R01HL082694 (JW), 미국 심장 협회, 설립자 제휴 (0855943D, GG),이 작품은 건강 1R21HL092370-01의 국립 연구소 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG)에 의해 재정 지원되었다 스토니은 고원 - 허버트 기금, 뉴욕 (SHP).

1. 준비하기 <ol><li> 다음과 같이 다음과 같은 솔루션 및 튜브 (표 1) 준비 : <ol><li> 행크스 솔루션, 아니 칼슘, 마그네슘 또는 표시 페니실린과 (100 U / ML) / 스트렙토 마이신 (100 MG / ML). </li><li> 인산염은 염분 (PBS), 1X, 아니 칼슘, 마그네슘 노 버퍼. </li><li> 에탄올, 70 %, 500 ML을합니다. </li><li> 포름 알데히드 버퍼, PBS로 7~10%는 500 ML을합니다. </li><li> Anaesthesia 솔루션 : <ol><li> Avertin. 조심스럽게 2,2,2 - Tribromoethanol의 5g에 2 - 메틸 -2 - 부탄올 5 ML을 추가합니다. 일단 용해, 어둠 속에서 실온에서 재고 솔루션을 유지. 주식 솔루션의 0.25 ML를 타고 유리 하단 병에 1xPBS의 10 ML로 희석. 37 알루미늄 호일, 장소와 병을 감싸 ° C 해산 한 후 나누어지는 5 ML의 폴리 프로필렌 튜브에, 냉장고에 보관까지. 실험의 아침에 하나 나누어지는을 따뜻하게. </li><li> 바르비 투르 산염. 2.6 %에게 바르비 투르 산염 솔을주고 PBS로 주식 솔루션을 희석ution. 폴리 프로필렌 튜브에 3-4 ML의 aliquots를 놓습니다. </li></ol></li></ol></li><li> 세 업무 영역 (그림 1)을 구성 할 수 있습니다. </li><li><ol><li> 지역 A : 연구 양식 연구 식별 번호, 날짜, 체중, 오른쪽 심장의 무게, 왼쪽 가슴과 심장 녹화, 체중을 결정하기 위해 정밀 규모를 (0.01 g의 정밀도에 0-50그램), 마이크로 규모 : 다음 항목을 정렬 0.001 g 정밀도에서 심장 가중치를 결정하는 것은, (수술기구, 배를 체중, 마취 솔루션 (명확하게 표시), 액체 질소로 작은 dewar, 얼음과 분리 된 용기, 튜브와 24도 판은 혈액 및 조직 표본 (표 1) 수집 표 2, 그림 2) 및 장비 (표 1) 청소하는 솔루션입니다. </li><li> 지역 B : 해부 현미경, 증폭기 및 노트북 컴퓨터에 연결되어 압력 제어 장치에 연결된 마우스 오른쪽 심장 카테 테르 다음 항목을 준비합니다. 카테터가에 위치물을 포함하는 비커. 수술기구 (표 2), 최적의 길이 봉합 컷의 조각과는 배를 무게로 배치를 마련, 테이프 (압력솥 테이프 최적입니다) 최적의 길이와 너비로 잘라 쉽게 액세스 할 수 있도록 현미경 또는 실험실 벤치에 늘어선, 면봉과 머리 제거 솔루션입니다. 연구의 시작 부분에 카테터를 보정합니다. </li><li> 지역 C는 :; tracheal 캐뉼라, 1 ML의 주사기, 봉합 최적의 길이 잘라 내기, 무게 배에 배치, 액체 질소로 작은 dewar, 얼음과 분리 된 용기, 튜브와 24도 판 BAL 수집 확대경 렌즈 : 다음 항목을 정렬 및 조직 표본 (표 1) 수술기구 (표 2) 솔루션은 BAL 수행하고 tracheal 캐뉼라와 악기를 (표 1) 청소. </li></ol></li></ol> 2. 오른쪽 심장 Catheterization <ol><li> 부드럽게에 마우스를 배치하여 정밀 척도를 이용하여 마우스를 무게는 B를 무게귀리. 부드럽게 조용하게 동물을 처리 할 수​​ 있는지 확인하십시오. 체중을 기록합니다. 설명 프로토콜은 경정맥 정맥의 직경이 압력 카테터를 수용 할 수 있기 때문에 20g 이상 아르 마우스에 가장 적합한, 그것은 정맥이 충분히 클하는 한 작은 쥐 (17g 이상) ...에 카테 테르를 꽂다 할 수 있습니다. </li><li> , Avertin는 20g 200 μl을 줘 예를 들어, 체중 (10 μl / g)에 따라 함께 주입하여 마우스를 마취시키다 25 g 250 μl를 제공, 30에 g 300 μl을 제공합니다. 정확한 분사 볼륨은 마우스 변형에 따라 조정해야합니다. 