Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (JW); American Heart Association, Fundadores da filial (0855943D, GG); Stony Wold - Herbert Fundo, Nova York (SHP).

1. Preparação <ol><li> Preparar as seguintes soluções e tubos (Tabela 1) como se segue: <ol><li> Hanks, solução sem cálcio e magnésio, ou com o indicador de penicilina (100 U / ml) / estreptomicina (100 mg / ml). </li><li> Salina tamponada com fosfato (PBS), 1x, sem cálcio, nenhum magnésio. </li><li> Etanol, 70%, perfazer 500 ml. </li><li> Formol tamponado, 7-10% com PBS, perfazer 500 ml. </li><li> Anestesia soluções: <ol><li> Avertin. Adiciona-se cuidadosamente 5 ml de 2-metil-2-butanol a 5 g de 2,2,2-tribromoetanol. Uma vez dissolvido, mantenha solução estoque, à temperatura ambiente, no escuro. Tomar 0,25 ml da solução-mãe e diluir com 10 ml de 1xPBS em frasco com fundo de vidro. Enrole a garrafa com folha de alumínio, lugar a 37 ° C até se dissolver e depois aliquota em 5 ml de tubos de polipropileno e manter no refrigerador. Aquecer uma alíquota, na manhã da experiência. </li><li> Barbitúricos. Diluir solução-mãe com PBS para dar origem a 2,6% barbitúrico solution. Colocar alíquotas de 3-4 ml em tubos de polipropileno. </li></ol></li></ol></li><li> Organizar três trabalhos-áreas (Figura 1). </li><li><ol><li> Área A: Organizar os seguintes itens: a forma de estudo para registrar o número de estudo de identificação, data, peso corporal, peso de coração direito, coração esquerdo e septo, balança de precisão (0-50 g de precisão de 0,01 g) para determinar o peso corporal; escala micro para determinar peso do coração em 0,001 g de precisão; pesar barcos; anestesia soluções (claramente marcado); dewar pequena com nitrogênio líquido; recipiente isolado com gelo, tubos e 24-bem placa para coletar sangue e amostras de tecidos (Tabela 1), instrumentos cirúrgicos ( A Tabela 2, Figura 2), e as soluções para limpar os instrumentos (Tabela 1). </li><li> Área B: Preparar os seguintes itens: microscópio de dissecação, cateter ventricular direita ligada a uma unidade de controlo de pressão que está conectado a um amplificador e um computador portátil. O cateter é colocadoum copo contendo água. Organizar instrumentos cirúrgicos (Tabela 2), pedaços de corte de sutura para tamanho ideal e colocado em um barco pesar; fita (fita de autoclave é ótima) cortados em comprimento e largura ideal e alinhados no banco ou microscópio de laboratório para o acesso fácil, cotonetes e solução de removedor de pêlos. Calibra-se o cateter no início do estudo. </li><li> Área C: Organizar os seguintes itens: lupa; cânula traqueal; seringas de 1 ml; corte de sutura para tamanho ideal e colocado em um barco pesar; dewar pequena com nitrogênio líquido; recipiente isolado com gelo, tubos e 24-bem placa de recolher BAL e amostras de tecido (Tabela 1), instrumentos cirúrgicos (Tabela 2), soluções para realizar BAL e para limpar a cânula traqueal e os instrumentos (Tabela 1). </li></ol></li></ol> 2. Cateterismo Cardíaco Direito <ol><li> Pesar mouse usando uma balança de precisão delicadamente colocando o mouse em um pesar baveia. Certifique-se de lidar com o animal suavemente e silenciosamente. Grave peso. O protocolo descrito funciona melhor para ratinhos que são de 20 g ou mais, porque o diâmetro da veia jugular tem de acomodar o cateter de pressão, é possível a cateterização ratos pequenos (17 g ou mais), enquanto a veia é suficientemente grande. </li><li> Anestesiar o rato por injecção com Avertin, dependendo do peso corporal (10 ul / g), por exemplo, para dar 20 g 200 ul, para dar 25 g 250 ul, para dar 30 g 300 ml. O volume de injecção exacta tem de ser ajustado, dependendo da estirpe do rato. Certifique-se de lidar com o animal suavemente e silenciosamente porque o estresse pode alterar a resposta ao anestésico. </li><li> Uma vez que o mouse é sedado lugar, em duplo papel de seda plissada. Note o número de identificação do artigo. Suavemente esfregue loção depilação no aspecto ventral do pescoço para limpar o campo cirúrgico. Posicione o mouse de volta para o papel e esperar por 1-2 min. </li><li> Remover os pêlos da face ventralno pescoço, acariciando o cabelo contra o sentido do crescimento do cabelo com cotonetes. </li><li> Cuidadosamente determinar a profundidade suficiente de anestesia, verificando a ausência do reflexo