وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة 1R21HL092370-01 (GG)، 1R01 HL095764-01 (GG)؛ R01HL082694 (JW)؛ جمعية القلب الأمريكية، المؤسسين التابعة لها (0855943D، GG)؛ ستوني القفر - هربرت الصندوق، نيويورك (SHP).

1. إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول التالية وأنابيب (الجدول 1) على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هانكس الحل، لا الكالسيوم والمغنيسيوم أو مؤشر مع البنسلين (100 U / مل) / الستربتوميسين (100 ملغ / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 1X، الكالسيوم لا، لا المغنيسيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإيثانول و 70٪، وجعل 500 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزنة الفورمالديهايد، 7-10٪ مع PBS، وجعل 500 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخدير الحلول: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> AVERTIN. إضافة 5 مل من بعناية بيوتانول-2-الميثيل-2 إلى 5 غ من ثلاثي بروم إيثانول، 2،2،2. حل مرة واحدة، والحفاظ على محلول المخزون في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تأخذ 0.25 مل من محلول المخزون وتمييع مع 10 مل من 1xPBS في زجاجة أسفل الزجاج. التفاف زجاجة مع رقائق الألومنيوم، ومكان عند 37 درجة مئوية حتى يذوب ثم قسامة إلى 5 أنابيب البولي بروبلين والحفاظ مل في الثلاجة. الحارة 1 قسامة في صباح التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باربيتورات. تخفيف محلول PBS مع إعطاء 2.6٪ الباربيتورات سولution. وضع مليلتر مأخوذة أنابيب البولي بروبلين 3-4 في. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيم ثلاث مناطق العمل (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المنطقة A: ترتيب العناصر التالية: نموذج الدراسة لتسجيل رقم تعريف الدراسة، تاريخ، ووزن الجسم، والأوزان من القلب الأيمن، والأيسر قلب الحاجز؛ مقياس الدقة (0-50 ز ز في الدقة 0.01) لتحديد وزن الجسم؛ النطاق الصغير لتحديد الأوزان في دقة القلب ز 0.001؛ تزن ​​الزوارق؛ التخدير حلول (بشكل واضح)؛ ديوار صغيرة مع النيتروجين السائل؛ الحاويات المعزولة مع الثلج؛ أنابيب وكذلك لوحة 24 لجمع عينات الدم والأنسجة (الجدول 1)؛ الأدوات الجراحية ( الجدول 2، الشكل 2)، وحلول لتنظيف الأدوات (الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> B المنطقة: ترتيب العناصر التالية: تشريح المجهر، والحق قسطرة القلب متصلة الضغط وحدة التحكم التي يتصل بها مكبر للصوت وجهاز كمبيوتر محمول. يتم وضع قسطرة فيدورق يحتوي على ماء. ترتيب الأدوات الجراحية (الجدول 2)، قطعة من قطع الخيط لمدة الأمثل، ووضع في وزن القارب؛ الشريط (الشريط الأوتوكلاف هو الأمثل) قطع لطول والعرض الأمثل واصطف على مقاعد البدلاء أو مختبر المجهر لسهولة الوصول إليها؛ مسحات القطن و مزيل الشعر الحل. معايرة قسطرة في بداية الدراسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منطقة C: ترتيب العناصر التالية: المكبر عدسة؛ قنية القصبة الهوائية؛ المحاقن 1 مل؛ قطع الخيط لمدة الأمثل، ووضع في قارب تزن؛ ديوار صغيرة مع النيتروجين السائل؛ الحاويات المعزولة مع الثلج؛ أنابيب و24 لوحة جيدا لجمع BAL وعينات الأنسجة (الجدول 1)؛ الأدوات الجراحية (الجدول 2)؛ الحلول لأداء وBAL لتنظيف القصبة الهوائية قنية والصكوك (الجدول 1). </li></ol></li></ol> 2. الحق قسطرة القلب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن الماوس باستخدام مقياس الدقة من خلال وضع الماوس بلطف إلى وزن بالشوفان. تأكد من التعامل مع الحيوان برفق وهدوء. تسجيل الوزن. البروتوكول يعمل على نحو أفضل وصف للفئران التي هي 20 غراما أو أكثر لأن قطر لديها حبل الوريد لاستيعاب الضغط القسطرة، بل من الممكن أن الفئران الأصغر يقثطر (17 ز أو أكثر) طالما أن الوريد كبيرة بما فيه الكفاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس عن طريق الحقن مع آفيرتين اعتمادا على وزن الجسم (10 ميكرولتر / ز)، على سبيل المثال لمدة 20 ز إعطاء 200 ميكرولتر، لمدة 25 ز 250 ميكرولتر تعطي، تعطي لمدة 30 ز 300 ميكرولتر. حجم الحقن الدقيق يحتاج إلى تعديل تبعا للسلالة الماوس. تأكد من التعامل مع الحيوان برفق وهدوء بسبب الإجهاد يمكن أن يغير الاستجابة للمخدر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد مخدرا الماوس، ومكان على ورقة الأنسجة المزدوج