BSA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון collagenase (שנעשה מייד לפני שימוש): 0.05 גרם collagenase השני 0.05 גרם collagenase IV 0.01 Deoxyribonuclease גרם 20מיליליטר FACS החיץ ראשון שמור על פתרון collagenase על קרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PharmLyse (מגיב Lysing אמוניום כלוריד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FACS חיץ השני: פוספט של Dulbecco נאגר מלוח CMF + 1% FCS. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתיחה של בלוטות חלב (ראה גם 17). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים נקבות עכברים באמצעות פחמן דו חמצני (CO 2) שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על משטח קלקר, הנח את העכבר על הגב שלו ולהצמיד את כל ארבעת הגפיים באמצעות 25 מחטי מד (איור 1 א &#39;) בתקיפות. רסס את העכבר בנדיבות עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים, להרים את עור הבטן בקו האמצע ולעשות חתך קטן במספריים חדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מהחתך, לחתוך את העור עד לצווארו של בעל החיים, תוך הימנעות בפגיעה בחללי בטן או חזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העור על רגליו האחוריות מחתך קו האמצע לכיוון הרגל, וכתוצאה מכך &quot;צורת Y&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך עור מגוף של עכבר ולהצמיד, חשיפהבלוטות החלב צמוד לחלק התחתון של העור (1B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Q-טיפים בעדינות כדי להפריד בלוטות חלב מעור תוך חיתוך רקמות &quot;ו חיבור עם מספריים חדים קטנים כדי להפריד את בלוטת החלב לכיוון עמוד השדרה של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוטות הבטן (מס &#39;4, 5) הן טובות ביותר עבור פרוטוקול זה. ניתן גם להשתמש בבלוטת החלב -2, אבל לקחת בחשבון שבלוטות אלה נמצאות בסמיכות אנטומית לשריר pectoralis אשר עשוי להיות קשה להיפרד, וכתוצאה מכך תאים ממקור רקמה מעורבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: כאשר מנתחי רקמת גידול, מומלץ להסיר את אזורי נימקים. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסקציה של רקמות עור: הדרך הקלה ביותר להשיג רקמת עור, מבלי להתמודד עם הסרת שיער היא להשתמש באוזני עכבר. אם כמות גדולה יותר של רקמה נדרשת, אתה יכול לגלח את השיער מגוף עכבר ולנתח עור. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים באמצעות 2 משאיפת CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים חדים, לחתוך את שתי אוזניים ואת המקום מייד בצנצנת המכילה עיכול נפח קטן (~ 0.5 מ&quot;ל) של PBS על קרח. </li></ul></li></ol> 2. הכנת השעית תא חלב בלוטה / עור היחידה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בלוטות / עור בצנצנת המכילה עיכול נפח קטן של PBS על קרח חלב. אם רקמה היא דמים לשטוף x2 עם PBS, ולאחר מכן למחוק את PBS העודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברר ביסודיות עם מספריים מעוגלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 פתרון collagenase מ&quot;ל (הערה: כמות זו של פתרון collagenase תהיה יעיל לנתק כ 5 גרם של רקמה ואוזני חלב או גידול מעכברים עד 15). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מייד על צלחת מערבבים ב37 ° C אמבט מים, ודגירה במשך 15 דקות תוך ערבוב בקצב בינוני. </li></ul> הערה: זמני דגירה אופטימליות עשויים להשתנות אם לעכל רקמות אחרות. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפסיק את התגובה, להוסיף 30 מ&quot;ל הקר DMEM + 10% FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן את תערובת throug רקמה / מדיהמסננת תא 70 מיקרומטר חה מונחת על גבי צינור 50 מיליליטר חרוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור החרוטים למשך 5 דקות ב450 XG ב 4 ° C. </li></ul> 3. אדומה תמוגה תאי דם הערה: בשלב זה הוא אינו נחוץ אם עכברים היו לב perfused-עם PBS לפני שהם הקריבו. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant באמצעות פיפטה זכוכית מחוברת לואקום, מבלי להפריע לתא הגלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לlyse RBC, resuspend תא גלול ב 10 מיליליטר פתרון PharmLyse ודגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את פתרון PharmLyse ידי ההוספה כ 40 מ&quot;ל של חיץ FACS I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינור החרוטים עם תאים למשך 5 דקות ב450 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. </li></ul> 4. חסימה של Fc אנדוגני <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: תאי ספירה כדי לקבוע את הנפח המתאים לשלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend ב1-3 מ&quot;ל FACS חיצי (תלוי oתא מספר