هذا البروتوكول يدل على أنه من الممكن لتوليد الخلايا العصبية الجديدة مباشرة في الدماغ من غليا المقيمين وأن هذه الخلايا إعادة برمجتها تنضج في الخلايا العصبية الفرعية الخاصة. الميزة الرئيسية هي فيروس AAV المعتمد على العقيدة الذي يتيح استهدافًا محددًا لـ NG2-glia ومراسل GFP الذي يصنف الخلايا العصبية التي تمت إعادة برمجتها للتحليل. قد يؤدي توليد الخلايا العصبية الجديدة في الدماغ إلى التطور المستقبلي لعلاجات استبدال الخلايا في الدماغ.
في بروتوكولنا نولد التورين الإيجابي البارفالومين التي لها آثار على الاضطرابات النفسية. في الجسم الحي يمكن تطبيقها على المناطق الأخرى في الدماغ والدوائر اعتمادا على ما النمط الظاهري العصبي والحالة العصبية التي تريد استهدافها. سوف يكون إثبات الإجراء جيني جوهانسون:فني، ماريا بيريرا: طالبة دكتوراه سابقة، ومارسيلا بيرتيل: طالبة دكتوراه في مختبرنا.
لإنتاج AAV5 ناقلات الفيروسية، بذور خلايا HEK293T مع ثقافة متوسطة القياسية في خمس قارورة T175. عندما تصل الخلايا إلى 50 إلى 70٪ التقاء، وإعداد مزيج التالية لtransvection. في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر، إضافة كميات متساوية من الزهو المولي من بلازميد ناقلات، وpDG سلسلة المساعد plasmid.
أضف مخزن تريس-EDTA المؤقت إلى حجم نهائي يبلغ 144 ميكرولترات ثم أضف الماء فائق الpure لينتج عنه حجم إجمالي قدره 1296 ميكرولترات ومزيج. بعد ذلك، أضف 144 ميكرولترات من كلوريد الكالسيوم المولر 2.5 ومزيج. بعد ذلك، أضف 1.92 ملليلتر من HBS إلى محلول الحمض النووي ودوة الدوامة على الفور.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 ثانية بالضبط. في وقت لاحق، نقل الحل إلى 28 ملليلتر من ثقافة الخلية الطازجة المتوسطة ومزيج. استبدل الوسيطة في القارورة بالوسيط الذي يحتوي على مزيج ترانسفيككشن.
انتظر لمدة ثلاثة أيام، ونقل وسائل الإعلام إلى النفايات. إضافة خمسة ملليلتر من مخزن الحصاد المؤقت لكل قارورة، ثم إضافة أربعة ملليلترات أخرى من DPBS إلى كل قارورة لشطف الخلايا المتبقية وتجمع مع حل الخلية. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المحصودة في 1،000 س ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الماذرة وحل الكريه في 15 ملليلتر من عازلة التحلل. تجميد أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر على الجليد الجاف لمدة 15 دقيقة وتخزينها في ثلاجة ناقص 20 درجة مئوية. قبل الاستخدام ، ذوبان الخلية المقطوعة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
في هذا الإجراء، قم بإجراء تنقية AAV بواسطة iodixanol التدرج فائق الrifugation واستخدام أنابيب السقف فائقة النقاء مع الطرد المركزي في 350، 000 x ز لمدة ساعة واحدة و 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لاستخراج AAV التي تحتوي على المرحلة، أدخل حقنة 10 ملليلتر مع إبرة قياس 18 في حوالي مليمترين تحت الحد 40 إلى 60٪ مرحلة مع شطبة تواجه صعودا والانسحاب. تأكد من التوقف قبل الوصول إلى نطاق البروتين بعد استخراج خمسة إلى ستة ملليلترات من المتجه الفيروسي.
ثم، تنقية وتركيز التدرج الاوديكسول المخفف من خلال مرشح تبادل أنيون، عن طريق دفعها من خلال بمعدل لا أسرع من قطرة واحدة في الثانية الواحدة. في وقت لاحق، دفع ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت IE ببطء من خلال عامل التصفية لغسله. المقبل، elute الخليط في وحدة تصفية الطرد المركزي مع ملليلتر واحد إلى اثنين من عازلة elution.
إضافة DPBS إلى الجهاز إلى وحدة تخزين نهائية من أربعة ملليلتر. يتم ترك جهاز طرد مركزي في 2, 000 x ز في درجة حرارة الغرفة حتى أقل من 0.5 ملليلتر من DPBS في المرشح. بعد ذلك، إزالة السائل من الجزء السفلي من الأنبوب، إعادة ملء مع أربعة ملليلتر من DPBS، والطرد المركزي مرة أخرى.
كرر هذه الخطوة مرتين أكثر، تأكد من أن حجم ناقلات مركزة على مرشح حوالي 200 ميكرولترات بعد الطرد المركزي الماضي. إزالة 200 microliter ناقلات المركزة باستخدام ماصة، ودفعه من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لتعقيم. بعد ذلك ، aliquot 200 microliters في قارورة زجاجية مع إدراج متشابكة.
لحقن عوامل إعادة البرمجة، ضع ماوس مخدر في إطار مجسم. إدارة مسكن مناسب في بداية الجراحة ، ثم جلب غيض من الشعرية الزجاجية من إبرة الحقن فقط فوق بريما. تأكد من أن طرف الشعرية مستقيم تماما في كل من طائرات A-P و M-L.
إعادة تعيين قيم M-L و A-P إلى 0.0 على العداد الإحداثيات الرقمية. للتأكد من رأس الحيوان في وضع مسطح تماما، استخدم مضادة الإحداثيات الرقمية لقياس قيمة تنسيق D-V عندما يكون ذراع A-P عند زائد 2.0 و -2.0 وكذلك عندما يكون الذراع M-L عند زائد 2.0 و -2.0. ضبط ارتفاع شريط الأسنان وأشرطة الأذن وفقا لذلك.