مطوي. لاحظ رقم ID على ورقة. فرك بلطف محلول إزالة الشعر في الجانب البطني من الرقبة واضح في مجال العمليات الجراحية. ضع الماوس مرة أخرى على الورق والانتظار لمدة 1-2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشعر من الناحية البطنيةمن الرقبة بواسطة التمسيد بلطف على الشعر عكس اتجاه نمو الشعر مع مسحات القطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد دقيق لعمق كاف من التخدير عن طريق التحقق من عدم وجود منعكس أخمص القدمين: الماوس لا تستجيب لمعسر أصابع القدم فيها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل بسرعة واسترخاء، ويجب أن تبقى من قسطرة القلب الحق لا يستغرق أكثر من 10 دقيقة، على النحو الأمثل 3-6 دقيقة. من المهم أن الأنسجة لا تجف لأن القسطرة يحتاج لزحلقة في الوريد والانتقال داخل الوريد على طبقة من الرطوبة. توقيت ثابت من إجراء مهم لتوليد بيانات قابلة للمقارنة بين المجموعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة مكان الماوس على المناديل الورقية والمناديل الورقية مع نقل على متن الستايروفوم. إصلاح الكفوف ورئيس في مكانها باستخدام شريط الأوتوكلاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق الجلد من mandibles إلى القص (العظم الثدي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الغدة الدرقية بعناية صعودا نحو mandibles الكبرى لفضح الوريد الوداجي الحق ورrachea. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الستايروفوم المجلس عقد الماوس تحت المجهر تشريح مع التركيز الطائرة بالفعل وعدسة التكبير في حوالي 0.8x (التكبير الإجمالية [عدسة العين قطعة X] هو 8X تقريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microdissect بعناية الوريد الوداجي الحق عن طريق إزالة الأنسجة الضامة المحيطة بها مع ملقط جراحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان قطعتين من الخيط على رأس الوريد الوداجي الأيمن. ربط الخيط الأقرب إلى mandibles لإغلاق تدفق الدم في الوريد الى حد كبير صغيرة، ضع خياطة الأقرب إلى القص / الثدي العظم في عقدة فضفاضة حول الوريد. يمكن للمرء أن استخدام قطرة صغيرة من الدم في وقت لاحق لايجاد ثقب في الوريد، يجب أن تصبح هذه الضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التنفس والاسترخاء (ترخي العضلات في الرقبة والفك) لتبقي عينيك على الوريد من خلال العدسة. وسوف يضمن هذا اليدين والأصابع سوف تتحرك بشكل آمن، على نحو سلس ومريح. في حين الضغط على الوريد مع ملقط في الجانب الأقرب إلىmandibles، وقطع ثقب في الوريد بين اثنين باستخدام الخيوط الجراحية الدقيقة التي تديرها مقص من جهة أخرى. اخماد مقص الصغرى، وحفظ اليد التي استرخاء، ويشعر لقسطرة. استرداد بلطف القسطرة عقده بين الإبهام والإصبع الأول (الشكل 3). إدراج قسطرة في حفرة من الوريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقدم بلطف قسطرة في القلب الأيمن (الشكل 3). مراقبة علامات على القسطرة التي تعطي مؤشر تقريبي عن مدى القسطرة يحتاج إلى تدرج ومراقبة جهاز العرض. مرة واحدة يتم عرض منحنيات الضغط، وتشديد برفق أقل خياطة حول القسطرة. لأن القسطرة لديه قوة الشد التي يعطيها لفائف، ولأن ضربات القلب والتنفس من الفأرة إضافة الحركة، بالإضافة إلى ذلك يضعوا القسطرة باستخدام الشريط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل قياسات الضغط لمدة 2 دقيقة لتحليلها لاحقا (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح خياطة عقد القسطرة، ثم استرجاع بلطف catheثالثا. مسح جزء وراء محول الضغط، ضع مرة أخرى إلى الدورق بالماء. لا تلمس محول الضغط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الماوس على الجزء العلوي من المناديل الورقية إلى منطقة A للقتل الرحيم، وجمع الدم من الأنسجة والطحال. تنظيف الأدوات الجراحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء هذا الإجراء مع الحيوان المقبل. عندما يسمح توقيت، حقن مخدر أثناء انتظار لتسجيل منحنى الضغط (2.15). </li></ol> 3. جمع عينات الدم والطحال <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن باربيتورات حل، 400 ميكرولتر في الماوس وانتظر لمدة 1-2 دقيقة. يتم تنفيذ هذا بشكل روتيني في مختبرنا لتجنب احتمال أن الفئران استرداد سهوا من AVERTIN-التخدير في حين يجري بليد. ويتحقق توحيد المناسبة من التجربة عن طريق حقن الجرعة نفسها من حل الباربيتورات في