وأيد هذا العمل من قبل إدارة ولاية نيويورك للصحة (C026878). كان لMS الخلايا الجذعية الجديدة يورك مؤسسة، Druckenmiller زميل. بدعم جزئي من البحوث منحة رقم 5 FY11-571 من مارس من الدايمات مؤسسة.

1. إعداد وحدة تغذية الخلايا ملاحظة أنه ينبغي إعداد كل الكواشف هو موضح أدناه في الأزياء العقيمة (انظر الجدولين 1 و 2). هذا البروتوكول يعمل على خط خلية JK1 (خلية Biolabs، وشركة، وأنواع # CBA-315) مغذيات والذي هو مشتق من تحويل خلايا فأر بالغ الجسدية والخصية وقد وصفت في مكان آخر 3. نلاحظ أيضا أن يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح المؤسسية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن الحفاظ على JK1 الخلايا في الثقافة واستخدمت بنجاح كما مغذيات حتى مرور 39. ثقافة JK1 خلايا في طبق 100 ملم زراعة الخلايا (BD الصقر، وأنواع # 353003) مع 10 مل من فلتر تعقيم المغذية المتوسطة النمو (DMEM تستكمل مع 10٪ الجنين مصل بقري [FBS]، 2 مم L-الجلوتامين والمضادات الحيوية). تقسيم عندما يصل التقاء الثقافة 95٪، ونسبة الخلايا 1:06 -1:10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة من متموجة JK1 التغذية أحادية الخليةالطبقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرة واحدة مع طبقة الخلايا PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قبل تحسنت التربسين / EDTA، 1X (0.05٪ trypsin/0.53 ملي EDTA، كورنينج Cellgro، وأنواع # 25-051-CI)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل التربسين مع حجم مساو من النمو المتوسطة المغذية. جمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. اعادة تعليق الخلايا في النمو المتوسطة المغذية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل معطف زراعة الخلايا متعددة وحات جيدة بما فيه الكفاية عن طريق إضافة محلول الجيلاتين 0.4٪ لتغطية البئر وإزالة بعد 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ~ 250 لوحة الخلايا في مم 2 في الخلية الجيلاتين المغلفة لوحة الثقافة (تنسيق مثل 48-جيدا أو 6 جيدا). احتضان الثقافة في C ° 37 من 16 إلى 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ثقافة المتوسط ​​من الآبار. تنبيه: لتعطيل نمو الخلايا، إضافة إلى حل جديدة من ميتوميسين-C في 10 ميكروغرام / مل مخففة في DMEM إلى كل بئر (مثل 200 ميكرولتر / جيد لوحة 48 أيضا). ميتوميسين-C هي سامة. التعامل معها والتخلص منها بعناية. احتضان في37 ° C لمدة 4 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ميتوميسين-C حل من الخلايا. يغسل 3 مرات مع DMEM قبل الخلايا الجذعية الطلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا المغذية DMEM من الآبار وإضافة ما يكفي من الخلايا الجذعية متوسطة (100 ميكرولتر / جيد من 48 لوحة جيدا، وانظر الجدول 3) لمنع الجفاف من خلال الركض مغذيات. إضافة جان معايير الأمان في نفس اليوم، كما هو موضح أدناه في الأقسام 3.1 أو 3.4، استخدام أحجام المشار إليه يحتوي على مغذيات من الآبار. </li></ol> 2. تفكك نسيج الخصية ماوس للحصول على خلايا جرثومة المانحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخصيتين الحصاد الماوس الكبار في عالم الأزياء العقيمة والتخزين المؤقت لالخصيتين في طبق بتري المغطاة (بدون أي سائل مضاف). يجب وضع الطبق على الفور على الجليد لمنع أصاب والحفاظ على بقاء الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط معقم وغرامة غرامة مقص في خلية ثقافة هود، وجعل شق عرضي في الغلالة البيضاء الغلالة دون transecting تماما الخصية (أي قطع ½ ~ - ¾ المسافة عبتيough) واستخدام ملقط للضغط على الأنابيب المنوية في