스트레스가 마취에 대한 응답을 변경할 수 있기 때문에 부드럽게 조용하게 동물을 처리 할 수​​ 있는지 확인하십시오. </li><li> 이중 내기대로 티슈에 마우스가 진정되면, 장소. 종이에 ID 번호를 적어 둡니다. 부드럽게 외과 필드를 삭제하려면 목의 복부 측면에 머리 제거 로션을 문지르세요. 종이에 다시 마우스를 놓고 1-2 분 기다립니다. </li><li> 복부 측면에서 머리를 제거부드럽게 면봉으로 머리 성장의 방향에 대해 머리를 쓰다듬어하여 목의. </li><li> 조심스럽게 발가락 반사의 부재를 확인하여 마취의 충분한 깊이를 결정 : 마우스는 발가락의 곤란에 반응하지 않습니다. </li><li> 신속하고 편안한 작업, 오른쪽 심장 catheterization의 나머지 최적, 3-6 분 이상 10 분 빼앗지는 않을 것입니다. 그것은 카테터가 정맥으로 활강과 수분의 레이어에 정맥의 내부로 이동해야하기 때문 조직 아웃 건조하지 않는 것이 중요합니다. 절차의 일관성 타이밍 그룹 간의 비교 아르의 데이터를 생성하는 것이 중요합니다. </li><li> 조직 종이와 스티로폼 보드로 조직 종이 양도 플레이스 마우스 등. 압력솥 테이프를 사용하여 장소로 손과 머리를 수정합니다. </li><li> 개미의 흉골 (가슴 뼈 -)에 피부 절개를합니다. </li><li> 오른쪽 경정맥 정맥을 노출하는 개미를 향해 갑상선 그랜드 이상을 자세히 해부차 기관. </li><li> 장소 스티로폼 보드가 약 0.8x 배율 (총 배율 [렌즈 X 눈 부분]에서 장소와 렌즈에 이미 초점 비행기와 해부 현미경 아래에 마우스를 길게 누르면 약 8 배속입니다. </li><li> 조심스럽게 수술 포셉과 주변 결합 조직을 제거하여 오른쪽 경정맥 정맥을 microdissect. </li><li> 오른쪽 경정맥 정맥 상단에 장소 봉합의 두 조각을. 작은 세류에 정맥에 혈액의 흐름을 닫 개미에 가장 가까운 봉합을 묶어, 정맥 주위에 느슨한 매듭에서 가슴 / 가슴 - 뼈에 가장 가까운 봉합을 배치합니다. 하나는 나중에 정맥에 구멍을 찾아 혈액의 작은 세류을 사용할 수 있습니다,이 필요할 때해야합니다. </li><li> 숨을와 접안 렌즈를 통해 정맥에 눈을 유지하기 (목 턱의 근육을 풀어) 휴식을 취하실 수 있습니다. 이렇게하면 손과 손가락을 부드럽게하고 편안한, 안전하게 이동 될 수 있도록해야합니다. 가장 가까운 옆에 집게로 정맥를 누른 상태에서개미는, 다른 손으로 운영하는 마이크로 가위를 사용하여 두 개의 봉합 사이의 정맥에 구멍을 잘라 버릴거야. 마이크로 가위를 내려 놓고, 그 손 이완을 유지, 카테터에 대한 생각. 부드럽게 엄지와 첫 번째 손가락 (그림 3) 사이를 가지고있는 카테 테르를 검색합니다. 정맥의 구멍에 카테터를 삽입합니다. </li><li> 부드럽게 오른쪽 심장 (그림 3)에 카테터를 전진. 카테터를 삽입해야 얼마만큼의 대략적인 인덱스를 포기하고 모니터를 관찰 카테 테르에서 점수를 관찰. 압력 곡선이 표시되면, 부드럽게 카테터 주변의 낮은 봉합사를 조이십시오. 카테터는에게 코일을 제공 인장 강도가 있기 때문에, 그리고 마우스의 호흡과 심장 박동이 부착 또한, 테이프를 사용하여 카테터를 모션을 추가 때문입니다. </li><li> 나중에 분석을위한 2 분을 기록 압력 측정치 (그림 4). </li><li> 카테터를 가지고있는 봉합을 열고 부드럽게 retrie카테터이 있어요. 압력 변환기 뒤에있는 부분을 닦아, 물을 비커에 다시 넣습니다. 압력 변환기를 만지지 마십시오. </li><li> 안락사에 대한 지역을, 혈액, 비장 조직의 컬렉션에 휴지 위에 마우스를 전송합니다. 수술기구를 청소합니다. </li><li> 다음 동물과 절차를 시작합니다. 압력 곡선 (2.15)를 기록하는 대기하는 동안 시간이 허용되면 마취를 삽입. </li></ol> 3. 혈액과 비장 샘플 수집 <ol><li> 솔루션, 마우스 당 400 μl를 바르비 투르 산염로 1-2 분 기다려 주입. 이것은 일상적으로 없어져야하면서 쥐가 실수로 avertin - 마취에서 회복 가능성을 방지하기 위해 연구실에서 수행됩니다. 실험의 적절한 표준화는 마우스 당 바르비 투르 산염 솔루션의 동일한 복용량을 주입하고, 혈액의 수확하기 전에 시간의 동일한 금액을 기다리지에 의해 달성된다. 