n, וכמות הנוגדנים ברצונך להשתמש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף FcBlock (אנטי עכבר CD16/CD32) להגיע 1:50 דילול (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל), ולדגור על קרח למשך 10-20 &#39;. אין צורך לשטוף את FcBlock. </li></ul> 5. הכתמה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את 100 aliquots μl לצינורות Eppendorf כדי לשמש כשליטה בלתי מוכתמת ופקדי צבע אחד (לפי מספר נוגדני ניאון משמשים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לfibroblasts תווית: להוסיף אנטי PDGFRα (ישירות מצומדת לfluorophore) לדילול 01:50 (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתייג את אוכלוסיות תאים אחרות (תאי מערכת חיסון, למשל, תאי האנדותל מקרופגים וכו &#39;): להוסיף נוגדנים מצומדות fluorescently מתאימים לסמני פני שטח, ל1:50 דילול. </li></ul> הערה: למרות שPDGFRα הוא סמן חזק לfibroblasts, מומלץ לכלול נוגדנים לתאי מערכת חיסוניים ותאי האפיתל במטרה שלא יכלול חיובי כפולאוכלוסיות ובכך לשפר את הטוהר של fibroblasts המבודד. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של כל נוגדנים לכל אחת ממבחנות אפנדורף בקרת הצבע האחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים עם נוגדני 1 שעה על קרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף: למלא צינורות עם חיץ FACS אני וספין למשך 5 דקות ב450 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תאי supernatant, resuspend בFACS חיצי לריכוז של כ 2 10 x 6 תאים / מ&quot;ל, או בכל הריכוז המתאים ביותר למיון עם סדרן FACS הזמין שלך. </li></ul> אופציונלי: תאים ניתן resuspended בFACS חיץ השני לתקופת מיון. זה עשוי לשפר את כדאיויות תא. עם זאת, חשיפה לגורמים בסרום עשויה להיות השפעת ביטוי גנים, שיש לבדוק, ונלקח בחשבון. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים שכותרתו לתוך צינורות FACS עם מסנן עליונים: תאי סינון לחצוצרות למניעת גושים סלולריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להוציא את התאים מתים, להוסיף 7AAD (0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) או נכסיודיד idium (PI) קטעים (פרט לשליטה בלתי מוכתמת). </li></ul> הערה: כדי להימנע מבזבוז תאים, אתה יכול להוסיף ל7AAD/PI מדגם בלתי מוכתם, לאחר הרישום בFACS, ולהשתמש בו שוב כשליטת 7AAD בלבד. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור דגימות על קרח בעת ניתוח. </li></ul> 6. בידוד של תאים על ידי FACS (הערה: חלק זה של הפרוטוקול דורש ידע קודם בהפעלת סדרן FACS, למשל BD FACS AriaII, או הסיוע של טכנאי מיומן). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות FACS סדרן התוכנה (BD FACSDiva), להכין חלקות ניתוח מתאימות לניתוח פיזור קדימה (FSC), פיזור הצד (SSC), 7AAD, FITC, PE וכל fluorophore אחר המשמש לתאי תווית (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני טעינת מדגם זה לסדרן התא, מערבולת בקצרה resuspend תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי ניתוח מדגם הכתם כדי להגדיר gating לאוכלוסיית התאים המוחלטות, לשער החוצה celפסולת הליטר, וכדי לקבוע autofluorescence או כתמי רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח דגימת כתם + 7AAD לקבוע שער והאוכלוסייה של תאי חיים מאוכלוסיית התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח כל שליטת צבע אחד כדי לקבוע וכיול פרמטרים כגון פיצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח דגימה המוכתמת להגדיר את המיקום של שערים למיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שפרמטרים ושערים לאוכלוסיות התאים הרצויים הוגדרו, מתחיל במיון אוכלוסיות התאים שכותרתו לתוך צינורות Eppendorf או 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל המכילים מדיום תרבות או בולם תמוגה רנ&quot;א (כגון RLT חיץ או Trizol). </li></ul> הערה: אם מיון מספר גדול של תאים, זה לא מומלץ למיין ישירות לתוך מאגר תמוגה רנ&quot;א, כנפח הגדול של נוזל נדן מלווה את התאים ידללו את מאגר תמוגה ולהפחית את התשואה. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תאים מייד לאחר מיון הוא סיים, והעברה למדיום טרי או חיץ תמוגה רנ&quot;א, דהתלוי ועומד על מטרת הניסוי שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מיון כדי תאים מבודדים תרבות, לבצע סוג סטרילי. להתאוששות טובה יותר של תאים, להשתמש באדום ללא DMEM פנול + 5% FCS במקום FACS חיץ השני ולאסוף תאים לתרבות בינונית עם 20% FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם culturing מסודר fibroblasts, קולגן alwaysplate על צלחות מצופות ולא ישירות על פלסטיק כזה תוצאות בהפעלה של fibroblasts המוביל לשינויים בביטוי הגנים שלהם. </li></ul>

