يمكن استخدام هذه الطريقة الفعالة الجديدة لعزل الاكتظاظ الفرعي لـ spermatocytes و spermatids من الفئران البالغة للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة الكامنة في الداء والحيوانات المنوية. يستخدم هذا الأسلوب صبغة الحمض النووي المنخفضة السمية للخلايا مع طيف واسع من الإثارة التي يمكن تطبيقها على معظم أوامر FACS المستخدمة حاليًا. هذا الأسلوب هو مباشرة جداً.
الجانب الأكثر تحديا هو جات عملية الجاتم للخلايا تدفق ولكن استراتيجية مفصلة الغات ينبغي أن تساعد في تكييف البروتوكول إلى غيرها من فرز الخلايا. ومن بين الاجراءات سيكون يو هان يه مساعد باحث من مختبر ساتوشي تمكاوا. بعد حصاد كل من الخصيتين من فأر ذكر عمره ثمانية أسابيع ، ضع الأنسجة في طبق بيتري 60 ملليمترًا يحتوي على ملليلترين من PBS البارد الجليدي وإزالة tunica albuginea.
فصل بلطف الخصيتين مع ملقط لتفريق قليلا الأنابيب seminiferous. ونقل الأنابيب إلى قطرة من الجليد الطازج برنامج تلفزيوني الباردة في طبق بيتري 100 ملليمتر. استخدام ملقط لفك بلطف الأنابيب وغسل الأنابيب في ثلاث قطرات إضافية من برنامج تلفزيوني كما هو موضح للتو.
بعد الغسيل الأخير ، ضع الأنابيب شبه المتحللة في أنبوب 15 ملليلتر ، يحتوي على ميليلترين من عازلة الانفصام لاحتضان لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لميصة بلطف الأنابيب 20 مرة، قبل إعادة الأنبوب إلى الحاضنة لمدة ست دقائق إضافية. في نهاية الحضانة ، الماصات الأنسجة 20 مرة إضافية ، قبل إعادة الأنبوب إلى الحاضنة.
بعد ثلاث دقائق، الماصات بلطف الأنابيب 10 مرات أو حتى لا تبقى قطع الأنسجة مرئية، قبل وقف تفكك مع 10 ملليلتر من عازلة FACS. ثم، الطرد المركزي إلى تعليق الأنسجة مرتين باستخدام 10 ملليلتر إضافية لمخزن FACS الطازجة لغسل الثانية لإزالة الحيوانات المنوية والحطام أكبر قدر ممكن. لطخة الخلايا لتحليل تدفق cytometric، إعادة تعليق بيليه في ثلاثة ملليلتر من العازلة FACS.
وتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية النايلون 70 ميكرون، في أنبوب 50 ملليلتر. بعد العد، نقل 10٪ من الخلايا إلى أنبوب جديد على الجليد كتحكم سلبي غير مقع. وخلط دقيق ستة microliters من وصمة عار DCV في تعليق الخلية المتبقية.
بعد حضانة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في الظلام مع اهتزاز لطيف كل 10 دقائق، إضافة خمسة ميكرولترات من DNase الأول إلى الخلايا. وتصفية الخلايا من خلال 35 ميكرون مصفاة شبكة النايلون في أنبوب FACS خمسة ملليلتر على الجليد. لتحليل تدفق الخلايا السيتوميترية، قم بإنشاء تجربة جديدة في برنامج تحليل التدفق، وتحت قائمة أدوات ورقة العمل، انقر فوق كثافة جديدة لإنشاء منطقة مبعثر إلى الأمام مقابل رسم كثافة المنطقة على مقياس خطي.
انقر فوق مدرج التكراري الجديد لإنشاء رسم مدرج التكراري الأزرق DCV على مقياس لوغاريتمي. وانقر فوق ابدأ وسجل لبدء معالجة عينة غير الملطخة. أثناء تشغيل العينة، انقر فوق كشف وإعدادات العتبة لضبط كل من الفولتية PMT مبعثرة إلى الأمام والجانب لوضع الخلايا غير المطّلعة على مقياس المؤامرة مبعثر إلى الأمام والخلف.