زاوية من اللوحة؛ الغلالة تجاهل والأنسجة المرفقة. تبقي لوحة على الجليد في جميع أنحاء الأنسجة للحفاظ على مبرد، مما يحافظ على سلامتها ومنع التبخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللحم المفروم بسرعة الأنابيب مع مقص الربيع غرامة لا تقل عن 3 دقائق في الخصية، مع الحفاظ على لوحة الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع شظايا أنبوب صغير في أنبوب مخروطي 50 مل مل ويغسل في 40 ~ من المصل البقري المبرد PBS / 1٪ الألبومين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 60 x ج لمدة 10 دقيقة لفصل أجزاء من الحيوانات المنوية أنبوب صغير والحطام. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب 15 مل المخروطية، وإعادة تعليق بيليه في 3 مل لكل من الخصية العازلة التفكك قبل تحسنت (DMEM، التربسين 0.05٪، 0.03٪ كولاجيناز نوع I، 80 U / مل من الدناز I و 0.5٪ مصل بقري الزلال، وانظر الجدول (2) لتفاصيل أكثر تحديدا من التفكك العازلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب مخروطي الشكل أفقيا في رفوف في مجموعة شاكر إلى 150 دورة في الدقيقة في C ° 37 لمدة 15 دقيقة لتحقيق أقصى قدر منgitation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في 60 x ج لمدة 10 دقيقة واحدة للخلايا منفصلة عن قطع undissociated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ أجزاء تحتوي على بيليه حتى الخطوة التالية. جمع طاف من الخطوة 2.8 وإضافة 3 مل DMEM/10٪ مصل بقري جنيني لتحييد التفكك العازلة. وضع أنبوب على الجليد مؤقتا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2،6 حتي 2،7 مع بيليه حفظ من الخطوة 2.9 إلى إعادة هضم قطع المتبقية بعد الخطوة 2.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من FBS DMEM/10٪ لتحييد التفكك العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعليق أعد تجميع من الخطوة 2،11 مع التعليق الخلية حفظ من الخطوة 2.9. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز × 300. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه في وسط الخلايا الجذعية في حجم من 16 مل لكل زوج من الخصيتين (انظر الجدول 3). </li></ol> 3. الطلاء من تعليق الخلية الخصية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 2 مل من تعليق خلية لكل بئر في 6 خلايا لوحة المغذية بشكل جيد تحتوي على ميتوتيكلي] المعطل مع C-ميتوميسين ومكان في خلية حاضنة الثقافة في 37 ودرجة؛ C في 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 48 المتوسطة، والموارد البشرية الرشفة، إضافة 2 مل الطازجة المتوسطة والعودة إلى الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 48 ساعة، إضافة 0.5 مل الخلايا الجذعية متوسطة جديدة إلى كل بئر والعودة إلى الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 48 ساعة، في وقت لاحق تغذية الخلايا ثلاث مرات في الأسبوع بعد ذلك على النحو التالي حتى كبيرة، والمستعمرات سرية (&gt; 50 خلية) تظهر (في غضون 7 إلى 21 يوما). ل(الاثنين والأربعاء مثلا) الأولى والثانية تغذية إزالة كل أسبوع ~ 50٪ من المتوسط ​​وإضافة إلى الوراء 50٪ من حجم متوسط ​​الطازجة. للتغذية الثالثة (على سبيل المثال الجمعة)، نضح المتوسطة واستبدال جميع مع متوسط ​​2 مل الطازجة. ويستند هذا النهج على الأساس المنطقي أن تجنب التغييرات المتوسطة كاملة يقلل التقلبات في تركيزات إشارات نظير الصماوي أن تفرز في ثقافة المتوسط ​​9. </li></ol> 4. الإلتقاط المستعمرة لمرور الأول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المستعمرات المتوسطة من الآبار التي تحتوي على أن passaged وإضافة جديدة المتوسطة