기관 동물 케어에 의해 허용 및위원회를 사용하여 경우오래 동물주의 깊게 전에 일어난 과다 출혈로 마취의 깊이에 대한 감시로,이 단계는 생략 할 수 있습니다. </li><li> 복부에 절개를합니다. 꼬리 정맥 (정맥)을 열고 전송 피펫을 사용하여 피를 수집합니다. </li><li> 비장을 제거하거나 Eppendorf 튜브 및 액체 질소에 스냅 동결에 비장의 한 부분, 또는 단일 셀의 나중에 준비 잘 포함 행크스 버퍼에 24 잘 판에. </li><li> BAL의 수집, 폐 배수 림프절, 폐, 및 심장 조직에 대한 업무 지역 C에 휴지 위에 마우스를 전송합니다. 수술기구를 청소합니다. </li></ol> 4. 폐와 심장 샘플 수집 <ol><li> 근육과 결합 조직의기도 무료로 해부. 기관에 따라 배치 포셉은을 통해 봉합을 당긴다. 부드럽게 구멍을 절단 할 수있는 충분한 신축성를 생성합니다. 부드러운 신축성을 유지하는 것은, 약간 회전 운동을 사용하여 tracheal 캐뉼라를 삽입하고, 봉합 캐뉼라 정수장소 O. 행크스 솔루션의 한 방울을 추가 필요한 경우 tracheal 캐뉼라의 삽입 들어, 기관은 습기 있는지 확인하십시오. 절차 전반에 걸쳐, 호흡 손 움직임이 안전하고 원활하게 유지하기, 목, 턱 근육을 휴식을 취하실 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 복부 끝에서 시작하는 모유 뼈를 제거하여 흉곽을 열고 해부. 이 매우 하드 림프 노드를 찾을 수 있도록 할 용의가 있기 때문에 가슴의 내용을 방해하지 마십시오. </li><li> 부드럽게 행크스 버퍼 1 ML를 삽입하여 bronchoalveolar 세척 (BAL)을 수행 부드럽게 주사기를 켜고 BAL 유체를 검색합니다. 3 번, 얼음에 가까운 튜브 및 장소를 반복합니다. 절차를 통해 주사기에 연결 tracheal 캐뉼라의 끝 부분에 눈을 유지. 폐의 인플레이션과 수축을 관찰하기 위해 가슴에 눈에. </li><li> , 포셉 한 세트로 갈비 벽을 들고 찾아 다른 포셉과 림프 노드를 검색하여 수확 폐 림프절. 24 잘 판에 장소 림프절. 그것은 K 중요합니다지금은 어디 검색 방법 : 목부터 시작하면, (그림 5) 마우스의 오른쪽에서 갈비의 입구를 찾아 척추 위에 봐. </li><li> 조직 종이에 수확 마음과 장소. 조심스럽게 심장과 함께 해부하여 바로 마음을 분리합니다. 이 무게 액체 질소에 동결을 부러 eppendorf 튜브에 무게와 장소를 기록 할 업무 영역에 전송할 수 있습니다. </li><li> 주요 기관지를 닫 왼쪽 폐 엽 주위에 봉합사를 놓습니다. eppendorf 튜브 및 단일 세포 현탁액의 이상 격리에 대한 행크스 솔루션을 포함하는 24 잘 접시의 잘에 액체 질소, 또는 장소에서 스냅 동결로 왼쪽 폐 엽 무료로 장소를 해부. </li><li> 약을 삽입합니다. 0.5 ML이 남아있는 폐의 엽 (叶)에 tracheal 캐뉼라를 통해 포름 알데히드 솔루션을 버퍼. 인플레이션 후, 포름 알데히드 용액을 포함하는 50 ML 튜브에 가슴과 장소의 폐 엽 (叶)을 해부. 대안 연구 설계를 들어, 폐 opti으로 증가 할 수 있습니다말 미디어 (OCT, PBS로 1시 4분을 희석)을 절단 및 냉동 섹션 나중에 준비를 위해 undiluted 10월를 포함하는 금형에 냉동. 또 다른 연구 디자인은 스냅 냉동 폐 조직과 폐의 단일 세포 현탁액을 얻는 필요로 할 수 있습니다. 이 경우 더 인플레이션 필요가 없습니다 : 남아있는 폐 엽 (叶)을 해부, 잘 포함 행크스 버퍼에 24 잘 판에 가슴과 장소에서를 검색합니다. </li><li> 행크스 버퍼와 린스로 깨끗이 tracheal 캐뉼라를 제거 수술기구를 청소. </li></ol> 5. 오른쪽 심장 카테 테르에서 생성 된 압력 곡선 분석 녹화 오른쪽 심실 압력 데이터는 각 녹음의 그룹 ID에 대한 지식과 LabChart 7 소프트웨어를 사용하여 분석하고 있습니다. 20 개 이상의 곡선은 무작위로 선택된 각 커브에 대한 최대 및 최소 심실 압력의 차이는 (ΔP) 측정합니다. 평균 ΔP는 오른쪽 v를 보여주고 계산됩니다entricular 수축기 압력.