ضبط الجهد PMT لقناة jappy لتحديد موقع السكان السلبي DCV في العقد الأول من مؤامرة DCV الرسم البياني الأزرق لوغاريتمي. ثم انقر فوق إيقاف لإلغاء تحميل نموذج غير المُطَعَى. بعد دوامة لفترة وجيزة وتحميل العينة الملطخة، انقر فوق أنبوب المقبل لإنشاء ورقة عمل جديدة للعينة.
تعيين مقياس السيتا للحصول على ما لا يقل عن واحد مرات 10 للأحداث الستة، وانقر فوق ابدأ وسجل. بعد ذلك، انقر فوق كثافة جديدة لإنشاء ارتفاع مبعثر إلى الأمام مقابل عرض التشتت الأمامي. وDCV الأزرق مقابل DCV الحمراء كثافة المؤامرات على مقياس خطي.
على منطقة التشتت الأمامية مقابل مؤامرة كثافة المنطقة الخلفية، استخدم أداة المضلع لرسم بوابة تسمى الخلايا لتشمل معظم الخلايا واستبعاد الحطام الصغير. تطبيق هذه البوابة إلى ارتفاع مبعثر إلى الأمام مقابل رسم عرض مبعثر إلى الأمام واستخدام أداة المستطيل لرسم بوابة خلية واحدة لاستبعاد الخلايا المفردة غير. تطبيق بوابة الخلية المفردة على مخطط الكثافة اللون الأزرق DCV مقابل DCV وضبط المقياس لالتقاط ملف تعريف موسع.
استخدم أداة المضلع لرسم بوابة DCV لاستبعاد الخلايا غير المُطَفَقة وفئات الجانب، وتطبيق البوابة على رسم مدرج التكراري الأزرق DCV على مقياس خطي. تشير القمم الرئيسية الثلاث إلى محتويات الحمض النووي المختلفة 1C و 2C و 4C. إنشاء الأزرق DCV الثاني مقابل مؤامرة DCV الكثافة الحمراء على مقياس خطي.
وبوابة العودة بوابة DCV على المؤامرة لتحديد موقع السكان 1C و 4C. إنشاء الأزرق DCV آخر مقابل مؤامرة الكثافة الحمراء DCV على مقياس خطي. واستخدام أداة القطع الناقص لرسم بوابة على السكان 1C.
استخدام أداة المضلع لبوابة السكان 4C مع منحنى مستمر. وخلق آخر DCV الأزرق مقابل مؤامرة الكثافة الحمراء DCV على مقياس خطي. استخدام أداة المضلع لإنشاء بوابة واحدة 4C.
في مؤامرة جديدة إلى الأمام إلى جانب مبعثر، واستخدام أداة القطع الناقص لإنشاء pachytene، diplotene واللبيتوتين، وبوابات zygotene spermatocyte. عندما تم رسم جميع البوابات ، قم بإنشاء DCV الأزرق الجديد مقابل مؤامرة نقطة اللون الأحمر DCV على مقياس خطي لتطبيق بوابة 4C لضمان أن السكان الثلاثة في ترتيب مستمر داخل البوابة. بعد ذلك، قم بإنشاء منطقة جديدة للأمام مبعثر مقابل مؤامرة كثافة المنطقة الخلفية على مقياس خطي، وحدد الحجم الموحد للخلايا كسكان من الحيوانات المنوية المستديرة النقية.
بعد الفرز، و purities ممثل من اللبوتين المنفصلة، zygotene، pachytene وdelotene كسور الحيوانات المنوية وعادة ما تكون بين 80٪ إلى 90٪كما أكد SYCP3 وغاما H2AX المناعة. ويمكن تأكيد نقاء فصيل الحيوانات المنوية جولة من نواة تلطيخ مع DCV في تركيبة مع Sp56 وH1t تلطيخ، وأيضا عادة حول 90٪ قابلية بقاء مجموعات الخلايا المعزولة عادة ما تكون أكثر من 95٪، ومتوسط الغلة الإجمالية لكل جزء من فأرة الكبار واحد عادة ما تكون كافية لتحليل المصب المختلفة. يمكن استخدام الخلايا المفرزة لتحليل تسلسل الجيل التالي المتنوع لاستكشاف التعبير الجيني والتنظيم أثناء تكوين الحيوانات المنوية بشكل أفضل.