الماوس، والانتظار على نفس القدر من الوقت قبل الحصاد من الدم. إذا سمحت رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام وطالماكما يتم مراقبة بعناية الحيوانات لعمق التخدير قبل استنزاف، ويمكن حذف هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق في البطن. فتح الوريد الذيلية (الوريد الأجوف) وجمع الدم باستخدام ماصة نقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الطحال، أو قطعة من الطحال في أنبوب إيبندورف وتجميد المفاجئة في النيتروجين السائل، أو في لوحة بشكل جيد في 24 منطقة عازلة هانكس تحتوي أيضا في وقت لاحق لإعداد الخلايا واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الماوس على الجزء العلوي من المناديل الورقية إلى العمل في منطقة C لجمع BAL، العقدة الليمفاوية تجفيف الرئة، الرئة، وأنسجة القلب. تنظيف الأدوات الجراحية. </li></ol> 4. جمع عينات من الرئة والقلب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح القصبة الهوائية مجانا من العضلات والنسيج الضام. ملقط وضع تحت القصبة الهوائية، وسحب الخيط من خلال. توليد بلطف تمتد كافية لخفض حفرة. الحفاظ على امتداد طيف، إدراج قنية القصبة الهوائية باستخدام حركة تحول قليلا، وخياطة قنية في مكانها.لادراج قنية القصبة الهوائية، تأكد من أن القصبة الهوائية رطبة، إذا لزم الأمر إضافة قطرة من محلول هانكس. في جميع أنحاء الداخلي، التنفس، والاسترخاء عضلات العنق والفك، للحفاظ على حركات اليد آمنة وسلسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح فتح القفص الصدري عن طريق إزالة بعناية الثدي العظم بدءا من نهاية البطن. لا تخل محتويات الصدر لأن هذا سيجعل من الصعب جدا العثور على العقدة الليمفاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء القصبات غسيل (BAL) عن طريق إدراج بلطف 1 مل من العازلة هانكس، بدوره الحقنة بلطف واسترجاع السوائل BAL. كرر 3 مرات، وإغلاق أنبوب مكان على الجليد. في جميع أنحاء الداخلي، والحفاظ على العينين على نهاية قنية القصبة الهوائية الذي يتصل الحقنة. نظرة إلى الصدر لمراقبة التضخم والانكماش من الرئتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العقدة الليمفاوية الحصاد الرئة من خلال عقد ضلع جدار القفص مع مجموعة واحدة من ملقط، وإيجاد واسترجاع العقدة الليمفاوية مع ملقط آخر. مكان العقدة الليمفاوية إلى 24 لوحة جيدا. من المهم أن تعرف وهره للبحث: بدءا من الرقبة، والعثور على مدخل القفص الصدري من الجانب الأيمن من الفأرة وتبدو فوق العمود الفقري (الشكل 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قلب الحصاد ووضعت على المناديل الورقية. عزل قلب الحق إلى جانب تشريح بعناية الحاجز. نقل إلى منطقة العمل A لوزن، سجل وزن ومكان في أنابيب إيبندورف لالتقاط تجميد في النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الخيط حول الفص الرئة اليسرى لإغلاق القصبة الرئيسية. تشريح الرئة اليسرى الفص مجانا، مكان إلى أنبوب إيبندورف وتجميد المفاجئة في النيتروجين السائل، أو مكان في بئر من لوحة تحتوي على 24 أيضا هانكس حل لعزل في وقت لاحق من تعليق خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج تقريبا. مخزنة 0.5 مل محلول الفورمالديهايد من خلال قنية القصبة الهوائية في الرئة الفص المتبقية. بعد التضخم، تشريح الفص الرئة من الصدر ومكان في أنبوب 50 مل تحتوي على محلول الفورمالديهايد. لتصميم الدراسة بديلة، يمكن أن يكون مبالغا الرئتين مع cutt الأمثلجي وسائل الاعلام (OCT، 1:4 المخفف مع PBS) وجمدت في قالب يحتوي أكتوبر غير مخفف لإعداد وقت لاحق من أقسام المجمدة. قد تستلزم دراسة تصميم آخر الحصول على الأنسجة المفاجئة الرئة المجمدة والمعلقات خلية واحدة من الرئتين. في هذه الحالة، لا يلزم التضخم: تشريح الفص الرئة المتبقية؛ استردادها من الصدر والمكان إلى لوحة البئر 24 إلى مخزن مؤقت هانكس تحتوي أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قنية ونظيفة القصبة الهوائية وذلك بدهن مع العازلة هانكس، وتنظيف الأدوات الجراحية. </li></ol> 5. تحليل المنحنيات الضغط المتولد من قسطرة القلب الحق يتم تحليل مسجل ضغط البطين الأيمن البيانات باستخدام LabChart 7 البرنامج بدون معرفة هوية كل مجموعة من التسجيل. ويتم اختيار أكثر من 20 منحنيات بشكل عشوائي والفرق بين الحد الأقصى والحد الأدنى للضغط البطين كل منحنى قياس (ΔP). يتم حساب متوسط ​​ΔP لإعطاء الحق ventriculع الضغط الانقباضي.

