نحن نعترف K. Mikic، الذين ساهموا في المرحلة الأولى من هذا الفيلم وM. نيكولسكو للصورة مير. وأيد جيم هوبر من قبل الزمالة من IZKF من Universtitätsklinikum توبنغن، A. ألوين بريم اناند من قبل البرنامج ثروة من Universtitätsklinikum توبنغن.

1. متطلبات والبيضة التثقيب الكهربائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد بناء ناقلات: وقد صممت مير الشعور والعقاقير الاشعال بعد تعليمات من AMBION، صلب وligated في APAI / EcoRI هضمها pSilencer U6.1 النواقل. بعد التحول الناجح كانت تزرع واحد من الحيوانات المستنسخة الناتجة عنها، وكان معزولا pSilencer البلازميد بواسطة طريقة تحلل القلوية باستخدام Quiagen ميدي إعداد عدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأقطاب الكهربائية: أقطاب يمكن شراؤها بسهولة أو أن يبنى 13. نستخدم أقطاب عصامي من سلك البلاتين (Φ = 0.2، 0.25، أو 0.5 مليمتر في القطر) أو في بعض الحالات وحتى أصغر سلك التنغستن القطب (Φ = 0.1 ملم) 8 اعتمادا على المنطقة التي نريد ل electroporate. لتجنب الحارقة من الأنسجة، ونحن نستخدم كقاعدة وأقرب إلى الأنسجة أرق الأقطاب. ل electroporation واسعة من المخ الأوسط، ونحن نستخدم 0.5 مم أسلاك البلاتين ملحوم إلى أنبوبي النحاس / الفولاذ المقاوم للصدأرمح وثابتة لحامل الكهربائي مع مسافة 3-5 مم (الشكل 1). ل electroporate مجالات محددة، ونحن نستخدم 0.25 ملم الأنودات سلك البلاتين 0.2 ملم وسلك البلاتين أو 0.1 ملم لالتنغستن القطب السالب مع المسافة التقريبية من 1 ملم أو أقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلول: هل الحلول التالية جاهزة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيمها قارع الأجراس الدجاج، ودرجة الحموضة 7.5 (9.0 غرام كلوريد الصوديوم، 0.42 ز بوكل، 0.24 غرام CaCl2، تذوب في الماء المقطر 1 لتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج تلفزيوني (8 ز كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام بوكل، 0.24 غ KH 2 PO4، 1.44 ز نا 2 هبو 4، تذوب في 1L المقطر H 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سريع الأخضر: محلول المخزون 10 ملغ / مل H 2 O المقطر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحبر تجفيف بطيئة (أقل اللك وبالتالي التسمم أقل للجنين). ملاحظة: مرشح مزدوج اللون الأزرق تعلق على مصباح الألياف البصرية كما هو موضح في كانتو-سولير وأدلر 14 يعزز التباين ويمكن القضاء على الحاجة لحقن الحبر. </li></ol></li></ol><img src="/files/ftp_upload/50024/50024fig1.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50024/50024fig1highres.jpg"/> الشكل 1. الرسم التخطيطي من الأقطاب الكهربائية وحامل القطب. كان ملحوم (A، B، C) سلك البلاتين إلى جانب واحد من أنبوبي رمح الفولاذ المقاوم للصدأ. تم حفر ثقب في الجانب الآخر من رمح أنبوبي بالتالي أن المقابس دبوس يمكن يلائمه (A) تم ربط الأحمر والأسلاك زرقاء اللون لشمعات دبوس. في الطرف المقابل تم تركيب السلك إلى موصلات الموز التي تعمل مع المقابس الكهربائية من electroporator. (A، C) عازمة سلك البلاتين في ملاكا من 90 درجة. هناك طبقة من طلاء الأظافر عزل رمح فوق منحنى. 2. الاستعدادات قبل مباشرة في البيضة التثقيب الكهربائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المواد التالية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الحبر مع الدجاج قارع الأجراس 01:06، إضافة محلول مضاد حيوي مضاد فطري (100X من Gibcس) 1:100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل ناقلات: 1-2 ميكروغرام / ميكرولتر في الحمض النووي محددة في H 2 O تستكمل مع الأخضر سريع (1:20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الملقط، مقص، إبرة التنغستن الأقطاب ومع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب بال micropipettes للحقن الحمض النووي من الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات (طول القطر الخارجي لل: 100 مم × 0.9 مم). نستخدم ساحبة بسيطة PUL-1 (WPI، برلين) مع الإعدادات هو مبين في الجدول رقم 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المعلمات من electroporator كما هو مبين في الجدول رقم 2. </li></ol></li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td fo:width="1in"> المعلمات </td><td fo:width="1in"> القيم </td></tr><tr><td> حرارة </td><td> 350 </td></tr><tr><td> سحب </td><td> 100 </td></tr><tr><td> سرعة </tد&gt; <td> 50 </td></tr><tr><td> تأخير </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. إعدادات لPUL-1 <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> المعلمات </td><td fo:width="1.5in"> القيم </td></tr><tr><td> تردد </td><td> 50 هرتز </td></tr><tr><td> تأخير </td><td> 20 - 50 ميللي ثانية * </td></tr><tr><td> عرض </td><td> 20 ميللي ثانية </td></tr><tr><td> الجهد </td><td> 8-25 V * </td></tr><tr><td> نبض </td><td> 3-5 مرات </td></tr><tr><td colspan="2"> * اعتمادا على قطر الكهربائي والمسافة. من فضلكتأخذ ذلك في الاعتبار عند تغيير أحد المعلمات. </td></tr></tbody></table> الجدول 2. إعدادات لتحفيز نبض <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد افراخ الدجاج ل electroporation: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان بيض الدجاج المخصب على الجانب يعد لها عند 37 درجة مئوية مع رطوبة 65٪ لمدة 39 ساعة للحصول على الأجنة بين همبرغر وهاميلتون (سمو) مراحل 15 9-11. يستقر الجنين في أعلى جزء من البيض، لذلك يجب وضع علامة عليه مع خط قلم رصاص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير البيض مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يخترق البويضة في الجانب الأوسع، حيث يجب أن يكون تجويف الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 1-2 مل من بياض البيض. وهذا فصل الجنين من قشر البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التشيلو الشريط قشر البيض لتجنب شظايا قذيفة تسقط على الجنين. استخدام زوج من مقص لقطع نافذة صغيرة في قشر البيض حول خط قلم رصاص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن قليلا من الحبرتحت المنطقة المعتمة لتصور الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اجراء خفض في الغشاء المحي مع إبرة التنغستن شحذ لتحقيق إمكانية الوصول بشكل أفضل من الجنين للحقن الحمض النووي و electroporation. </li></ol></li></ol> 3. التثقيب الكهربائي والحضانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بضع قطرات من محلول دافئ رينغر على الأجنة. وهذا يقلل من الأجنة، ومنع ارتفاع درجة الحرارة، وتمسكه من الأقطاب الكهربائية إلى الأنسجة وتوفير وسيلة للتيار بين القطبين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن محلول ناقلات في تجويف الأنبوب العصبي في الدماغ المتوسط ​​المستوى. إذا كان لديك ناقلات التعبير الحمض النووي لا يحتوي على الجين مراسل (مثل EGFP)، إضافة قليلا أقل تركيزا مراسل ناقلات الجينات (1 ميكروغرام / ميكرولتر مير معربا عن ناقلات إلى 0.9 ميكروغرام / ميكرولتر مراسل ناقلات الجينات) في حل الحمض النووي. وهذا يضمن أن تتعرف على الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في وقت لاحق 8. ونحن نستخدم ما يسمى متجه pCAX، هدية عينية جيئة وذهابام C. كرول 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لترنسفكأيشن واسعة من الدماغ المتوسط، وضع أقطاب اليسار واليمين من الجنين في ذروة الدماغ المتوسط. يجب أن تكون المسافة بين الأقطاب حوالي 3-5 ملم. الإعدادات الأخرى هي 15V، 20 ميللي ثانية البقول و 50 ميللي ثانية تأخير لسمو 10. تغيير موقف القطبين قليلا على طول (DV) محور ظهراني بطني من الدماغ المتوسط ​​ويؤكد على ترنسفكأيشن واسعة من الخلايا أكثر ترنسفكأيشن محور DV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لترنسفكأيشن بطني، وإضافة بعض قارع الأجراس لرفع الرأس من غشاء الصفار ووضع الأنود تحت الدماغ المتوسط ​​البطني. إذا لم يرتفع رأسه دفع القطب تحت الغشاء الذي يفصل صفار البيض والجنين لتجنب الحارقة في الأنبوب العصبي. يجب وضع الكاثود فوق الدماغ المتوسط ​​ظهراني أفقيا المعاكس إلى القطب الموجب. لا تلمس الأنبوب العصبي. نحن بالنقل النصف البطني الأيسر من الدماغ المتوسط ​​لتجنب أي صعوبات مع التنمية القلب. المسافة بين الأقطابحوالي 1-0،5 ملم، وبقية الإعدادات يتم 10V، 20 عرض ميللي ثانية و 50 ميللي ثانية تأخير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق آخر قطرة من المالحة على رأس الأجنة لتبريده وإزالة فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم البيض مع الشريط واحتضان لمدة ساعة على الأقل 4؛ الحد الأدنى من الوقت اللازم لناقلات التعبير. </li></ol> 4. التثبيت من الأجنة الدجاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجنة من بيضها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة نظيفة تحت stereomicroscope وتقييم مدى ترنسفكأيشن مع المجهر ستيريو الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأجنة أكثر من ليلة في PFA 4٪ في 4 درجات مئوية. المضي قدما باجتزاء و / أو تلطيخ (الموقع التهجين، المناعية في) لتحليل التغييرات في المنطقة transfected. </li></ol>