<ol>
	<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+cancer.">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression.">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 21, 19-25 (2010).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+stromal+fibroblasts+in+tumors.">Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors.</a> Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).</li><li>Ostman, A., Augsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+and+tumor+growth--bystanders+turning+into+key+players.">Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 19, 67-73 (2009).</li><li>Allinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+tumor+microenvironment+in+breast+cancer.">Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer.</a> Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).</li><li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression.">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li><li>Orimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1/CXCL12+secretion.">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li><li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+interactions+with+the+tumor+stroma.">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).</li><li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent+Manner.">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner.</a> Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li><li>Neumann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+and+passaging+alters+gene+expression+pattern+and+proliferation+rate+in+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts.">Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts.</a> Arthritis research &amp; therapy. 12, R83 .</li><li>Sherr, C. J., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+mitotic+clock+or+culture+shock.">Cellular senescence: mitotic clock or culture shock.</a> Cell. 102, 407-410 (2000).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+complexity+in+breast+cancer+predicts+overall+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy.">Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).</li><li>Pahler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+tumor-promoting+inflammation:+impairment+of+macrophage+recruitment+evokes+a+compensatory+neutrophil+response.">Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response.</a> Neoplasia. 10, 329-340 (2008).</li><li>Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+paracrine+PDGF+signaling+in+the+proangiogenic+tumor+stroma+revealed+by+pharmacological+targeting.">Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting.</a> PLoS Med. 5, e19 (2008).</li><li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+myofibroblasts+contribute+to+the+mesenchymal+stem+cell+niche+and+promote+tumor+growth.">Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth.</a> Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).</li><li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Mammary+Gland+Development+and+Function+in+Mouse+Models.">Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models.</a> J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).</li><li>Xouri, G., Christian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+tumor+stroma+fibroblasts.">Origin and function of tumor stroma fibroblasts.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 21, 40-46 (2010).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בעוד הניסויים שבוצעו בתרביות רקמה יכולים להיות אינפורמטיבי ולהציע עקרונות פונקציונליים כי ניתן מאומת in vivo, ידוע ששינויים גדולים מתרחשים בביטוי גן בתאים בתרבית 11,12. על מנת להימנע מצעד תרבית רקמה כאשר אפיון ביטוי גנים בfibroblasts, פתחו פרוטוקול המאפשר בידוד של ?...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; שם המגיב</strong</td&gt;<td<strong&gt; חברה</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוג</strong</td&gt;<td<strong&gt; תגובות (אופציונלי)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 41965</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS</td&gt;<td&gt; תעשיות ביולוגיות</td&gt;<td&gt; 02-023-1A</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Collagenase השני</td&gt;<td&gt; ורטינגטון</td&gt;<td&gt; LS4176</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Collagenase IV</td&gt;<td&gt; ורטינגטון</td&gt;<td&gt; LS4188</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Deoxyribonuclease</td&gt;<td&gt; ורטינגטון</td&gt;<td&gt; LS2007</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PharmLyse</td&gt;<td&gt; BD</td&gt;<td&gt; 555899</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מסננת תא 70 מיקרומטר</td&gt;<td&gt; SPL</td&gt;<td&gt; 93070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; המטוהר אנטי עכבר CD16/CD32</td&gt;<td&gt; BD Pharmingen</td&gt;<td&gt; 553142</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ויה חללית (7AAD)</td&gt;<td&gt; דואר Bioscience</td&gt;<td&gt; 00-6993-50</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; אנטי עכבר CD140a-PE (PDGFRa)</td&gt;<td&gt; דואר Bioscience</td&gt;<td&gt; 12-1401-81</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; אנטי עכבר F4/80- FITC</td&gt;<td&gt; Cederlane</td&gt;<td&gt; CL8940F</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM w / o אדומה פנול</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 31053</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; סוג קולגן אני</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 354236</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by fluorescence activated cell sorting (facs)

