طريقة بسيطة وغير مكلفة أن نسميه MDR يسمح لك لعزل السكان المخصب من الحيوانات المنوية pachytene، الحيوانات المنوية جولة والحيوانات المنوية ممدود من الخصيتين الماوس. الميزة الرئيسية لطريقة MDR هي بساطتها. تحتاج فقط إلى معدات مختبرية قياسية متوفرة في معظم مختبرات البحوث الطبية الحيوية.
بروتوكول MDR هو عظيم للباحثين القيام بدراسات وظيفية على الخلايا الجرثومية الذكور. على سبيل المثال، المجموعات التي تدرس تكوين الحيوانات المنوية، والعوامل التي تؤثر على خصوبة الذكور، وكذلك الميراث اللاجينية الأب. مطلوب الحد الأدنى من المواد الأولية لأسلوب MDR.
وفي الواقع، ونحن الحصول على كمية جيدة من الخلايا بشكل روتيني باستخدام واحد فقط الماوس الذكور الكبار. تبدأ من خلال إعداد المعدات اللازمة والكواشف. تعيين حمام مائي إلى 37 درجة مئوية وحاضنة ثقافة الخلية 34 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة 95٪.
وضع أنبوب الدوار داخل الحاضنة. إعداد وتسمية الكمية المناسبة من الشرائح الزجاجية المجهرية، ثم رسم حلقة من حوالي سنتيمتر واحد في القطر مع قلم الشحوم، والسماح للشحوم الجافة. عندما تكون على استعداد لتشريح الحيوان، رش البطن البطني من الماوس مع 70٪ الإيثانول واستخدام مقص لجعل فتح شكل V في تجويف الحوض البطن.
سحب على لوحة الدهون epididymal مع ملقط، وتحديد موقع الخصية وإزالتها مع مقص، مع التأكد من تجنب إزعاج albuginea tunica. ضع الخصيات على طبق بيتري ستة سنتيمترات يحتوي على 1X KREBS. تفكيك الخصيتين والتخلص من tunica albuginea، ثم تفريق قليلا الأنابيب seminiferous عن طريق إغاظة بلطف لهم وبصرف النظر مع ملقط.
نقلها إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر يحتوي على مليلترين من محلول الكولاجين الطازج. احتضان الأنابيب في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق، وتهيج لهم بلطف عن طريق هزاز. ثم إضافة ما لا يقل عن 40 ملليلتر من 1X KREBS دافئة والسماح الأنابيب إلى الرواسب في درجة حرارة الغرفة.
إزالة ناظر وكرر غسل مرة أخرى. إضافة 25 ملليلتر من محلول التربسين الطازجة. ضع الأنبوب على الدوار داخل حاضنة ثقافة الخلية، واتركه هناك لمدة 15 إلى 20 دقيقة، وتناوب عند حوالي 15 دورة في الدقيقة.
تحقق بشكل متقطع من الأنابيب. مرة واحدة يصبح الحل غائما وقطع صغيرة فقط من الأنابيب تبقى، ووضع أنبوب على الجليد والمضي قدما في الخطوة التالية. تصفية الحل من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر على الجليد.
ثم الطرد المركزي في 600 × ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية ل بيليه الخلايا. صب بعناية خارج supernatant والاستفادة من بيليه الخلية لإعادة تعليق الخلايا في ما تبقى من 1X KREBS. إضافة ما لا يقل عن 40 ملليلتر من 1X KREBS الباردة إلى الخلايا resuspended وكرر الطرد المركزي.
إعادة تعليق الخلايا عن طريق النقر على الأنبوب. ثم قم بتركيب طرف ماصة على ماصة ملليلتر واحدة وقطعها بحيث تكون الفتحة قطرها حوالي ثلاثة ملليمترات. إضافة ما يصل إلى ثلاثة ملليلتر من 0.5٪ BSA في كريبس.
Resuspend الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا، مع التأكد من تجنب فقاعات. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفّر 40 ميكرومتر ثم انتقل على الفور إلى تحميل الخلايا على تدرج BSA. يجب أن تحصل على تعليق خلية واحدة متجانسة قبل تحميل الخلايا على التدرج.
سوف تتجمع الخلايا الرسوبية بشكل أسرع، وتعطيل التدرج الخاص بك وتلويث الكسور. إعداد أنبوب 50 ملليلتر عموديا على الجليد، والتأكد من أنه من الممكن أن نرى جانب واحد من الأنبوب. ثم قطع حوالي خمسة إلى عشرة ملليمترات من غيض من ماصة مصلية ملليلتر عشرة ملليلتر وجبل على وحدة تحكم ماصة.