الخلايا الجذعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الهدف باستخدام المستعمرات 10X. مع المجهر قليلا دي مركزة، سوف المستعمرات SSC على حافة البئر تظهر كتل متجانسة مشرق، يتألف من العديد من الخلايا قطر 11-12 ميكرومتر، والتي من الصعب أو من المستحيل تمييز حدود الخلايا الفردية، لأن الخلايا تظهر تنصهر معا (الشكل 1A). يجوز لغير SSC المستعمرات تظهر أكثر قتامة وأكثر الحبيبية، أو متجانسة أقل، بحدود ملحوظ (الشكل 1A، أقحم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة تلميح إلي 200 ميكرولتر، مع مجموعة pipetteman إلى 50 ميكرولتر، واتخاذ أولا المتوسطة من البئر وطرد لترطيب الطرف. ثم، دفع بلطف مع طرف مستعمرة قبل الانسحاب بسرعة 50 ميكرولتر من المتوسط ​​لطرد المستعمرة عن طريق الشفط في تلميح (1B الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرد المتوسطة التي تحتوي على مستعمرة واحدة من لوحة جيدا 48-المغذية بشكل جيد تحتوي على خلايا المعطل مع 100 ميكرولتر من الخلايا الجذعية متوسطة (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة4.3 و تضيف ما يصل إلى 8 المستعمرات إلى البئر نفسه دون تجاوز 500 ميكرولتر لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 4،3 حتي 4،5 لإعداد آبار إضافية من لوحة 48 جيد مع مرور SSC المستعمرات واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف تكون على استعداد لآبار تقسيم في 7-14 أيام أو بعد كتل كبيرة تصل إلى خلايا ظهرت دينا 500 (1D الشكل). </li></ol> 5. لاحقة التوسع والركض من جان معايير الأمان من سحن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي subcultured الخلايا في إحدى الفقرات على مغذيات جديدة بعد تصل إلى 14 يوما في نسبة انقسام 01:02 لأول 3 مقاطع ومن ثم 1:04 حتي 01:06 (كل 7 أيام) بعد ذلك على النحو التالي. يسحن بلطف المستعمرات من بئر شبه متموجة (على سبيل المثال ~ 300،000 جان معايير الأمان / 6 جيدا جيدا لوحة) مع نصيحة 1 مل ماصة عن طريق الغسيل المتوسطة عبر الخلايا. ويمكن ملاحظة مستعمرات فصل. والكثير من القوة مع تيار من السائل يدفع الخلايا المغذية للخروج من الملعب غير المرغوب فيها أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا triturated في أنبوب مخروطي الشكل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة5 دقائق. ملاحظة: قد يكون خطوة trypsinization أضاف بأمان هنا إذا رغبت من قبل المحقق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف والمتوسطة في الخلية الجذعية الطازجة إعادة تعليق من جانب pipetting بدقة أعلى وأسفل لتعطيل المستعمرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جان معايير الأمان على الخلايا المغذية لوحة الطازجة المعطل مع ميتوميسين-C كما هو موضح في القسم 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغذية الخلايا ثلاث مرات في الأسبوع على النحو التالي. للتغذية الأولى والثانية (على سبيل المثال الاثنين والأربعاء) إضافة 50٪ من حجم متوسط ​​الطازجة. للتغذية الثالثة (على سبيل المثال الجمعة)، نضح المتوسطة واستبدال جميع مع متوسط ​​2 مل الطازجة. وسوف تصبح لوحات متموجة في 7-10 أيام. يجب أن تتألف من الثقافات&gt; الخلايا الجرثومية 98٪ (أي &lt;1٪ تلويث الخلايا الجسمية) بعد الممرات 5-7 و يعتمد على المناعية (على سبيل المثال باستخدام الخلايا الجرثومية الفئران علامة GCNA) لتمييز الخلايا الجرثومية من خلايا جسدية 10. ملاحظة: تم تطوير تلك الأساليب في الامتثال للأنظمة والشروط المنصوص عليها من قبل المؤسسةشركة رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام في كلية طب وايل كورنيل. </li></ol>