fibroblasts סרטן הקשורים (cafs) הוא סוג התא הבולט ביותר בתוך stroma הגידול של סוגי סרטן רבים, בסרטן השד בפרט, והנוכחות הבולטת שלהם קשורה לעתים קרובות עם 1,2 פרוגנוזה גרוע. Cafs הוא subpopulation הופעל של fibroblasts סטרומה, שרבים מהם להביע את סמן myofibroblast α-SMA ל 3. Cafs מקורן fibroblasts רקמות המקומיים, כמו גם מתאי מוח עצם שהופקו גויסו לגידול לפתח ולאמץ פנוטיפ CAF תחת השפעת גידול microenvironment 4. Cafs הוצג כדי להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות גידול תא, אנגיוגנזה, ופלישת 5-8. אנחנו הוכחנו כי cafs לשפר את צמיחת גידול על ידי תיווך דלקת גידול מקדם, החל בשלבים המוקדמים מראש neoplastic 9. למרות ראיות גוברות של cafs לשחק תפקיד המפתח בקידום צמיחת גידול,Cafs לומד כבר אתגר מתמשך בשל חוסר הסמנים CAF ספציפיים וההטרוגניות העצומה של תאים אלה, עם תת רבים שיתוף קיים בגידול microenvironment 10. יתר על כן, לומד fibroblasts במבחנה מתעכבת עקב העובדה שפרופיל ביטוי הגנים שלהם לעתים קרובות שינה בתרבית הרקמה 11,12. כדי לטפל בבעיה זו ולאפשר ביטוי פרופיל גנטי משוחד של fibroblasts מעכבר רענן ורקמות אדם, פתח שיטה המבוססת על פרוטוקולים קודמים למיון תא Fluorescence-Activated (FACS) 13,14. הגישה שלנו מסתמכת על ניצול PDGFRα כסמן משטח לבודד מעכבר fibroblasts טרי ורקמה אנושית. PDGFRα מתבטא בשפע על ידי שני fibroblasts וcafs 9,15 הנורמלים. שיטה זו מאפשרת בידוד של אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הרגיל, כולל, אך לא מוגבלת ל- SMA α + הופעל myofibroblasts. fibroblasts מבודד אז יכול להיותהמשמש לאפיון והשוואה של האבולוציה של ביטוי גנים המתרחשת בcafs במהלך tumorigenesis. ואכן, אנו ואחרים דיווחו על פרופיל ביטוי של fibroblasts בודד על ידי תא מיון 16. פרוטוקול זה בוצע בהצלחה לבודד ופרופיל אוכלוסיות מועשרות ברמה גבוהה של fibroblasts מרקמות עור שד, סרטן לבלב וסרטן ריאות. יתר על כן, השיטה שלנו מאפשרת גם culturing של תאים ממוינים, על מנת לבצע ניסויים פונקציונליים וכדי למנוע זיהום על ידי תאים סרטניים, אשר לעתים קרובות מכשול גדול כאשר מנסה cafs התרבות.