بعد ذلك، رفع حقنة قليلا وحفر حفرة باستخدام حفر الأسنان في إحداثيات الحقن. ابدأ في الحفر في الموقع ، والعمل بطريقة دائرية ولطيفة. ثم، ضع قطعة من الشاش القطني على شق مفتوح ونظف الحقنة بمحلول ملحي.
بعد التنظيف، ورسم فقاعة الهواء ثم ميكرولتر واحد من الحل الذي يحتوي على ناقلات الفيروسية. تأكد من أن الحل الفيروسي يمكن تصورها بسهولة تحت فقاعة الهواء. بعد ذلك، قم بخفض الحقنة، وتتقدم ببطء إلى العمق المطلوب، وتأكد من أن المسار واضح من شظايا العظام.
وفي وقت لاحق، حقن ميكرولتر واحد من الحل الفيروسي بمعدل 0.4 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة. عندما يتم الحقن، والسماح لمدة دقيقتين للنشر قبل انسحاب حقنة. بعد الانتشار ، اسحب الحقنة ببطء حتى يتم سحب طرف الشعيرات الدموية تمامًا من الدماغ ، ثم خياطة الشق بعناية وإزالة الحيوان من الإطار المجسم.
راقب الحيوان في محطة ما بعد الجراحة حتى يستعيد الوعي. يتم الاحتفاظ بالحيوانات لمدة تصل إلى 12 أسبوعًا بعد حقن الفيروس للسماح للجليا المقيم بإعادة برمجتها إلى الخلايا العصبية الناضجة. لإعداد شرائح الدماغ للفيزياء الكهربائية باستخدام هزاز، قسم الدماغ من الجزء الأكثر التراسترالية وصولا الى مستوى الستراتتال بسرعة عالية.
ثم قسم في 275 ميكرومتر في 0.1 ملليمتر في الثانية. بعد كل قسم، وإزالة بعناية الجانب غير حقن striatal ونقل الجانب حقن في قارورة مع صافي أسفل والأكسجين شريحة الإحساس CREB في حمام الماء في درجة حرارة الغرفة. الحفاظ على القارورة في درجة حرارة الغرفة حتى يتم قطع جميع المقاطع.
بعد ذلك، ببطء زيادة درجة حرارة الحمام المائي إلى 37 درجة مئوية وتركها لمدة 30 دقيقة، ثم إيقاف سخان والسماح لها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. بعد نقل قسم واحد من الأنسجة إلى غرفة تسجيل للفيزياء الكهربائية، قم بتركيب الماصات الزجاجية على قطب التسجيل وخفضه في المحلل. تحقق من مقاومة القطب.
ثم، ببطء الاقتراب من الخلية التي أعيد برمجتها مع ماصة، والحفاظ على ضغط إيجابي طفيف في القطب لتجنب توصيل طرف، والتحقق من أن الخلية هي GFP إيجابية قبل الترقيع. عندما يتم تصحيح الخلية، والحفاظ على الخلية في المشبك الحالي من ناقص 60 إلى ناقص 70 ملليفولت، وحقن 500 التيارات ميلي ثانية من ناقص 20 إلى زائد 90 picoamperes مع 10 الزيادات picoampere للحث على إمكانات العمل. وهذا يدل على نضوج الخلايا العصبية وإعادة برمجة ناجحة.
في وقت لاحق، والتحول إلى المشبك الجهد وقياس الصوديوم الداخلي وتأخر تصحيح التيارات البوتاسيوم في الخطوات النازل من 10 millivolts. هنا هو آخر المسجلة biocytin شغل الخلايا العصبية التي تظهر مورفولوجيا الخلايا العصبية ناضجة والعمود الفقري التشعب. هنا، التسجيلات الكهربائية الفيزيولوجية للخلايا العصبية التي أعيد برمجتها تظهر وجود اتصالات وظيفية ما بعد المينابتيكية مع تدابير النشاط العفوية.
تظهر الآثار النشاط المثبط الذي يتم حظره مع picrotoxin ، خصم مستقبلات GABAA والنشاط المثير الذي يتم حظره مع CNQX ، خصم مستقبلات AMPA. تظهر الخلايا العصبية المصححة بالفعل نشاط ما بعد الحقن في خمسة أسابيع بعد الحقن ، وتستمر في ثمانية أسابيع و 12 أسبوعًا بعد الحقن. عدد الخلايا العصبية مع إمكانات العمل الحالية المستحثة يزيد أيضا مع مرور الوقت.
وكشف تحليل أكثر تفصيلا العديد من أنماط اطلاق النار متميزة حيث تظهر غالبية الخلايا سريع ارتفاع النشاط مماثلة لparvalbumin interneurons. أظهر التحليل المناعي الكيميائي في 12 أسبوعًا المزيد من التعبير المشارك للمراسل GFP وparvalbumin. بعد هذا الإجراء يمكنك فحص التعبير الجيني مع التصحيح البحث عن تقنية أو تقييم الاتصال متشابك ثلاثي الأبعاد مع تتبع monosynaptic و iDISCO.
الآن أنه من الممكن إعادة برمجة غليا المقيم في parvalbumin التعبير عن interneurons، بدأنا التحقيق في ما إذا كانت هذه هي أصيلة ويمكن استخدامها كأداة علاجية. تذكر أن تتبع البروتوكولات والمبادئ التوجيهية المعمول بها عند التعامل مع الحيوانات واستخدام فيروس AAV.