<ol>
	<li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+proliferation+in+culture+and+germline+transmission+of+mouse+male+germline+stem+cells.">Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells.</a> Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).</li><li>Seandel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+multipotent+adult+stem+cells+from+GPR125++germline+progenitors.">Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors.</a> Nature. 449, 346-350 (2007).</li><li>Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34++testicular+stromal+cells+support+long-term+expansion+of+embryonic+and+adult+stem+and+progenitor+cells.">CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells.</a> Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).</li><li>Ogawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+morphological+characterization+of+mouse+spermatogonial+stem+cell+lines.">Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).</li><li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+aging+is+detrimental+to+mouse+spermatogonial+stem+cell+function.">In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function.</a> Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).</li><li>Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+male+germ+line+stem+cells+in+mice.">Aging of male germ line stem cells in mice.</a> Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).</li><li>Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plzf+regulates+germline+progenitor+selfrenewal+by+opposing+mTORC1.">Plzf regulates germline progenitor selfrenewal by opposing mTORC1.</a> Cell. 142, 468-479 (2010).</li><li>Nagano, M., Ryu, B. Y., Brinster, C. J., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+mouse+male+germ+line+stem+cells+in+vitro.">Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro.</a> Biol. Reprod. 68, 2207-2214 (2003).</li><li>Csaszar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells+by+automated+control+of+inhibitory+feedback+signaling.">Rapid expansion of human hematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedback signaling.</a> Cell Stem Cell. 10, 218-229 (2012).</li><li>Enders, G. C., May, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+regulated+expression+of+a+mouse+germ+cell+nuclear+antigen+examined+from+embryonic+day+11+to+adult+in+male+and+female.">Developmentally regulated expression of a mouse germ cell nuclear antigen examined from embryonic day 11 to adult in male and female.</a> 163, 331-340 (1994).</li><li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+spermatogonial+stem+cell+self-renewal+in+mammals.">Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 263-286 (2008).</li><li>Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+following+male+germ-cell+transplantation.">Spermatogenesis following male germ-cell transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, 11298-11302 (1994).</li><li>Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+Cell+Transplantation+and+Testis+Tissue+Xenografting+in+Mice.">Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice.</a> J. Vis. Exp. (60), e3545 (2012).</li><li>Arnold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2(+)+adult+stem+and+progenitor+cells+are+important+for+tissue+regeneration+and+survival+of+mice.">Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice.</a> Cell Stem Cell. 9, 317-329 (2011).</li><li>Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+short-term+in+vitro+assay+for+mouse+spermatogonial+stem+cells.">Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).</li></ol>