<ol>
	<li>Price, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Inflammation in pulmonary arterial hypertension.</a> Chest. 141, 210-221 (2012).</li><li>Olschewski, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathophysiology+and+therapy+of+pulmonary+hypertension.">Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension.</a> J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).</li><li>Hassoun, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+growth+factors,+and+pulmonary+vascular+remodeling.">Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).</li><li>Rabinovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+pulmonary+arterial+hypertension.">Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension.</a> J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).</li><li>Steudel, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+pulmonary+hypertension+and+right+ventricular+hypertrophy+after+chronic+hypoxia+in+mice+with+congenital+deficiency+of+nitric+oxide+synthase+3.">Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3.</a> J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).</li><li>Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+serine+elastase+inhibitor+elafin+protects+transgenic+mice+from+hypoxic+pulmonary+hypertension.">Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension.</a> Circulation. 105, 516-521 (2002).</li><li>Guignabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie2-mediated+loss+of+peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+in+mice+causes+PDGF+receptor-beta-dependent+pulmonary+arterial+muscularization.">Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).</li><li>West, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+hypertension+in+transgenic+mice+expressing+a+dominant-negative+BMPRII+gene+in+smooth+muscle.">Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle.</a> Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).</li><li>Cook, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+eNO+and+pulmonary+iNOS+expression+in+eNOS+null+mice.">Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice.</a> Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).</li><li>West, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+expressing+BMPR2R899X+transgene+in+smooth+muscle+develop+pulmonary+vascular+lesions.">Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).</li><li>Tu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+fibroblast+growth+factor-2+signaling+contributes+to+altered+endothelial+phenotype+in+pulmonary+hypertension.">Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).</li><li>Daley, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+arterial+remodeling+induced+by+a+Th2+immune+response.">Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response.</a> J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).</li><li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+endothelial+injury,+and+persistent+pulmonary+hypertension+in+heterozygous+BMPR2-mutant+mice.">Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).</li><li>Thibault, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+assessment+of+murine+pulmonary+arterial+pressure:+validation+and+application+to+models+of+pulmonary+hypertension.">Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension.</a> Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).</li><li>Otto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+hypertension+and+right+heart+failure+in+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+type+I+receptor-deficient+mice.">Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice.</a> Circulation. 110, 3245-3251 (2004).</li><li>Burton, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+leukocyte+recruitment+via+CXCR1/2+inhibition+stops+the+progression+of+PAH+in+mice+with+genetic+ablation+of+endothelial+BMPR-II.">Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II.</a> Blood. 118, 4750-4758 (2011).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+hypertension+in+TNF-alpha-overexpressing+mice+is+associated+with+decreased+VEGF+gene+expression.">Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression.</a> J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).</li><li>Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+Short+Periods+of+Induced+Acute+Anoxia+Upon+Pulmonary+Artery+Pressures+in+Man.">The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man.</a> Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).</li><li>Liljestrand, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Pulmonary+Arterial+Blood+Pressure.">Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure.</a> Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).</li><li>Euler, U. S. V., Liljestrand, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+pulmonary+arterial+blood+pressure+in+the+cat.">Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat.</a> Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).</li><li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).</li><li>Rabinovitch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+prevents+hypoxic+pulmonary+hypertension+and+vascular+changes+in+rat.">Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat.</a> Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).</li><li>Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+pulmonary+circulation+after+chronic+hypoxia:+hemodynamic+and+structural+features.">Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features.</a> Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).