<ol>
	<li>Kutter, C., Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA,+siRNA,+piRNA:+Knowns+of+the+unknown.">miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown.</a> RNA Biol. 5, 181-188 (2008).</li><li>Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigmatic+world+of+mRNA-like+ncRNAs:+their+role+in+human+evolution+and+in+human+diseases.">The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).</li><li>Li, X., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+small+regulatory+RNAs+in+determining+neuronal+identity.">Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).</li><li>Riedmann, L. T., Schwentner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA,+siRNA,+piRNA+and+argonautes:+news+in+small+matters.">miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters.</a> RNA Biol. 7, 133-139 (2010).</li><li>Coolen, M., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+brain+development+and+physiology.">MicroRNAs in brain development and physiology.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).</li><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li><li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shocking'+developments+in+chick+embryology:+electroporation+and+in+ovo+gene+expression.">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li><li>Nakamura, H., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misexpression+of+genes+in+brain+vesicles+by+in+ovo+electroporation.">Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).</li><li>Potter, H., Weir, L., Leder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer-dependent+expression+of+human+kappa+immunoglobulin+genes+introduced+into+mouse+pre-B+lymphocytes+by+electroporation.">Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).</li><li>Canto-Soler, M. V., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+cup+and+lens+development+requires+Pax6+expression+in+the+early+optic+vesicle+during+a+narrow+time+window.">Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window.</a> Developmental biology. , 294-2119 (2006).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).</li><li>Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation:+a+powerful+and+convenient+means+of+nonviral+gene+transfer+to+tissues+of+living+animals+(Review).">In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review).</a> Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).</li><li>Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physical+interaction+of+Meis2,+Pax3+and+Pax7+during+dorsal+midbrain+development.">Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development.</a> BMC Dev Biol. 12, 10 (2012).</li><li>De Pietri Tonelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+detection+of+microRNAs+in+developing+vertebrate+embryos+after+acute+administration+of+a+dual-fluorescence+reporter/sensor+plasmid.">Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid.</a> Biotechniques. 41, 727-732 (2006).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

<html> يوضح هذا الفيديو وسيلة فعالة لبالنقل البلازميد إلى خلايا عصبية ظهارية من مناطق معينة من الدماغ المتوسط ​​الفرخ. يمكن النبضات الكهربائية ذات الجهد المنخفض مستطيلة إدخال الحمض النووي في خلايا الأنبوب العصبي الفرخ في البيضة 6،16. ومع ذلك، غالبا ما يتم عر?...