MS يتلقى الإتاوات من كلية طب وايل كورنيل من خلال الترخيص لشركة الخليوي، Biolabs لتوزيع JK1 الخلايا.

هذا الأسلوب لاشتقاق الكبار جان معايير الأمان باستخدام الخلايا المغذية للخصية الكبار المستمدة قوية ونجحت عندما كانوا يعملون الخلفيات الوراثية الشائعة (مثل FVB، وC57Bl6 129SV/C57Bl/6 مختلطة) وسلالات متحولة مختلفة 2،3،7،14. في الواقع، فإن المكروية التي أنشأتها الثقافة ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> كورنينج </td><td> 10-013 </td><td> مخفف لتفارق العازلة </td></tr><tr><td> التربسين / EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25-051-CI </td><td></td></tr><tr><td> متوسطة الجذعية قاعدة الخلية (StemPro-34) </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 10639-011 </td><td> يتطلب مكملات حسب شينوهارا وآخرون. (2003) * </td></tr><tr><td> وقف المكملات المتوسطة الخلية </td><td> مختلف </td><td> أنظر الجدول 3 </td><td> يتطلب مكملات حسب شينوهارا وآخرون. (2003) * </td></tr><tr><td> JK1 الخلايا </td><td> خلية Biolabs، وشركة </td><td> CBA-315 </td><td> يمكن أن تكون بديلا مع الخلايا اللحمية الكبار الخصية وآخرون في آل Seandel. (2007) </td></tr><tr><td> ميتوميسين-C (تنبيه) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M4287 </td><td> السامة؛ معالجة بعناية. </td></tr><tr><td> الجيلاتين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G1890 </td><td> 0.4٪ حل في الماء </td></tr><tr><td> EVOS XL الرقمية مجهر مقلوب </td><td> المجموعة المتقدمة المجهر </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 1. الكواشف والمعدات الخاصة. * انظر الجدول 3 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> كورنينج </td><td> 10-013 </td><td> مخفف لتفارق العازلة </td></tr><tr><td> التربسين (1:250) </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 27250-018 </td><td> التفكك العازلة: نهائي 0.05٪ بالوزن / المجلد </td></tr><tr><td> كولاجيناز، اكتب I، 235 U / مل </td><td> ورثينجتون </td><td> CLS1 235 </td><td> التفكك العازلة: نهائي 0.03٪ بالوزن / المجلد </td></tr><tr><td> الدناز I </td><td> Sigmوالدريخ </td><td> DN25 </td><td> التفكك العازلة: نهائي 80 U / مل </td></tr><tr><td> الأبقار مصل الزلال </td><td> ICP بيو </td><td> ABRE-100G </td><td> التفكك العازلة: 0.5٪ بالوزن النهائي / المجلد </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 2. التفكك العازلة </td></tr><tr><td> StemPro-34 SFM </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> StemPro-34 الملحق المغذيات </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> ملاحق إضافية ** </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> غير الأحماض الأمينية الأساسية </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M7145 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> MEM فيتامين الحل </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 11120-052 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> الجلوتامين L- </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 </td><td> 2 مم </td></tr><tr><td> الأبقار مصل الزلال </td><td> ICP بيو </td><td> ABRE </td><td> 0.50٪ </td></tr><tr><td> للمضادات الحيوية درجة التأثير الحل </td><td> Mediatech </td><td> 30-004-CI </td><td> 1X </td></tr><tr><td> D (+) الجلوكوز </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G8769 </td><td> 6 ملغ / مل </td></tr><tr><td> β-استراديول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> E2758 </td><td> 30 نانوغرام / مل </td></tr><tr><td> البروجسترون </td><td> Calbiochem </td><td> 5341 </td><td> 60 نانوغرام / مل </td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> متغير </td><td> N / A </td><td> 1٪ </td></tr><tr><td> الأبقار هولو-ترانسفيرين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> T1283 </td><td> 100 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> الأنسولين </td><td> الجوزاء الحيوية المنتجات </td><td> 700-112P </td><td> 25 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> الإنسان GDNF </td><td> الحياة ميتاليكاذكر </td><td> PHC7041 </td><td> 10 نانوغرام / مل </td></tr><tr><td> الإنسان bFGF </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> PHG0023 </td><td> 10 نانوغرام / مل </td></tr><tr><td> الماوس EGF </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> PHG0313 </td><td> 20 نانوغرام / مل </td></tr><tr><td> بوتريسين </td><td> البحث العضوية </td><td> 0778P </td><td> 60 ميكرومترا </td></tr><tr><td> الصوديوم Selenite </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S5261 </td><td> 30 نانومتر </td></tr><tr><td> حمض البيروفيك </td><td> الفا Aesar </td><td> A13875 </td><td> 30 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> DL-حمض اللبنيك </td><td> JT بيكر </td><td> 0196-04 </td><td> 1 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> β-المركابتويثانول </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 21985-023 </td><td> 50 ميكرومتر </td></tr><tr><td> حمض الاسكوربيك </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A4544 </td><td> 100 ميكرومتر </td></tr><tr> &lt;TD&gt; D-البيوتين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> B4639 </td><td> 10 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 3. وقف المتوسطة الخلية </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * ملاحظة: إضافة ملاحق أدناه قبل استخدام المتوسط. تصفية تعقيم وابقائه في C. ° 4 وسيلة مستقرة لمدة لا تقل عن 2 أسابيع. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ** نحن قد استخدمت شركات مختلفة، تركيبات، و / أو أرقام الكثير من هذه الكواشف دون آثار ضارة أي واضح. بشكل عام، يجب أن تستخدم الكواشف الخلية الصف الثقافة. </td></tr></tbody></table>

