بروتوكولنا يوفر ونهج سهل وسريع لعزلة الخلايا الليفية الأولية مع التركيز الواضح على تجنب تلوث البكتيريا، والتي يمكن أن تكون مشكلة كبيرة. خاصة للمبتدئين. الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي بساطتها.
كما أنها لا تتطلب مهارات أو خبرة يدوية واسعة ويمكن تعلمها بسهولة من قبل الجميع في غضون فترة تدريب قصيرة. تقديم هذه التقنية سيكون مانجا نيو، وهو فني من خارج المختبر. قبل البدء في تشريح، وضعت على اثنين من أزواج من القفازات المتاح، واحد على رأس الآخر.
وأصلح الماوس إلى لوحة البوليسترين. تطهير الفراء مع 70٪ الإيثانول، والتأكد من أن الحيوان غارقة. واستخدام الإيثانول معقمة ملقط الجراحية والمقص الاتنامية لكوب الجلد الحق فوق الجهاز البولي التناسلي.
قطع ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات على طول خط الوسط من الشق الأولي إلى الرقبة، مضيفا تخفيضات الإغاثة في الأطراف. وثب الجلد على الوسادة لتحقيق الوصول الأمثل إلى العضلات التي تغطي تجويف البطن. ثم، تطهير العضلات البطن مرتين مع الإيثانول الطازجة 70٪.
عندما يجفف الإيثانول، قم بإزالة أول زوج من القفازات. واستخدام مجموعة جديدة معقمة من ملقط ومقص لتحني طبقة العضلات لفتح تجويف البطن والصدر. لإزالة الأجهزة ذات الاهتمام، فهم بلطف كل عضو مع ملقط الجراحية دون ثقب الأنسجة.
واستخدام مقص لقطع بعناية توريد الأوعية الدموية بالقرب من نقطة دخول الجهاز. ضع كل عضو في أنبوب من برنامج تلفزيوني معقمة وباردة وإغلاق الأنبوب بإحكام. وضع كل أنبوب على الجليد الرطب كما يتم جمع الأعضاء.
عندما تم حصاد جميع الأعضاء، رش الأنابيب مع 70٪ الإيثانول قبل وضعها في غطاء زراعة الخلايا العقيمة. ارتداء زوج جديد من القفازات، واستخدام ملقط العقيمة لنقل كل عضو على نصف طبق بيتري ستة سنتيمترات عقيمة. وغسل الأعضاء لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني جديد لإزالة الدم الزائد.
نقل الأجهزة المشطفة إلى النصف الثاني من كل طبق بيتري وإزالة برنامج تلفزيوني الزائدة. باستخدام مشرطين عقيمين ، قم بتلمي الأعضاء إلى شظايا من ملليمتر إلى 2. واستخدام ملعقة معقمة لنقل قطع الأنسجة إلى أنابيب جديدة، فردية، معقمة، 15 ملليلتر.
إضافة ملليلترين من 0.25٪ تريبسين حل لكل أنبوب. ووضع الأنابيب في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة، دوامة الأنابيب في حوالي 1400 دوران في الدقيقة لمدة عشر ثوان.
وقبض على رد فعل التربسين مع أربعة ملليلتر من وسيلة الثقافة المناسبة تستكمل مع مصل عجل الجنين في الأنبوب الواحد. المقبل، إضافة حجم مناسب من الحل مزيج collagenase إلى كل أنبوب. ووضع الأنابيب في حمام الماء بالموجات فوق الصوتية 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
في نهاية سونيكيشن، دوامة بلطف الأنابيب لمدة 10 ثانية. قبل وضع الأنابيب مرة أخرى إلى حمام الماء بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق أخرى. في نهاية سونيكيشن الثاني، دوامة الأنابيب لمدة 10 ثانية أخرى.
وتطهير الأنابيب مع 70٪ الإيثانول. في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، تصفية تعليق الخلية من خلال مصافي 40 ميكرومتر الفردية في أنبوب جديد، عقيم، 15 ملليلتر. وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
إعادة تعليق الكريات في ملليلتر واحد من المتوسطة الطازجة لكل أنبوب. وترى الخلايا في أوعية مناسبة لثقافة الخلية في كثافة الطلاء المناسبة. ثم، ضع الخلايا في الحاضنة ثقافة الخلية بين عشية وضحاها.
في صباح اليوم التالي، يغسل كل ثقافة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني قبل إضافة المتوسطة الطازجة وإعادة الخلايا إلى الحاضنة. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن الحصول على الخلايا الليفية القابلة للحياة لاستخدامها في التجارب اللاحقة. مثل تجارب التلطيخ أو الانتشار من الفلورسنت الأمينية.
الخلايا الليفية للبالغين هي خلايا مسطحة على شكل مغزل مع عمليات خلوية متعددة تنمو عادة في أحادية الطبقات. ومع ذلك، يمكن ملاحظة اختلافات مورفولوجية متميزة في مجموعات الخلايا الليفية من مختلف الأعضاء. على سبيل المثال، تكون الخلايا الليفية الكلوية أصغر وتنمو بكثافة أعلى من الخلايا الليفية القلبية أو الرئوية أو الكبدية.
تظهر الخلايا الليفية المعزولة معدلات انتشار عالية، لتصل إلى التقاء بصري يزيد عن 90٪ بعد حوالي ستة أيام. هنا، يمكن ملاحظة myofibroblast متمايزة مع مميزة ألفا العضلات الملساء actin microfilaments. توجد هذه الخلايا بكثرة في الثقافات القلبية والكلى والكبدية وخلايا الرئة.
في حين أن حوالي 20 إلى 30 في المئة فقط من الخلايا المعزولة والمثقف تعبر عن منظم, مرتبة, ألفا العضلات الملساء actin microfilaments, تقريبا كل من الخلايا إيجابية ل Vimentin وS discoidin مستقبلات المجال 2 بعد سبعة أيام في الثقافة. أهم شيء يجب تذكره هو استخدام التقنية الصحيحة طوال الإجراء حيث يجب تجنب تلوث البكتيريا. بعد العزلة الليفية الأولية ، يمكن استخدام الخلايا لجميع أنواع تجارب الطب النفسي والتوصيف.
مثل انتشار الكيمياء المناعية أو المقالات التئام الجروح، أو التقييمات البيولوجية الجزيئية.