de pés: o mouse não reagir a beliscar de seus dedos. </li><li> Trabalhando rapidamente e descontraído, o restante do cateterismo cardíaco direito não deve levar mais de 10 minutos, de forma otimizada 3-6 min. É importante que o tecido não seca, porque o catéter tem de deslizar para dentro da veia e mover-se para dentro da veia em uma camada de humidade. Tempo consistente do processo é importante para a geração de dados que são comparáveis ​​entre os dois grupos. </li><li> Voltar lugar do mouse em papel de seda e de transferência com papel de seda em isopor bordo. Corrigir as patas ea cabeça no lugar usando fita autoclave. </li><li> Faça uma incisão de pele de mandíbulas para esterno (osso do peito). </li><li> Dissecar cuidadosamente para cima da tireóide grandes para as mandíbulas para expor a veia jugular direita umª traquéia. </li><li> Lugar de isopor placa segurando o mouse sob o microscópio de dissecção com o plano de foco já está em vigor e as lentes em aproximadamente 0,8 x ampliação (ampliação total [lente ocular x] é de cerca de 8x. </li><li> Microdissect cuidadosamente da veia jugular direita, removendo circundante tecido conjuntivo com pinça cirúrgica. </li><li> Colocar duas partes de fio de sutura na parte superior da veia jugular direita. Atar o fio de sutura mais próximo das mandíbulas para fechar o fluxo de sangue na veia de um fio pequeno, colocar o fio de sutura que está mais próxima do esterno / esterno em um nó frouxo em torno da veia. Pode-se usar as gotas pequenas de sangue para posterior encontrar o furo na veia, caso seja necessário. </li><li> Respire e relaxe (soltar os músculos do pescoço e da mandíbula) para manter seus olhos na veia através da ocular. Isso irá garantir que suas mãos e dedos vai passar de forma segura, suave e relaxante. Enquanto mantém a veia com uma pinça no lado mais próximoas mandíbulas, um furo na veia entre as duas suturas usando micro-tesoura operados por outro lado. Coloque as tesouras micro-, e manter essa relaxada mão, sentir o cateter. Suavemente recuperar o cateter segurando-o entre o polegar eo dedo indicador (Figura 3). Introduzir o cateter no orifício da veia. </li><li> Suavemente avançar o cateter no interior do coração direito (Figura 3). Observar as marcas no cateter que dão um índice aproximado de quão longe o catéter tem de ser inserida e observar o monitor. Uma vez que as curvas de pressão são apresentados, apertar ligeiramente inferior a sutura em torno do cateter. Uma vez que o cateter tem uma resistência à tracção que lhe confere uma bobina, e porque a batida do coração e de respiração do rato adicionar movimento, adicionalmente fixar o cateter com fita. </li><li> Grave medições de pressão, durante 2 minutos para análise posterior (Figura 4). </li><li> Abrir o suporte da sutura do cateter e então suavemente retrieve cateter. Limpar a parte de trás do transdutor de pressão, local de volta para o recipiente com água. Não toque no transdutor de pressão. </li><li> Transferir o rato em cima do papel de tecido para a área A para a eutanásia, a recolha de sangue e tecido do baço. Limpar instrumentos cirúrgicos. </li><li> Iniciar o procedimento com o próximo animal. Quando o tempo permite, injetar o anestésico enquanto espera para gravar a curva de pressão (2,15). </li></ol> 3. Coleta de amostras de sangue e Baço <ol><li> Injectar solução barbitúricos, 400 ul por rato e espere por 1-2 min. Isto é realizado rotineiramente no nosso laboratório a fim de evitar a possibilidade de que, inadvertidamente, os ratos recuperar da anestesia, enquanto avertina-de sangrado. Normalização adequada do experimento é conseguido através da injecção da mesma dose de solução de barbiturato por rato, e pela espera a mesma quantidade de tempo antes da colheita de sangue. Se for permitido pelo Animal Care Institucional e Comitê Use econtanto que os animais são cuidadosamente monitorizados quanto a profundidade da anestesia antes da sangria, esta etapa pode ser omitida. </li><li> Faça uma incisão no abdômen. Abrir a veia caudal (veia cava), e colheita de sangue utilizando uma pipeta de transferência. </li><li> Remover o baço, ou uma parte do baço para dentro do tubo de Eppendorf e congelamento em azoto líquido, pressão, ou para a placa de 24 poços para um tampão de Hanks contendo bem para a preparação posterior de células