الاعتراف الرنا صغيرة غير الترميز كلاعبين إضافية للتعبير الجين أطلقت التعقيد جديدة لتنظيم الجيني البرمجة / الجينات. أنواع مختلفة من الرنا غير الترميز لها أهمية وظيفية في الخلايا العصبية، بما في ذلك الصغيرة غير الترميز الرنا 1-4. MicroRNAs (مير أو ميرنا) على سبيل المثال تظهر ملامح التعبير متميزة وتغيير في العقول النامية 5. المستهدفة في التثقيب الكهربائي البيضة من افراخ الدجاج يوفر فرصة فريدة للسيطرة الزمانية والمكانية في التعبير الجيني وإسكات خلال التنمية. هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة لأداء التعبير خارج الرحم من ميرس في مناطق معينة من الدماغ المتوسط ​​الفرخ في البيضة باستخدام التثقيب الكهربائي 6-10. لضمان وجود تأثير طويل الأمد لهذه الرناوات الصغيرة غير الترميز في الخلايا، تم استنساخ تسلسل الحمض النووي من ميرس في ناقلات أحادية أو ثنائية cistronic. لفي التثقيب الكهربائي البيضة، مير تحتوي على الخامسيتم حقن ector في الأنبوب العصبي الدماغ المتوسط ​​من خلال تعريض الجنين بعد إجراء نافذة صغيرة في قشرة البيضة. لبالنقل مناطق معينة من الدماغ المتوسط ​​بالإضافة صغيرة (الأنود) وناقص (الكاثود) وتوضع أقطاب البلاتين في مواقف معينة. لترنسفكأيشن الدماغ المتوسط ​​البطني، يتم وضع القطب الموجب تحت الدماغ المتوسط ​​بطني اليسار والكاثود فوق النصف الأيمن من الدماغ المتوسط ​​قبل تطبيق الحالي. يتم إغلاق فتحة في قشر البيض مع الشريط ويتم تحضين الأجنة لطالما المطلوبة لأي تحليل. هذا الأسلوب وقد وصفت في الأصل من قبل موراماتسو وآخرون. 6 وتحسينها من خلال Momose وآخرون. 8 لترنسفكأيشن منطقة معينة. <img src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1.jpg" fo:content-width-="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1highres.jpg"/> نظرة عامة التخطيطي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتعرض الجنين في البيضة من خلال خفض نافذة صغيرة في اله قشر البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حقن ناقلات المنحل (ق) في الدماغ المتوسط ​​باستخدام الشعيرات الدموية الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطبين - وضعت بالتوازي أو تحت وفوق الجنين - توليد حقل كهربائي نابض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحقل الكهربائي يخلق زمنيا المسام في غشاء الخلية، والتي تسهل الدخول إلى الخلية بواسطة الحمض النووي المشحونة سلبا (أو RNA) تنجذب إلى القطب الموجب 11،12. </li></ol>