</li><li>Rabinovitch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+pulmonary+blood+flow+affect+vascular+response+to+chronic+hypoxia+in+rats.">Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats.</a> Circ. Res. 52, 432-441 (1983).</li><li>Kugathasan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+angiopietin-1-Tie2+pathway+prevents+rather+than+promotes+pulmonary+arterial+hypertension+in+transgenic+mice.">The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice.</a> J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).</li><li>Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+tobacco+smoke+exposure+and+persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn.">Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn.</a> Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).</li><li>Graham, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis-induced+experimental+pulmonary+hypertension:+role+of+interleukin-13+signaling.">Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling.</a> Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).</li><li>Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+vascular+disease+in+the+developing+world.">Pulmonary vascular disease in the developing world.</a> Circulation. 118, 1758-1766 (2008).</li><li>Crosby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Praziquantel+reverses+pulmonary+hypertension+and+vascular+remodeling+in+murine+schistosomiasis.">Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تدفق التجريبية المذكورة هنا يسمح لقياس السريع والمتزامن لالبطين الأيمن الضغط الانقباضي وحصاد عينات للتحليل الردود في القلب والرئتين والجهاز المناعي لدى الفئران. الإجراء يجمع بين قياسات فسيولوجية القلب، والصغرى تشريح الأنسجة الحصاد اللاحقة للدراسات الخلية الحية،...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الكواشف </td></tr><tr><td> 2-الميثيل-2-بيوتانول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 152463 </td><td></td></tr><tr><td> 2،2،2-ثلاثي بروم إيثانول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> T48402 </td><td></td></tr><tr><td> صابون مطهر (TB تغطية الرذاذ بالإضافة إلى STERIS) </td><td> فيشر العلمية </td><td> 1629-1608 </td><td></td></tr><tr><td> الكحول الإيثيلي، 200 إثبات،، اللامائى المطلق ACS / USP الصف </td><td> PHARMCO-AAPER </td><td> 111000200 </td><td> تمييع إلى 70٪ مع الماء المقطر </td></tr><tr><td> الفورمالديهايد الحل </td><td> سيغما الدريخ </td><td> F1635-500ML </td><td> تمييع إلى 7-10٪ المبدئيةتركيز ldehyde بتركيز PBS 1X من استخدام الأسهم PBS الحل والمياه </td></tr><tr><td> هانكس الحل، لا الكالسيوم والمغنيسيوم </td><td> فيشر العلمية </td><td> 21-022-CV </td><td></td></tr><tr><td> أكتوبر </td><td> الأنسجة تيك </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين (10،000 U / مل) / الستربتوميسين (10،000 ملغ / مل) الحل </td><td> الحرارية العلمية </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، أي الكالسيوم، المغنيسيوم لا، والحلول 1X و 10x </td><td> فيشر العلمية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> بنتوباربيتال الصوديوم 26٪ </td><td> فورت دودج الصحة الحيوانية </td><td> NDC 0856-0471-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> المختبرات الطبية </td></tr><tr><td> لوحات 12، 24، 96 جيد </td><td> صقر </td><td></td><td></td></TR&gt; <tr><td> نقل الماصة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 13-711-9BM </td><td></td></tr><tr><td> أنبوب، EDTA المغلفة </td><td> Sarstedt </td><td> 2013-08 </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب 0،65 مل و 1.7 مل الطرد المركزي الصغيرة </td><td> VWR </td><td></td><td></td></tr><tr><td> أنابيب البولي بروبلين 12 × 75 مم </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14-956-1D </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب والأحجام المختلفة، والبولي بروبيلين </td><td> فيشر العلمية </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الصكوك </td></tr><tr><td> ملقط، Dumon رقم 5 الجميلة </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> ملقط، من خارج غرامة غريف-0.5mm نصائح منحني </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11152-10 </td><td></td></tr><tr><td> ملقط، فاي إضافيةشمال شرق غريف-0.5mm نصائح مباشرة </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> قنية 18ga، 19 GA </td><td> BD </td><td> الدقة إبر الإنزلاق </td><td> rasped قطع لطول الأمثل، وقلل من الخارج لإنشاء سطح خشن خارج </td></tr><tr><td> مقص، مقص مشرح ضئيلة شفرات 9cm تقرير اخبارى </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 14081-09 </td><td></td></tr><tr><td> خياطة لBAL، مضفر خياطة الحرير بنتيجة 4-0 </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> SP116 </td><td></td></tr><tr><td> خياطة لقسطرة القلب الحق، مضفر خياطة الحرير، 6-0 </td><td> Teleflex الطبية </td><td> 18020-60 </td><td></td></tr><tr><td> حقنة، 1 مل </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> معدات </td></tr><tr><td> مكبر للصوت، PowerLab 4/30 </TD&gt; <td> ADInstrument </td><td> نموذج ML866 </td><td></td></tr><tr><td> القسطرة والضغط F1.4 </td><td> ميلر الآلات، وشركة </td><td> 840-6719 </td><td></td></tr><tr><td> تشريح مجهر </td><td> Variscope </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ملقط، مقص الربيع Vannas-2mm وشفرات </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 15000-00 </td><td></td></tr><tr><td> الهالوجين مضيئة المكبر مكتب </td><td> فيشر العلمية </td><td> 11-990-56 </td><td></td></tr><tr><td> جهاز كمبيوتر محمول </td><td> ASUS </td><td> معالج نموذج A52F عدد I5؛ 15 بوصة </td><td></td></tr><tr><td> ضوء المصدر </td><td> Amscope </td><td> HL-250-A </td><td></td></tr><tr><td> السيطرة على ضغط الوحدة </td><td> ميلر الآلات، وشركة </td><td> PCU-2000 </td><td></td></tr><tr><td> البرمجيات، Labchart برو V.7 </td><td> وفي ADstruments </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice

وظيفة القلب الصحيح هو ضخ الدم عبر الرئتين، وبالتالي ربط الحق علم وظائف الأعضاء علم وظائف الأعضاء والقلب الوعائية الرئوية. هو التهاب معدل المشتركة للقلب وظائف الرئة، عن طريق وضع تسلل الخلوية، وإنتاج السيتوكينات وعوامل النمو، والشروع في عمليات إعادة عرض 1. بالمقارنة مع البطين الأيسر، البطين الأيمن هو مضخة ذات ضغط منخفض تعمل في منطقة ضيقة نسبيا من تغيرات الضغط. وترتبط زيادة الضغوط الشريان الرئوي مع زيادة الضغط في الأوعية الدموية في الرئة السرير وارتفاع ضغط الدم الرئوي 2. وكثيرا ما يرتبط ارتفاع ضغط الدم الرئوي مع أمراض الرئة التهابات، وعلى سبيل المثال مرض الانسداد الرئوي المزمن، أو أمراض المناعة الذاتية 3. لأن ارتفاع ضغط الدم الرئوي يمنح التكهن سيئة لنوعية الحياة ومتوسط ​​العمر المتوقع، يتم توجيه الكثير من البحث من أجل فهم الآليات التي من طراز ميغHT تكون أهدافا لمدة 4 تدخل الصيدلانية. التحدي الرئيسي لتطوير أدوات الإدارة الفعالة لارتفاع ضغط الدم الرئوي لا تزال تعقد في وقت واحد فهم التغيرات الجزيئية والخلوية في قلب الحق والرئتين والجهاز المناعي. هنا، نقدم سير العمل الإجرائية لقياس سرعة ودقة من اختلاف الضغط في قلب حق الفئران والحصاد في وقت واحد من عينات من الرئتين والقلب والأنسجة المناعية. وتستند هذه الطريقة على قسطرة المباشر من البطين الأيمن عبر الوريد الوداجي في الصدر بالقرب الفئران، للمرة الأولى في أواخر 1990s كإجراء بديل من الضغوط في الشريان الرئوي 5-13. ونظمت فريق نهج يسهل قسطرة القلب سريعة جدا الحق التقنية. هذا يجعل من الممكن إجراء القياسات في الفئران التي تتنفس هواء الغرفة تلقائيا. تنظيم تدفق العمل في مجالات العمل المتميزةيقلل الوقت وتأخير يفتح إمكانية لإجراء التجارب في وقت واحد وعلم وظائف الأعضاء حصاد الأنسجة المناعية والقلب والرئة. يمكن تكييفها سير العمل الإجرائية المذكورة هنا لطائفة واسعة من الإعدادات المختبرات والتصاميم الدراسة، من التجارب الصغيرة المستهدفة، والكبيرة المقايسات فحص المخدرات. اكتساب علم وظائف الأعضاء في وقت واحد من البيانات القلب التي يمكن توسيعها لتشمل تخطيط صدى القلب 5،14-17 وحصاد الأنسجة القلب والرئة والجهاز المناعي يقلل من عدد الحيوانات اللازمة للحصول على البيانات التي تحرك أساس المعرفة العلمية إلى الأمام. سير العمل الإجرائية المقدمة هنا كما يقدم قاعدة مثالية لاكتساب المعرفة من الشبكات التي تربط المناعة والرئة وظيفة القلب. يمكن تكييفها نفس المبادئ الموضحة هنا لدراسة الأجهزة الأخرى أو إضافية حسب الحاجة.