individuais. </li><li> Transferir o rato em cima do papel de seda a área de trabalho-C para a recolha de BAL, o nodo de drenagem linfática de pulmão, pulmão, e os tecidos do coração. Limpar instrumentos cirúrgicos. </li></ol> 4. Recolha de amostras de pulmão e do coração <ol><li> Dissecar o livre traquéia de músculo e tecido conjuntivo. Fórceps colocação sob a traquéia, puxe através de sutura. Gentilmente gerar trecho suficiente para cortar um buraco. Manter o alongamento suave, inserir a cânula traqueal com um movimento ligeiramente girando, e sutura cânula intó lugar. Para a inserção da cânula traqueal, certifique-se de que a traqueia seja húmido, se necessário adicionar uma gota de solução de Hanks. Durante todo o processo, respirar, relaxar músculos do pescoço e da mandíbula, para manter os movimentos da mão segura e suave. </li><li> Dissecar abrir a caixa torácica, removendo cuidadosamente o esterno a partir da extremidade abdominal. Não perturbe o conteúdo do tórax, porque isso irá torná-lo muito difícil encontrar o nó de linfa. </li><li> Realizar lavado broncoalveolar (LBA) por inserção suavemente 1 ml de tampão de Hanks, vire suavemente a seringa e recuperar fluidos BAL. Repetir 3 vezes, o tubo estreito e colocar em gelo. Durante todo o processo, manter os olhos na extremidade da cânula traqueal que se conecta à seringa. Olhar para observar o tórax inflação e deflação dos pulmões. </li><li> Colheita linfonodo pulmão mantendo parede costelas com um conjunto de pinças, encontrar e recuperar o nó de linfa com outros fórceps. Nó de linfa lugar em 24 placa bem. É importante kagora onde procurar: a partir do pescoço, encontrar a entrada da caixa torácica a partir do lado direito do rato e olhar por cima da coluna (Figura 5). </li><li> Colheita coração e coloque em papel de seda. Isolar o coração direito, cuidadosamente dissecar ao lado do septo. Transferência para área de trabalho-A pesar, registrar o peso e colocar nos tubos de eppendorf para tirar congelamento em nitrogênio líquido. </li><li> Coloque sutura em torno do lobo do pulmão esquerdo para fechar o brônquio principal. Dissecar o pulmão esquerdo lobo livre, em lugar do tubo eppendorf e congelamento de encaixe em azoto líquido, ou local dentro de um poço de uma placa de 24 poços contendo uma solução de Hanks para o isolamento posterior de suspensões de células individuais. </li><li> Insira aprox. 0,5 ml solução de formol tamponado através da cânula traqueal para os lobos pulmonares restantes. Depois de inflação, dissecar os lobos pulmonares para fora do tórax e coloque em tubo de 50 ml contendo solução de formaldeído. Para um projeto de estudo alternativo, os pulmões podem ser inflados com otimismomal meios de corte (OCT, diluído a 1:4 com PBS) e congelados em um molde contendo outubro não diluídas para a preparação posterior de secções congeladas. Outro projeto de estudo pode exigir a obtenção de pressão tecido pulmonar congelado e suspensões de células individuais dos pulmões. Nesse caso, não é necessária a inflação: dissecar os lobos pulmonares restantes; recuperá-los a partir do tórax e do lugar para a placa de 24 poços para um tampão de Hanks contendo bem. </li><li> Remover cânula traqueal, limpo por lavagem com tampão de Hanks, limpar instrumentos cirúrgicos. </li></ol> 5. Análise de curvas de pressão gerada a partir do cateter do coração direito Os gravados dados de pressão do ventrículo direito são analisados ​​usando LabChart 7 software sem conhecimento da identidade de grupo de cada gravação. Mais de 20 curvas são seleccionados de forma aleatória e que a diferença entre máximo e mínimo de pressão ventricular medido para cada curva (AP). O AP média é calculada para dar o v direitapressão sistólica entricular.