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company</td>
 <td></td>
 <td>Model</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosillicate glass capillaries </td>
 <td>Hartenstein</td>
 <td></td>
 <td>Model: 0.9 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapillary puller</td>
 <td>WPI, Berlin</td>
 <td></td>
 <td>Model: Pul1-E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electroporator</td>
 <td>Intracel</td>
 <td></td>
 <td>Model: TSSIC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope - fluorescence </td>
 <td>LEICA</td>
 <td></td>
 <td>Model: MZFLIII</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>Model: Stemi</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Camera and software</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

in ovo expression of microrna in ventral chick midbrain

الرنا غير الترميز لاعبين إضافية في تنظيم التعبير الجيني. المستهدفة في التثقيب الكهربائي البيضة من المجالات المحددة يوفر أداة فريدة للسيطرة المكاني والزماني للخارج الرحم التعبير الرنا الميكروي. ومع ذلك، وهياكل الدماغ مثل المخ الأوسط بطني بطني هي صعبة نوعا ما للوصول إلى أي تلاعب. هنا، علينا أن نظهر وسيلة فعالة ل electroporate ميرنا في الدماغ المتوسط ​​البطني باستخدام أقطاب البلاتين رقيقة. يقدم هذا الأسلوب وسيلة يمكن الاعتماد عليها لبالنقل مناطق معينة من المخ الأوسط وأداة مفيدة لفي الدراسات المجراة.

مدى منطقة الدماغ المتوسط ​​transfected مع مير مرئيا من خلال التعبير عن GFP من ناقلات مراسل حقن جنبا إلى جنب مع مير معربا عن ناقلات (الشكل 2). باستخدام أقطاب البلاتين التي يبلغ قطرها 0.5 ملم وضعت موازية لمحور AP من الخيوط الدماغ المتوسط ​​عادة إلى ترنسفكأيشن من منطقة ?...

Watch this Scientific Journal Video about In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain at JoVE.com

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

التعبير خارج الرحم هو أسلوب واحد لتوضيح دور microRNAs في نمو الدماغ. ومع ذلك، واستهداف مناطق محددة باستخدام التثقيب الكهربائي في البيضة هو التحدي. هنا، وتبين لنا وسيلة فعالة لمناطق الدماغ المتوسط ​​بطني وظهري electroporate انتقائي.

في التعبير البيضة من الرنا الميكروي في بطني الدماغ المتوسط ​​الفرخ

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

in-ovo-expression-of-microrna-in-ventral-chick-midbrain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

10.3K Views.  University of Tübingen.  التعبير خارج الرحم هو أسلوب واحد لتوضيح دور microRNAs في نمو الدماغ. ومع ذلك، واستهداف مناطق محددة باستخدام التثقيب الكهربائي في البيضة هو التحدي. هنا، وتبين لنا وسيلة فعالة لمناطق الدماغ المتوسط ​​بطني وظهري electroporate انتقائي. 

Video: In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

الثقافات شريحة عضوي النمط من المخ الأوسط بطني الجنينية : نظام لدراسة التنمية متعلق بالخلايا العصبية الدوبامينية في المختبر</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

عالية الدقة التصوير لايف من سلوك خلية في الظهارة العصبية النامية

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

في Electroporation البيضة في الدماغ المتوسط ​​الفرخ لدراسة وظيفة الجينات في الخلية العصبية الدوبامين التنمية

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

شامل التنميط من لائحة الدوبامين في المادة السوداء والمنطقة الجوفية السقيفية

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA تسلسل تحليل التفاضلية التعبير الجيني في Electroporated الفرخ الجنينية الحبل الشوكي

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, interactions with our environment can induce brain plasticity. Increasingly, research is trying to identify which environments stimulate brain plasticity beneficial for treating brain and behavioral disorders. Two environmental manipulations are described which increase or decrease the number of tyrosine hydroxylase immunopositive (TH+, the rate-limiting enzyme in dopamine (DA) synthesis) neurons in the adult mouse midbrain. The first comprises pairing male and female mice together continuously for 1 week, which increases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in males, but decreases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in females. The second comprises housing mice continuously for 2 weeks in &#8216;enriched environments&#8217; (EE) containing running wheels, toys, ropes, nesting material, etc., which increases midbrain TH+ neurons by approximately 14% in males. Additionally, a protocol is described for concurrently infusing drugs directly into the midbrain during these environmental manipulations to help identify mechanisms underlying environmentally-induced brain plasticity. For example, EE-induction of more midbrain TH+ neurons is abolished by concurrent blockade of synaptic input onto midbrain neurons. Together, these data indicate that information about the environment is relayed via synaptic input to midbrain neurons to switch on or off expression of &#8216;DA&#8217; genes. Thus, appropriate environmental stimulation, or drug targeting of the underlying mechanisms, might be helpful for treating brain and behavioral disorders associated with imbalances in midbrain DA (e.g. Parkinson&#8217;s disease, attention deficit and hyperactivity disorder, schizophrenia, and drug addiction).