يتم تحقيق النتيجة الأولية للحصول على حق منحنيات ضغط القلب من قبل الموضع الصحيح للقسطرة القلب الصحيح. شكل منحنيات ضغط الوقت أمر بالغ الأهمية لأن الموضع الصحيح من داخل القسطرة من البطين الأيمن سوف يؤدي إلى الضغط الهضاب (الشكل 4). منحنيات شائك، بدلا من ذلك، تشير...

Watch this Scientific Journal Video about Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice at JoVE.com

قياسات الضغط الانقباضي في البطين الأيمن مع جمع عينات من أنسجة الرئة والمناعة في الفئران | علم المناعة والعدوى | فيديو

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

يوصف بروتوكول معين وسريعة للتحقيق في وقت واحد الحق وظيفة القلب، والتهاب الرئة، والاستجابة المناعية ليكون أداة تعليمية. فيديو والشخصيات تصف علم وظائف الأعضاء والتقنيات تسليخ مجهري في نهج فرق التي نظمت قابل للتكيف لاستخدامها في الدراسات الصغيرة وذات الحجم الكبير.

قياسات الضغط البطيني الحق الانقباضي في تركيبة مع حصاد الرئة وعينات الأنسجة المناعية في الفئران

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

right-ventricular-systolic-pressure-measurements-combination-with

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Human Biology

Circulatory and Pulmonary Systems

SCIENTISTS IN ACTION

25.0K Views.  New York University School of Medicine, Tuxedo. يوصف بروتوكول معين وسريعة للتحقيق في وقت واحد الحق وظيفة القلب، والتهاب الرئة، والاستجابة المناعية ليكون أداة تعليمية. فيديو والشخصيات تصف علم وظائف الأعضاء والتقنيات تسليخ مجهري في نهج فرق التي نظمت قابل للتكيف لاستخدامها في الدراسات الصغيرة وذات الحجم الكب?...

Video: Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

قياس الحمولة الجرثومية والاستجابات المناعية في الفئران المصابة المستوحدة الليستيريا</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic PolyI:C

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

تحريض الأم المناعي التنشيط في الفئران في مرحلة منتصف الحمل مع الفيروسية تقليد بولي (I: C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

تقييم للسآمة للخلايا وإيمونومودولاتوري آثار المواد في شرائح البشرية دقة قطع الرئة

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

تطبيق اضطرابات متناسقة تشبه التدليك على عجول الماوس ومراقبة التغيرات الناتجة عن الضغط العضلي العضلي

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

عدوى الإشريكية القولونية المتكررة في المسالك البولية الناجمة عن التعرض للمثانة المهبلية Gardnerella في الفئران