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O fluxo experimental descrito aqui permite a medição rápida e simultânea da pressão sistólica ventricular direita e colheita de amostras para a análise das respostas no pulmões, do coração e do sistema imune em ratinhos. O procedimento combina medições coração fisiologia, micro-dissecção e colheita de tecidos para estudos posteriores de células vivas, análise histológica, ou omics-análise dos tecidos. O procedimento completo demora menos de 20 minutos por ratinho. Por causa do fluxo de trabalho de tr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagentes </td></tr><tr><td> 2-Metil-2-butanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 152463 </td><td></td></tr><tr><td> 2,2,2-tribromoetanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T48402 </td><td></td></tr><tr><td> sabão desinfetante (Cobertura da Pulverização TB mais Steris) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1629-1608 </td><td></td></tr><tr><td> Álcool Etílico, 200 Proof, Absoluto, Grade ACS / USP anidro </td><td> PHARMCO-AAPER </td><td> 111000200 </td><td> Diluir a 70% com água destilada </td></tr><tr><td> Solução de formaldeído </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1635-500ML </td><td> Diluir a 7-10% de uma formaconcentração ldehyde PBS a uma concentração de 1 x PBS utilizando solução mãe e água </td></tr><tr><td> Hanks, solução sem cálcio magnésio, </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-022 CV- </td><td></td></tr><tr><td> Outubro </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina (10.000 U / ml) / estreptomicina (10.000 mg / ml) Solução </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Salina tamponada com fosfato (PBS), sem cálcio, sem magnésio, soluções 1x e 10x </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 26% de sódio pentobarbital </td><td> Fort Dodge Animal Health </td><td> NDC 0856-0471-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Labware </td></tr><tr><td> As placas 12, 24, 96 bem </td><td> Falcão </td><td></td><td></td></tr&gt; <tr><td> Pipetar transferência </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-9BM </td><td></td></tr><tr><td> Tubo, revestida de EDTA </td><td> Sarstedt </td><td> 2013-08 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos ml de 0,65 e 1,7 ml de centrífuga de micro- </td><td> VWR </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Os tubos de polipropileno de 12 x 75 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-956 1D- </td><td></td></tr><tr><td> Tubos, vários tamanhos, polipropileno </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Fórceps, Dumon # 5 Fina </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps, extra fino Graefe-0.5mm dicas curvo </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11152-10 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps, fi adicionalGraefe ne-0.5mm dicas reta </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> Cânula 18ga, 19 ga </td><td> BD </td><td> Agulhas Precision Glide </td><td> Corte com o comprimento ideal, embotado e fora raspou para criar uma superfície áspera fora </td></tr><tr><td> Tesouras, tesouras dissector-slim lâminas de 9 centímetros </td><td> Belas Science Tools </td><td> 14081-09 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura para BAL, fio de seda trançada, 4-0 </td><td> Belas Science Tools </td><td> SP116 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura para cateterismo cardíaco direito, fio de seda trançada, 6-0 </td><td> Teleflex médica </td><td> 18020-60 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa, 1 ml </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Amplificador, PowerLab 4/30 </td&gt; <td> ADInstrument </td><td> Modelo ML866 </td><td></td></tr><tr><td> Pressão do cateter, F1.4 </td><td> Millar Instruments, Inc </td><td> 840-6719 </td><td></td></tr><tr><td> Dissecando microscópio </td><td> Variscope </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fórceps, tesoura Vannas primavera-2 milímetros lâminas </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Halogênio Iluminado Lupa Desk </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-990-56 </td><td></td></tr><tr><td> Computador portátil </td><td> Asus </td><td> Modelo número do processador i5 A52F; 15 polegadas </td><td></td></tr><tr><td> Fonte de Luz </td><td> Amscope </td><td> HL-250-A </td><td></td></tr><tr><td> Unidade de Controle de Pressão </td><td> Millar Instruments, Inc </td><td> PCU-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Software, Labchart-Pro V.7 </td><td> Em ADtrumentos </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice

A função do coração é bombear direito o sangue através dos pulmões, que liga a fisiologia do coração direito e fisiologia vascular pulmonar. A inflamação é um modificador comum do coração e da função do pulmão, através da elaboração de infiltrado celular, produção de citocinas e factores de crescimento, e, iniciando processos de remodelação 1. Em comparação com o ventrículo esquerdo, o ventrículo direito é uma bomba de baixa pressão, que funciona de uma zona relativamente estreita de mudanças de pressão. O aumento das pressões de artéria pulmonar estão associados com aumento da pressão no leito vascular pulmonar e hipertensão pulmonar 2. A hipertensão pulmonar é frequentemente associada a doenças pulmonares inflamatórias, por exemplo, doença pulmonar obstrutiva crônica, doenças auto-imunes ou 3. Como a hipertensão pulmonar confere um prognóstico ruim para a qualidade de vida ea expectativa de vida, muita pesquisa é direcionada para a compreensão dos mecanismos que might ser alvos para 4 intervenção farmacêutica. O principal desafio para o desenvolvimento de ferramentas de gestão eficazes para a hipertensão pulmonar permanece a complexidade da compreensão simultânea de alterações moleculares e celulares no coração direito, os pulmões eo sistema imunológico. Aqui, nós apresentamos um fluxo de trabalho de procedimento para a medição rápida e precisa de mudanças de pressão no coração direito de ratos e a colheita de amostras em simultâneo a partir de coração, pulmões e tecidos imunes. O método baseia-se no cateterismo directa do ventrículo direito através da veia jugular em estreita de peito ratinhos, desenvolvido pela primeira vez na década de 1990, como medida substituta da pressão na artéria pulmonar 5-13. A equipe de abordagem organizada facilita muito rápida técnica de cateterismo do coração direito. Isto faz com que seja possível realizar as medições em ratos que respiram espontaneamente com ar ambiente. A organização do fluxo de trabalho em diferentes áreas de trabalho-reduz o tempo de atraso e abre a possibilidade de realizar simultaneamente experimentos de fisiologia e colher tecidos do coração, pulmão e imune. O fluxo de trabalho de processo descrito aqui pode ser adaptado para uma grande variedade de ambientes de laboratório e desenhos de estudo, desde pequenas experiências orientadas, para testes de rastreio grandes drogas. A aquisição simultânea de dados da fisiologia cardíaca que pode ser expandida para incluir a ecocardiografia 5,14-17 e colheita de tecidos de pulmão, coração e imunológico, reduz o número de animais necessários para obter os dados que se movem a partir do conhecimento científico para a frente. O fluxo de trabalho processual apresentada aqui também fornece uma base ideal para ganhar o conhecimento das redes de ligação de pulmão, imune e função cardíaca. Os mesmos princípios aqui descritos podem ser adaptados para estudar outros órgãos ou adicionais, se necessário.

O desfecho primário para a obtenção de curvas de pressão direito do coração é conseguido por a posição correcta do cateter ventricular direita. A forma das curvas de tempo de pressão é crítica, porque a correcta colocação do cateter no interior do ventrículo direito irão resultar em patamares de pressão (Figura 4). Curvas de picos, em vez disso, indicam um cateter que é movida pela respiração ou movimento batida do coração contra a parede do ventrículo direito. Para detectar poss?...

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Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Um protocolo específico e rápido para pesquisar, simultaneamente, a função cardíaca direita, inflamação pulmonar, e da resposta imunológica é descrito como uma ferramenta de aprendizagem. Vídeo e figuras descrevem fisiologia e técnicas de microdissecção em um grupo organizado abordagem, que é adaptável a ser utilizado para as pequenas e grandes estudos porte.

Sistólica do ventrículo direito Medição de Pressão em combinação com colheita de amostras de tecido pulmonar e imunológica em ratos

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

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25.0K visualizações.  New York University School of Medicine, Tuxedo. Um protocolo específico e rápido para pesquisar, simultaneamente, a função cardíaca direita, inflamação pulmonar, e da resposta imunológica é descrito como uma ferramenta de aprendizagem. Vídeo e figuras descrevem fisiologia e técnicas de microdissecção em um grupo organizado abordagem, que é adaptável a ser utilizado para as pequenas e grandes estudos porte.