<ol>
	<li>Price, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Inflammation in pulmonary arterial hypertension.</a> Chest. 141, 210-221 (2012).</li><li>Olschewski, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathophysiology+and+therapy+of+pulmonary+hypertension.">Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension.</a> J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).</li><li>Hassoun, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+growth+factors,+and+pulmonary+vascular+remodeling.">Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).</li><li>Rabinovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+pulmonary+arterial+hypertension.">Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension.</a> J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).</li><li>Steudel, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+pulmonary+hypertension+and+right+ventricular+hypertrophy+after+chronic+hypoxia+in+mice+with+congenital+deficiency+of+nitric+oxide+synthase+3.">Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3.</a> J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).</li><li>Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+serine+elastase+inhibitor+elafin+protects+transgenic+mice+from+hypoxic+pulmonary+hypertension.">Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension.</a> Circulation. 105, 516-521 (2002).</li><li>Guignabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie2-mediated+loss+of+peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+in+mice+causes+PDGF+receptor-beta-dependent+pulmonary+arterial+muscularization.">Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).</li><li>West, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+hypertension+in+transgenic+mice+expressing+a+dominant-negative+BMPRII+gene+in+smooth+muscle.">Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle.</a> Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).</li><li>Cook, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+eNO+and+pulmonary+iNOS+expression+in+eNOS+null+mice.">Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice.</a> Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).</li><li>West, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+expressing+BMPR2R899X+transgene+in+smooth+muscle+develop+pulmonary+vascular+lesions.">Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).</li><li>Tu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+fibroblast+growth+factor-2+signaling+contributes+to+altered+endothelial+phenotype+in+pulmonary+hypertension.">Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).</li><li>Daley, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+arterial+remodeling+induced+by+a+Th2+immune+response.">Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response.</a> J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).</li><li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+endothelial+injury,+and+persistent+pulmonary+hypertension+in+heterozygous+BMPR2-mutant+mice.">Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).</li><li>Thibault, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+assessment+of+murine+pulmonary+arterial+pressure:+validation+and+application+to+models+of+pulmonary+hypertension.">Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension.</a> Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).</li><li>Otto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+hypertension+and+right+heart+failure+in+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+type+I+receptor-deficient+mice.">Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice.</a> Circulation. 110, 3245-3251 (2004).</li><li>Burton, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+leukocyte+recruitment+via+CXCR1/2+inhibition+stops+the+progression+of+PAH+in+mice+with+genetic+ablation+of+endothelial+BMPR-II.">Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II.</a> Blood. 118, 4750-4758 (2011).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+hypertension+in+TNF-alpha-overexpressing+mice+is+associated+with+decreased+VEGF+gene+expression.">Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression.</a> J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).</li><li>Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+Short+Periods+of+Induced+Acute+Anoxia+Upon+Pulmonary+Artery+Pressures+in+Man.">The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man.</a> Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).</li><li>Liljestrand, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Pulmonary+Arterial+Blood+Pressure.">Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure.</a> Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).</li><li>Euler, U. S. V., Liljestrand, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+pulmonary+arterial+blood+pressure+in+the+cat.">Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat.</a> Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).</li><li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).</li><li>Rabinovitch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+prevents+hypoxic+pulmonary+hypertension+and+vascular+changes+in+rat.">Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat.</a> Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).</li><li>Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+pulmonary+circulation+after+chronic+hypoxia:+hemodynamic+and+structural+features.">Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features.