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

التحويرات البيئية لعدد من الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية في الفئران الكبار

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

تحديد موثوق المعيشة الدوبامين الخلايا العصبية في الدماغ المتوسط ​​الثقافات عن طريق RNA تسلسل وTH يحركها المروج EGFP التعبير

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and &#946;-cell failure. Various strategies, including the injection of insulin or the usage of insulin-sensitizing drugs, were pursued to treat T2DM or at least reduce the symptoms. In addition, the application of herbal compounds has attracted increasing attention. Thus, it is necessary to find efficient test systems to identify and characterize insulin-mimetic compounds. Here we developed a modified chick embryo model, which enables testing of synthetic compounds and herbal extracts with insulin-mimetic properties. Using a fluorescence microscopy-based primary screen, which quantifies the translocation of Glucose transporter 4 (Glut4) to the plasma membrane, we were able to identify compounds, mainly herbal extracts, which lead to an increase of intracellular glucose concentrations in adipocytes. However, the efficacy of these substances requires further verification in a living organism. Thus, we used an in-ovo approach to identify their blood glucose-reducing properties. The approval by an ethics committee is not needed since the use of chicken embryos during the first two-thirds of embryonic development is not considered an animal experiment. Here, the application of this model is described in detail.

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

In this study, we describe an in-ovo system as a promising tool to test insulin-mimetic compounds in a living organism. The main advantages include adequate throughput rates and acceptable costs, which enable the identification of phytochemicals with insulin-mimetic properties.

في Ovo نموذجية لاختبار مركبات الأنسولين ميميتيك

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a premise for determining the role of neuron types within a neural circuit, and their significance in information encoding relative to learning. Likewise, the method can be used to test the physiological significance of two or more connected brain regions in awake and anesthetized animals. The current study demonstrates how VTA glutamate neurons modulate the firing rate of putative pyramidal neurons in the CA1 (hippocampus) of anesthetized mice. This protocol employs adeno-associated virus (AAV)-dependent labeling of VTA glutamate neurons for the tracing of VTA presynaptic glutamate terminals in the layers of the hippocampus. Expression of light-controlled opsin (channelrhodopsin; hChR2) and fluorescence protein (eYFP) harbored by the AAV vector permitted anterograde tracing of VTA glutamate terminals, and photostimulation of VTA glutamate neuron cell bodies (in the VTA). High-impedance acute silicon electrodes were positioned in the CA1 to detect multi-unit and single-unit responses to VTA photostimulation in vivo. The results of this study demonstrate the&#160;layer-dependent distribution of presynaptic VTA glutamate terminals in the hippocampus (CA1, CA3, and DG). Also, the photostimulation of VTA glutamate neurons increased the firing and burst rate of putative CA1 pyramidal units in vivo.

The current protocol demonstrates a simple method for tracing of ventral tegmental area (VTA) glutamate projections to the hippocampus. Photostimulation of VTA glutamate neurons was combined with CA1 recording to demonstrate how VTA glutamate terminals modulate CA1 putative pyramidal firing rate in vivo.

مجتمعة في فيفو التشريحية والوظيفية تتبع من محطات الغلوتامات منطقة البطن في قرن آمون

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...

في التعبير البيضة من الرنا الميكروي في بطني الدماغ المتوسط ​​الفرخ

في التعبير البيضة من الرنا الميكروي في بطني الدماغ المتوسط الفرخ