שימוש PDGFRα כסמן לתוצאות פיברובלסטים בבידוד של אוכלוסיות מועשרות ברמה גבוהה של fibroblasts רקמות. רמת הטוהר לאחר המיון הייתה 99%, כלכמת את הניתוח שלאחר המיון (איור 2 א). הערכת אחוז תאים שאינם מזהם פיברובלסטים על ידי הביטוי היחסי של גני בקרת תא ספציפיים (האיור 2B)</str...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS at JoVE.com

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Fibroblasts Associated הסרטן (cafs) להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות, אנגיוגנזה, ודלקת. כאן אנו מתארים שיטה לבודדה אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הנורמלי מעכבר רענן ורקמות אדם על ידי מיון תא, באמצעות PDGFRα כסמן פני שטח.

בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

isolation-normal-cancer-associated-fibroblasts-from-fresh-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

35.5K Views.  Tel Aviv University. Fibroblasts Associated הסרטן (cafs) להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות, אנגיוגנזה, ודלקת. כאן אנו מתארים שיטה לבודדה אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הנורמלי מעכבר רענן ורקמות אדם על ידי מיון תא, באמצעות PDGFRα כסמן פני שטח.

Video: Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification of bacterial taxa that transform specific pools of DOC in nature poses a technical challenge. 
Here we describe an approach that couples bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation, fluorescence activated cell sorting (FACS), and 16S rRNA gene-based molecular analysis that allows culture-independent identification of bacterioplankton capable of degrading a specific DOC compound in aquatic environments. Triplicate bacterioplankton microcosms are set up to receive both BrdU and a model DOC compound (DOC amendments), or only BrdU (no-addition control). BrdU substitutes the positions of thymidine in newly synthesized bacterial DNA and BrdU-labeled DNA can be readily immunodetected 1,2. Through a 24-hr incubation, bacterioplankton that are able to use the added DOC compound are expected to be selectively activated, and therefore have higher levels of BrdU incorporation (HI cells) than non-responsive cells in the DOC amendments and cells in no-addition controls (low BrdU incorporation cells, LI cells). After fluorescence immunodetection, HI cells are distinguished and physically separated from the LI cells by fluorescence activated cell sorting (FACS) 3. Sorted DOC-responsive cells (HI cells) are extracted for DNA and taxonomically identified through subsequent 16S rRNA gene-based analyses including PCR, clone library construction and sequencing.

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Environmental bacterioplankton are incubated with a model dissolved organic carbon (DOC) compound and a DNA labeling reagent, bromodeoxyuridine (BrdU). Afterward, DOC-degrading cells are separated from the bulk community based on their elevated BrdU incorporation using fluorescence activated cell sorting (FACS). These cells are then identified by subsequent molecular analyses.

Bromodeoxyuridine (BrdU) תיוג ומיון לאחר פלואורסצנטי תא פעיל עבור זיהוי, תרבות עצמאית של פחמן אורגני מומסים משפיל Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

הבידוד של Fibroblasts פורטל עכברוש ידי<em&gt; באתרו</em&gt; כבד זלוף

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

מגנטי תא לפעיל על-מיון אסטרטגיות כדי לבודד ולטהר Synovial נגזר הנוזלים בתאי גזע Mesenchymal ממודל ארנב

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

תא בודד מיקרו-שאיפה כאסטרטגיה חלופית מיון תאים פלואורסצנטית מופעל עבור הפרדה וירוס ענק תערובת

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

תא מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית לבידוד של אוכלוסיות תאים בלובן המין

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...