Pipette خمسة ملليلتر من 5٪ BSA الحل في الجزء السفلي من أنبوب 50 ملليلتر. لمس بلطف سطح الحل 5٪ مع غيض قطع من ماصة وطبقة ببطء خمسة ملليلتر من 4٪ BSA حل على رأس الحل 5٪. كرر هذا الإجراء مع حلول BSA الأخرى للحصول على تدرج من 5٪ إلى 1٪ BSA.
يجب أن يكون الخط الواضح مرئيًا بين الطبقات. ثم قم بتحميل تعليق الخلية المفردة بعناية فوق التدرج دون إزعاجه. السماح للخلايا الترسبات من خلال التدرج لمدة ساعة ونصف.
باستخدام طرف ماصة قطع، وجمع بعناية الكسور ملليلتر واحد في أنابيب منفصلة 1.5 ملليلتر وتخزينها على الجليد، والتأكد من ترقيم الأنابيب في الترتيب الذي تم جمعها. طرد مركزي كسور الخلية الجرثومية في 600 x ز لمدة عشر دقائق في أربع درجات مئوية. ثم الحرص على عدم إزعاج بيليه، والتخلص من معظم supernatant و resuspend الخلايا عن طريق الخفقان الأنبوب.
إضافة ملليلتر واحد من الجليد الباردة 1X كريبس العازلة إلى كل أنبوب وتكرار الطرد المركزي. تجاهل معظم من عظمى، وترك حوالي 100 ميكرولترات وإعادة بيليه الخلية بعناية. لتحليل كسور الخلية، ابدأ عن طريق الأنابيب 20 ميكرولترات من 4٪ شبهformaldehyde داخل كل حلقة قلم الشحوم على شريحة مجهرية مرقمة.
على الفور إضافة اثنين microliters من الخلايا resuspended من الكسر المقابل. ثم جفف الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل. شطف الشرائح مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني واستخدام المتوسطة المتصاعدة مع DAPI لتركيب الشرائح.
تحليل كل شريحة تحت مجهر الفلوريسنس لتقدير أي نوع من الخلايا الجرثومية المخصب في كل كسر. مرة واحدة وقد اتخذت عينة من كل جزء للمجهر، إضافة ملليلتر واحد من الجليد البارد 1X KREBS إلى كل كسر والطرد المركزي الخلايا إلى أسفل في 600 إلى 13000 x ز لمدة عشر دقائق في أربع درجات مئوية. إزالة وتجاهل نابيرات والاستمرار في تحليل المصب المفضل.
يعمل هذا البروتوكول بشكل جيد بشكل خاص لإثراء الحيوانات المنوية المستديرة. وقد تحقق التخصيب فوق 90 في المائة في الكسور 2 و3 و4. تميل الحيوانات المنوية الممدود إلى البقاء على قمة التدرج وتم جمعها مع الكسر الأول.
بسبب حجمها الكبير، pachytene الحيوانات المنوية الرواسب أسرع وتم جمعها الماضي. وكان التخصيب حوالي 75٪ في الكسور 14 و 15. مجموع الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من غالبية الكسور تراوحت بين 0.5 و 2.5 ميكروغرام، وهو ما يكفي لتحليلات الحمض النووي الريبي المصب.
وتراوحت كمية البروتين التي يتم الحصول عليها من كل كسر عادة من 20 إلى 140 ميكروغرام، وهو ما يكفي لعدة بقع غربية. في هذا البروتوكول، كان 10٪ من البروتين المستمدة من كسور واحدة كافية للكشف بوضوح DDX4، PIWIL1 و PIWIL2 البروتينات على لطخة الغربية القياسية. كمية البروتين في جزء واحد كانت كافية أيضاً للمناعة باستخدام جسم مضاد ضد PIWIL1 وكذلك للكشف عن PIWIL2 ذاتية المناعة.
حتى بالنسبة لجهاز توقيت أول، يعمل هذا البروتوكول بشكل جيد طالما أنك تتأكد من أن المعالجة المسبقة للخلايا الخاصة بك جيدة، ولا شيء يزعج التدرج الخاص بك أثناء الترسيب. من فأرة واحدة، يمكنك الحصول على خلايا عالية التخصيب، والتي يمكن استخدامها لتحليلات المصب مختلفة مثل RT-PCR، تسلسل الحمض النووي الريبي، المناعة النشاف الغربية. في حين أن MDR ليست الطريقة الوحيدة لإثراء الخلايا الجرثومية الذكور، بل هو أداة مريحة للغاية لأنه لا يتطلب أي معدات متخصصة أو تدريب مكثف.