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical challenge. Among the ~600 proteases encoded by the human genome, neutrophil serine proteases (NSPs) are thoroughly investigated for their involvement in the onset and progression of inflammatory conditions including respiratory diseases. Uniquely, secreted NSPs not only diffuse within extracellular fluids but also localize to plasma membranes. During neutrophil extracellular trap (NETs) formation, NSPs become an integral part of the secreted chromatin. Such complex behavior renders the understanding of NSPs pathophysiology a challenging task. Here, detailed protocols are shown to visualize, quantify and discriminate free and membrane-bound neutrophil elastase (NE) and cathepsin G (CG) activities in sputum samples. NE and CG are NSPs whose activities have pleiotropic roles in the pathogenesis of cystic fibrosis (CF) and chronic obstructive pulmonary disease (COPD): they promote tissue remodeling, regulate downstream immune responses and correlate with lung disease severity. The protocols show how to separate fluid and cellular fraction, as well as the isolation of neutrophils from human sputum for enzymatic activity quantification via small-molecule F&#246;rster resonance energy transfer-based (FRET) reporters. To gather specific insights into the relative role of NE and CG activities, a FRET readout can be measured by different technologies: i) in vitro plate reader measurements allow for high-throughput and bulk detection of protease activity; ii) confocal microscopy spatiotemporally resolves membrane-bound activity at the cell surface; iii) small-molecule FRET flow cytometry enables for the rapid evaluation of anti-inflammatory treatments via single-cell protease activity quantification and phenotyping. The implementation of such methods opens the doors to explore NSPs pathobiology and their potential as biomarkers of disease severity for CF and COPD. Given their standardization potential, their robust readout and simplicity of transfer, the described techniques are immediately shareable for implementation across research and diagnostic laboratories.

The protocols herein described provide a guide to visualize and quantify the activity of neutrophil proteases in human sputum. The applications of such analysis span from the evaluation of anti-inflammatory treatments, to biomarker validation, drug screening and large cohort clinical studies.

رصد نيوتروفيلي إيلاستاز وكاثيبسين G النشاط في عينات البلغم البشري

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms include irregular fever, lymphadenopathy, and significantly increased lymphocytes in peripheral blood. The pathogenic mechanism of IM is still unclear; there is no effective treatment method for it, with mainly symptomatic therapies being available. The main question in EBV immunobiology is why only a small subset of infected individuals shows severe clinical symptoms and even develop EBV-associated malignancies, whilemost individuals are asymptomatic for life with the virus.
B cells are first involved in IM because EBV receptors are presented on their surface. Natural killer (NK) cells are cytotoxic innate lymphocytes that are important for killing EBV-infected cells. The proportion of CD4+ T cells decreases while that of CD8+ T cells expands dramatically during acute EBV infection, and the persistence of CD8+ T cells is important for lifelong control of IM. Those immune cells play important roles in IM, and their functions need to be identified separately. For this purpose, monocytes are separated first from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of IM individuals using CD14 microbeads, a column, and a magnetic separator.
The remaining PBMCs are stained with peridinin-chlorophyll-protein (PerCP)/Cyanine 5.5 anti-CD3, allophycocyanin (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluorescein isothiocyanate (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56, and APC anti-CD16 antibodies to sort CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and NK cells using a flow cytometer. Furthermore, transcriptome sequencing of five subpopulations was performed to explore their functions and pathogenic mechanisms in IM.

We describe a method combining immunomagnetic beads and fluorescence-activated cell sorting to isolate and analyze defined immune cell subpopulations of peripheral blood mononuclear cells (monocytes, CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and natural killer cells). Using this method, magnetic and fluorescently labeled cells can be purified and analyzed.

فصل المجموعات السكانية الفرعية للخلايا المناعية في عينات الدم المحيطية من الأطفال المصابين بكثرة الوحيدات المعدية

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Periodontitis (PD) is a highly prevalent, chronic immune-inflammatory disease of the periodontium, that results in a loss of gingival soft tissue, periodontal ligament, cementum, and alveolar bone. In this study, a simple method of PD induction in rats is described. We provide detailed instructions for placement of the ligature model around the first maxillary molars (M1) and a combination of injections of lipopolysaccharide (LPS), derived from Porphyromonas gingivalis at the mesio-palatal side of the M1. The induction of periodontitis was maintained for 14 days, promoting the accumulation of bacteria biofilm and inflammation. To validate the animal model, IL-1&#946;, a key inflammatory mediator, was determined by an immunoassay in the gingival crevicular fluid (GCF), and alveolar bone loss was calculated using cone beam computed tomography (CBCT). This technique was effective in promoting gingiva recession, alveolar bone loss, and an increase in IL-1&#946; levels in the GCF at the end of the experimental procedure after 14 days. This method was effective in inducing PD, thus being able to be used in studies on disease progression mechanisms and future possible treatments.

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

In this study, a rat model of induction of periodontitis is presented via a combination of retentive ligature and repetitive injections of lipopolysaccharide derived from Porphyromonas gingivalis, over 14 days around the first maxillary molars. The ligation and LPS injection techniques were effective in inducing peridontitis, resulting in alveolar bone loss and inflammation.