</a> Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).</li><li>Rabinovitch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+pulmonary+blood+flow+affect+vascular+response+to+chronic+hypoxia+in+rats.">Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats.</a> Circ. Res. 52, 432-441 (1983).</li><li>Kugathasan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+angiopietin-1-Tie2+pathway+prevents+rather+than+promotes+pulmonary+arterial+hypertension+in+transgenic+mice.">The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice.</a> J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).</li><li>Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+tobacco+smoke+exposure+and+persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn.">Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn.</a> Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).</li><li>Graham, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis-induced+experimental+pulmonary+hypertension:+role+of+interleukin-13+signaling.">Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling.</a> Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).</li><li>Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+vascular+disease+in+the+developing+world.">Pulmonary vascular disease in the developing world.</a> Circulation. 118, 1758-1766 (2008).</li><li>Crosby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Praziquantel+reverses+pulmonary+hypertension+and+vascular+remodeling+in+murine+schistosomiasis.">Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 설명 된 실험 흐름은 폐, 심장과 쥐의 면역 시스템에서 응답의 분석에 적합한 심실 수축기 압력과 샘플 수확의 신속하고 동시 측정 할 수 있습니다. 절차는 심장 생리학 측정, 마이크로 해부 및 라이브 세포 연구, 조직 학적 분석, 또는 조직의 omics 분석을위한 후속 조직의 수확이 조화를 이루고 있습니다. 전체 절차는 마우스 당 미만 20 분 정도 소요됩니다. 때문에 업무 영역이 주관하는 워?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> 2 - 메틸 -2 - 부탄올 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 152463 </td><td></td></tr><tr><td> 2,2,2 - Tribromoethanol </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T48402 </td><td></td></tr><tr><td> 살균제 비누 (적용 범위 스프레이 TB 플러스 Steris) </td><td> 피셔 과학 </td><td> 1629-08 </td><td></td></tr><tr><td> 에틸 알콜, 200 증명서, 절대, 무수 ACS / USP 등급 </td><td> PHARMCO - AAPER </td><td> 111000200 </td><td> 증류수와 70 %를 희석 </td></tr><tr><td> 포름 알데히드 용액 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> F1635-500ML </td><td> 7~10% 견적에 희석PBS 재고 솔루션과 물을 사용하여 1X의 PBS 농도에서 ldehyde 농도 </td></tr><tr><td> 행크스 솔루션, 아니 칼슘, 마그네슘 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 21-022 - CV </td><td></td></tr><tr><td> 10월 </td><td> 조직 - 테크 </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 (10,000 U / ML) / 스트렙토 마이신 (10,000 MG / ML) 솔루션 </td><td> 열 과학 </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 염분 (PBS), 아니 칼슘, 아니 마그네슘, 1X 및 10X 솔루션을 버퍼 </td><td> 피셔 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 pentobarbital 26% </td><td> 요새 닷지 동물 건강 </td><td> NDC 0856-0471-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Labware </td></tr><tr><td> 접시 12, 24, 잘 96 </td><td> 매 </td><td></td><td></td></TR&gt; <tr><td> 전송 Pipet </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-711 - 9BM </td><td></td></tr><tr><td> 튜브, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 코팅 </td><td> Sarstedt </td><td> 2013-08 </td><td></td></tr><tr><td> 튜브 0.65 ML 및 1.7 ML 마이크로 원심 분리기 </td><td> VWR </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 튜브 12 X 75mm의 폴리 프로필렌 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14-956 - 1D </td><td></td></tr><tr><td> 튜브, 다양한 크기, 폴리 프로필렌 </td><td> 피셔 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 악기 </td></tr><tr><td> 집게, Dumon # 5 좋은 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> 집게, 여분의 고급 graefe-0.5mm 팁 곡선 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11152-10 </td><td></td></tr><tr><td> 집게, 추가 Fi 접속 설비를NE graefe-0.5mm 팁 직선 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> 캐뉼라 18ga, 19 GA </td><td> BD </td><td> 정밀 글라이드 바늘 </td><td> 외부 최적의 길이, 지내냐하고 잘라 내기 힘든 외부 표면을 만들 rasped </td></tr><tr><td> 가위, 해부학자 가위 - 슬림 블레이드 9cm </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 14081-09 </td><td></td></tr><tr><td> BAL, 편조 실크 봉합을위한 봉합 4-0 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> SP116 </td><td></td></tr><tr><td> 오른쪽 심장 catheterization, 편조의 실크 봉합, 6-0에 대한 봉합 </td><td> Teleflex 의료 </td><td> 18020-60 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기, 1 ML </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 증폭기, PowerLab 30분의 4 </TD&gt; <td> ADInstrument </td><td> 모델 ML866 </td><td></td></tr><tr><td> 카테 테르, 압력 F1.4 </td><td> 밀라 악기, Inc의 </td><td> 840-6719 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경을 해부 </td><td> Variscope </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 집게, Vannas 봄 가위-2mm 블레이드 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 15000-00 </td><td></td></tr><tr><td> 할로겐은 데스크 돋보기를 조명 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 11-990-56 </td><td></td></tr><tr><td> 노트북 컴퓨터 </td><td> 아수스 </td><td> 모델 번호 A52F I5 프로세서, 15 인치 </td><td></td></tr><tr><td> 광원 </td><td> Amscope </td><td> HL-250-A </td><td></td></tr><tr><td> 압력 제어 단위 </td><td> 밀라 악기, Inc의 </td><td> PCU-2000 </td><td></td></tr><tr><td> 소프트웨어, Labchart - 프로 V.7 </td><td> AD에서struments </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice

오른쪽 심장의 기능은 따라서 오른쪽 심장 생리학과 폐동맥 혈관 생리학을 연결 폐를 통해 혈액을 펌프하는 것입니다. 염증 세포 침투, 크린 시토 킨과 성장 요인의 생산을 elaborating 의해 리모델링 프로세스에게 1 시작하여, 마음과 폐 기능의 일반적인 변형입니다. 왼쪽 심실에 비해 우심실 압력의 변화는 비교적 좁은 영역에서 작동하는 저압 펌프입니다. 증가 폐동맥 압력은 폐 혈관 침대 및 폐 고혈압 2 증가 압력과 연결되어 있습니다. 폐 고혈압은 종종 염증성 폐 질환, 예를 들어 만성 방해하는 폐 질환, 또는 면역 질환 3 연결됩니다. 폐 고혈압은 생명과 수명의 품질에 대한 나쁜 예후 (豫 后)를 수여하기 때문에, 많은 연구는 그 미그 메커니즘을 이해하는쪽으로 지향된다HT는 의약품 개입 4 타겟이 될. 폐 고혈압에 대한 효과적인 관리 도구의 개발을위한 주요 과제는 분자 및 세포 오른쪽 가슴의 변화, 폐, 면역 시스템의 동시 이해의 복잡성 남아 있습니다. 여기, 우리는 마우스의 오른쪽 중심에 압력 변화의 신속하고 정확한 측정을위한 절차 흐름과 심장, 폐, 면역 조직에서 샘플의 동시 수확을 제시한다. 방법 먼저 폐동맥 5-13의 압력 대리 조치로 1990 년대 후반에 개발 된 근접 chested 마우스의 경정맥 정맥,를 통해 우심실 직접 catheterization를 기준으로합니다. 조직 팀 접근 방식은 매우 빠른 오른쪽 심장 catheterization 기술을 용이하게한다. 이렇게하면 저절로 방 공기를 호흡​​ 마우스에서 측정을 수행 할 수 있습니다. 서로 다른 업무 영역에서 작업 흐름의 조직시간 지연을 줄이고 동시에 생리학 실험 및 수확 면역, 심장과 폐 조직을 수행 할 수있는 가능성을 엽니 다. 여기에 설명 된 절차 흐름이 큰 약물 검사 assays에, 작은 타겟이 실험에서 실험 설정 및 연구 디자인의 다양한 적용 할 수 있습니다. echocardiography 5,14-17과 심장, 폐와 면역 조직의 수확을 포함하도록 확장 할 수 있습니다 심장 생리학 데이터의 동시 인수 앞으로 과학 지식 기반을 이동 데이터를 얻기 위해 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다. 여기에 제시된 절차 흐름은 또한 면역, 폐 및 심장 기능을 연결하는 네트워크에 대한 지식을 얻기위한 이상적인 기반을 제공합니다. 여기에 설명 된 동일한 원칙은 필요에 따라 다른 또는 추가적인 장기를 공부하도록 구성 할 수 있습니다.