serial enrichment of spermatogonial stem and progenitor cells (sscs) in culture for derivation of long-term adult mouse ssc lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly the lifetime of the animal. While the precise mechanisms that govern self-renewal and differentiation in vivo are challenging to study, various systems have been developed previously to propagate murine SSCs in vitro using a combination of specialized culture media and feeder cells1-3.
Most in vitro forays into the biology of SSCs have derived cell lines from neonates, possibly due to the difficulty in obtaining adult cell lines4. However, the testis continues to mature up until ~5 weeks of age in most mouse strains. In the early post-natal period, dramatic changes occur in the architecture of the testis and in the biology of both somatic and spermatogenic cells, including alterations in expression levels of numerous stem cell-related genes. Therefore, neonatally-derived SSC lines may not fully recapitulate the biology of adult SSCs that persist after the adult testis has reached a steady state.
Several factors have hindered the production of adult SSC lines historically. First, the proportion of functional stem cells may decrease during adulthood, either due to intrinsic or extrinsic factors5,6. Furthermore, as with other adult stem cells, it has been difficult to enrich SSCs sufficiently from total adult testicular cells without using a combination of immunoselection or other sorting strategies7. Commonly employed strategies include the use of cryptorchid mice as a source of donor cells due to a higher ratio of stem cells to other cell types8. Based on the hypothesis that removal of somatic cells from the initial culture disrupts interactions with the stem cell niche that are essential for SSC survival, we previously developed methods to derive adult lines that do not require immunoselection or cryptorchid donors but rather employ serial enrichment of SSCs in culture, referred to hereafter as SESC2,3.
The method described below entails a simple procedure for deriving adult SSC lines by dissociating adult donor seminiferous tubules, followed by plating of cells on feeders comprised of a testicular stromal cell line (JK1)3. Through serial passaging, strongly adherent, contaminating non-germ cells are depleted from the culture with concomitant enrichment of SSCs. Cultures produced in this manner contain a mixture of spermatogonia at different stages of differentiation, which contain SSCs, based on long-term self renewal capability. The crux of the SESC method is that it enables SSCs to make the difficult transition from self-renewal in vivo to long-term self-renewal in vitro in a radically different microenvironment, produces long-term SSC lines, free of contaminating somatic cells, and thereby enables subsequent experimental manipulation of SSCs.

ظهور نوع صفر مرور البرية، يظهر الكبار المستعمرات SSC بعد 7 أيام في الشكل 1. وتتكون ثلاثية الأبعاد من المستعمرات طبقة من الخلايا المسطحة التي تعلق على مغذيات أو مصفوفة خارج الخلية تلميذه المودعة من قبل مغذيات مع طبقات متعددة من جان معايير الأمان المتزايد على ال...

Watch this Scientific Journal Video about Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines at JoVE.com

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

ويرد طريقة بسيطة لاستخلاص والحفاظ الجذعية الظروف المناسبة وخطوط الخلايا السلف من الفئران البالغة هنا. الأسلوب يستخدم الخلايا المغذية القادمة من المقصورة الخلية الجسدية للخصية الفأر الكبار. هذه التقنية قابلة للتطبيق على سلالات الفئران شيوعا، بما في ذلك المعدلة وراثيا، خارج المغلوب، وتدق في الفئران.

مسلسل إثراء الجذعية والخلايا الاولية الظروف المناسبة (جان معايير الأمان) في الثقافة لاشتقاق على المدى الطويل الكبار ماوس خطوط SSC

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

serial-enrichment-spermatogonial-stem-progenitor-cells-sscs-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

13.7K Views.  Weill Cornell Medical College. ويرد طريقة بسيطة لاستخلاص والحفاظ الجذعية الظروف المناسبة وخطوط الخلايا السلف من الفئران البالغة هنا. الأسلوب يستخدم الخلايا المغذية القادمة من المقصورة الخلية الجسدية للخصية الفأر الكبار. هذه التقنية قابلة للتطبيق على سلالات الفئران شيوعا، بما في ذلك المعدل...

Video: Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

العزلة وتوقعات بنمو كبير من الكبار الإنسان خلايا غشائي السلف تشكيل مستعمرة

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

اشتقاق الخلايا الجذعية من الأرومة الغاذية Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية الظهارية من الجلد البشري

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

على المدى الطويل اختبار السمية المهلكة مع القشريات الأرتيميا franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

العزلة وثقافة فردية وMyofibers زنزاناتهم القمر الصناعي من العضلات الهيكلية الكبار

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

ناقضة العظم اشتقاق من الفأر نخاع العظم

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...