오른쪽 심장 압력 곡선을 얻기위한 기본 결과는 오른쪽 심장 카테 테르의 정확한 위치에 의해 달성된다. 오른쪽 심실의 카테 테르 내부의 정확한 위치는 (그림 4) 압력 고원의 결과 때문에 압력 시간 곡선의 모양이 중요합니다. 뾰족한 곡선은 대신, 오른쪽 심실의 벽 호흡이나 심장 박동 운동에 의해 이동 카테터를 나타냅니다. 동물의 생존의 무대 잠재적 인 문제를 감지하려면 ΔP의 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice at JoVE.com

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

동시에 오른쪽 심장 기능, 폐 염증 및 면역 반응을 조사하기 위해 구체적이고 빠른 프로토콜은 학습 도구로 설명되어 있습니다. 비디오 및 그림은 큰 규모의 연구에 작은에 사용할 수에 적용 할 수 있습니다 조직 팀 접근 방식에서 생리학 및 microdissection 기술을 설명합니다.

폐 마우스의 면역 조직 샘플의 수확과 함께 오른쪽 심실 수축기 압력 측정

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

right-ventricular-systolic-pressure-measurements-combination-with

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Human Biology

Circulatory and Pulmonary Systems

SCIENTISTS IN ACTION

25.0K 조회수.  New York University School of Medicine, Tuxedo. 동시에 오른쪽 심장 기능, 폐 염증 및 면역 반응을 조사하기 위해 구체적이고 빠른 프로토콜은 학습 도구로 설명되어 있습니다. 비디오 및 그림은 큰 규모의 연구에 작은에 사용할 수에 적용 할 수 있습니다 조직 팀 접근 방식에서 생리학 및 microdissection 기술을 설명합니다.

비디오: Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

연구

면역학 및 감염병학

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic PolyI:C

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

(: C I) 바이러스 성 모방 폴리와 중간 임신 단계에서 마우스의 모성 면역 활성화 유도

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

세포 독성의 평가 인간의 정밀 컷 폐 분할 영역에서 물질의 Immunomodulatory 효과

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

마우스 종아리에 일관된 마사지와 같은 섭동을 적용하고 근육 내 압력 변화를 모니터링

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

재발 성 에스케리치아 콜라 이 요로 감염 Gardnerella 질 방광 노출에 의해 유발 마우스에서

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical challenge. Among the ~600 proteases encoded by the human genome, neutrophil serine proteases (NSPs) are thoroughly investigated for their involvement in the onset and progression of inflammatory conditions including respiratory diseases. Uniquely, secreted NSPs not only diffuse within extracellular fluids but also localize to plasma membranes. During neutrophil extracellular trap (NETs) formation, NSPs become an integral part of the secreted chromatin. Such complex behavior renders the understanding of NSPs pathophysiology a challenging task. Here, detailed protocols are shown to visualize, quantify and discriminate free and membrane-bound neutrophil elastase (NE) and cathepsin G (CG) activities in sputum samples. NE and CG are NSPs whose activities have pleiotropic roles in the pathogenesis of cystic fibrosis (CF) and chronic obstructive pulmonary disease (COPD): they promote tissue remodeling, regulate downstream immune responses and correlate with lung disease severity. The protocols show how to separate fluid and cellular fraction, as well as the isolation of neutrophils from human sputum for enzymatic activity quantification via small-molecule F&#246;rster resonance energy transfer-based (FRET) reporters. To gather specific insights into the relative role of NE and CG activities, a FRET readout can be measured by different technologies: i) in vitro plate reader measurements allow for high-throughput and bulk detection of protease activity; ii) confocal microscopy spatiotemporally resolves membrane-bound activity at the cell surface; iii) small-molecule FRET flow cytometry enables for the rapid evaluation of anti-inflammatory treatments via single-cell protease activity quantification and phenotyping. The implementation of such methods opens the doors to explore NSPs pathobiology and their potential as biomarkers of disease severity for CF and COPD. Given their standardization potential, their robust readout and simplicity of transfer, the described techniques are immediately shareable for implementation across research and diagnostic laboratories.

The protocols herein described provide a guide to visualize and quantify the activity of neutrophil proteases in human sputum. The applications of such analysis span from the evaluation of anti-inflammatory treatments, to biomarker validation, drug screening and large cohort clinical studies.

인간 가래 샘플에서 호중구 엘라스테아제 및 카테프신 G 활동 모니터링

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms include irregular fever, lymphadenopathy, and significantly increased lymphocytes in peripheral blood. The pathogenic mechanism of IM is still unclear; there is no effective treatment method for it, with mainly symptomatic therapies being available. The main question in EBV immunobiology is why only a small subset of infected individuals shows severe clinical symptoms and even develop EBV-associated malignancies, whilemost individuals are asymptomatic for life with the virus.
B cells are first involved in IM because EBV receptors are presented on their surface. Natural killer (NK) cells are cytotoxic innate lymphocytes that are important for killing EBV-infected cells. The proportion of CD4+ T cells decreases while that of CD8+ T cells expands dramatically during acute EBV infection, and the persistence of CD8+ T cells is important for lifelong control of IM. Those immune cells play important roles in IM, and their functions need to be identified separately. For this purpose, monocytes are separated first from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of IM individuals using CD14 microbeads, a column, and a magnetic separator.
The remaining PBMCs are stained with peridinin-chlorophyll-protein (PerCP)/Cyanine 5.5 anti-CD3, allophycocyanin (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluorescein isothiocyanate (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56, and APC anti-CD16 antibodies to sort CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and NK cells using a flow cytometer. Furthermore, transcriptome sequencing of five subpopulations was performed to explore their functions and pathogenic mechanisms in IM.

We describe a method combining immunomagnetic beads and fluorescence-activated cell sorting to isolate and analyze defined immune cell subpopulations of peripheral blood mononuclear cells (monocytes, CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and natural killer cells). Using this method, magnetic and fluorescently labeled cells can be purified and analyzed.

감염성 단핵구증이 있는 어린이의 말초 혈액 샘플에서 면역 세포 하위 집단 분리

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Periodontitis (PD) is a highly prevalent, chronic immune-inflammatory disease of the periodontium, that results in a loss of gingival soft tissue, periodontal ligament, cementum, and alveolar bone. In this study, a simple method of PD induction in rats is described. We provide detailed instructions for placement of the ligature model around the first maxillary molars (M1) and a combination of injections of lipopolysaccharide (LPS), derived from Porphyromonas gingivalis at the mesio-palatal side of the M1. The induction of periodontitis was maintained for 14 days, promoting the accumulation of bacteria biofilm and inflammation. To validate the animal model, IL-1&#946;, a key inflammatory mediator, was determined by an immunoassay in the gingival crevicular fluid (GCF), and alveolar bone loss was calculated using cone beam computed tomography (CBCT). This technique was effective in promoting gingiva recession, alveolar bone loss, and an increase in IL-1&#946; levels in the GCF at the end of the experimental procedure after 14 days. This method was effective in inducing PD, thus being able to be used in studies on disease progression mechanisms and future possible treatments.

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

In this study, a rat model of induction of periodontitis is presented via a combination of retentive ligature and repetitive injections of lipopolysaccharide derived from Porphyromonas gingivalis, over 14 days around the first maxillary molars. The ligation and LPS injection techniques were effective in inducing peridontitis, resulting in alveolar bone loss and inflammation.