وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة MOP-81158.

1. استخراج البروتين من الخلايا العصبية مثقف الهدف الحصين الابتدائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل حصاد البروتين من الخلايا الذاتية الحصين الابتدائية، وإعداد مخزن مؤقت يزيس (LB؛ الجدول 1) مع مثبطات الأنزيم البروتيني. إلى 10 مل من العازلة تحلل، أضف 0.1 مل حل فلوريد phenylmethanesulfonyl (PMSF) إلى تركيز النهائي من 10MM، وإضافة 1 كوكتيل المانع قرص البروتيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد N-ethylmaleimide (NEM) الحل (الجدول 1) من مسحوق مجفف بالتجميد. حل بلطف في EtOH 100٪ في درجة حرارة الغرفة (RT). إعداد الحل دائما NEM جديدة ليوم التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين المخزن المؤقت المقبل تحلل وNEM. إضافة 0.5 مل من محلول 2M NEM إلى أنبوب جديد 50 مل المخروطية. إضافة 20 مل LB على أعلى، وبسرعة LB + مكان NEM (تركيز النهائي من 50MM) على منصة متحركة في 4 درجات مئوية لخلط بالكامل لمدة 5 دقائق. دائما إضافة NEM / 2 EtOH الحل الأول وLB، وذلك لخلط صحيح الاثنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا العصبية مثقف من الحاضنة ووضعت على الجليد *. إزالة بلطف وسائل الإعلام الخلوية، وغسل بلطف مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة الباردة (PBS) 1X. إضافة 300 مل من LB + NEM 50mm إلى البئر الأولى من الخلايا العصبية قرن آمون، وكشط الخلايا باستخدام خلية رافع التخلص منها. جمع lysate الخلية، ثم أداء المحللة في البئر التالية من هذه المجموعة. تتخلص الخلايا داخل البئر الثانية باستخدام رافعة للخلية، وجمع، وكرر باستخدام بئر ثالثة، إذا لزم الأمر لمزيد من التركيز المحللة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع lysate الخلية إلى ما قبل المبردة (على الجليد)، 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. كرر الخطوة 1،4 ميكرولتر من استخدام 100 LB + NEM 50mm إلى جمع أي lysate الخلية المتبقية. تمرير مجموع lysate الخلية من خلال حقنة في 26 ½ قياس 5-6 مرات للمساعدة في تحلل الميكانيكية، والحرص على عدم تفجير فقاعات في حل. يمكن للمرء أن يصوتن بدلا من 15 ثانية على الجليد، إذا المعدات المتاحة. Nutate lysate الخلية ل30 دقيقة ≥ ° 4 في C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توضيح lysa الخليةالشركة المصرية للاتصالات عن طريق الطرد المركزي في 16000 XG / 30 دقيقة، وذلك لخلايا الامم المتحدة هي lysed بيليه والمواد المنظفات غير قابلة للذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع مسح lysate الخلية (طاف) في الجديدة قبل المبردة أنبوب 1.5 مل على الجليد. بروتوكول تكرار الحصاد لجميع الفئات من الخلايا. قياس تركيز البروتين في جميع العينات المحللة باستخدام مقايسة BCA، وتطبيع حجم العينات المحللة من جميع المجموعات من الخلايا لديها البروتين الكلي يساوي بالضبط، مع الحد الأدنى الموصى به من 500 ميكروغرام. أعلى حتى مع جميع العينات LB + NEM 50mm إلى حجم مجموع 500 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1-5 ميكروغرام من الأجسام المضادة الأولية الموجهة ضد بروتين هدف لكل من عينة المحللة. Nutate العينات المحللة الأجسام المضادة مختلطة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li></ol> * ينبغي مثقف الخلايا العصبية قرن آمون الفئران الابتدائية في كثافة حوالي 250،000 خلية / جيدا في طبق 6 جيدا، في وسائل الإعلام المصل خالية يحتوي على ملحق B27 الخلايا العصبية، كما هو موضح سابقا 5، ونمت لرغبةد طول الفترة الزمنية، وعادة 14-16 يوما في المختبر (DIV) لتحقيق النضج. ويوصى ما لا يقل عن 500 ميكروغرام من البروتين الكلي للimmunoprecipitate بنجاح وbiotinylate بروتين الخلايا العصبية المستهدفة، الأمر الذي يتطلب عادة 2-3 آبار طبق 6 أيضا. 2. ترسيب البروتين الهدف جسم محدد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقبل عجل شل حركة بروتين الهدف، وإعداد الطين 50٪ من البروتين، البروتين او الخرز sepharose و G المغلفة. على وجه التحديد، إضافة ≥ 60 ميكرولتر من الخرز sepharose و لكل عينة لأنابيب 1.5 مل، وضمان أن يكون جميع العينات كميات متساوية من الخرز. الخرز المغناطيسي هي أيضا مناسبة إذا كانت المعدات المتاحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من الطين 50٪ لكل عينة المحللة الأجسام المضادة، وnutate ل≥ 1 ساعة في 4 درجات مئوية. </li></ol> 3. أسيل-البيوتين الصرف: هيدروكسيل (HAM) انشقاق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء أداء الخطوة 2.2، إعداد عدد من الأنابيب العازلة تحلل مع (LB) من ديfferent PHS. درجة الحموضة من المهم جدا لهذه الخطوات وينبغي دائما أن يتم ضبط درجة الحموضة متر باستخدام. إعداد 2 مل من درجة الحموضة LB 7.2 في العينة، و 0.5 مل من الاحتياطي صارمة لكل عينة (الجدول 1). أيضا بإعداد 0،5 مل + LB NEM 10MM لكل عينة، كما في الخطوات 1،1-1،3. إضافة PMSF وأقراص مثبط البروتياز لجميع مخازن تحلل، كما في الخطوة 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدروكسيل (HAM) هو عامل قوي الحد الذي الانقسام من بالميتات من cysteines هو مطلوب لbiotinylation (الشكل 1)، وهذا الإغفال من الانقسام HAM بمثابة المراقبة السلبية. تقسيم كل عينة من الخرز في عينتين، واحد مع حذف خطوة الانقسام HAM (-HAM)، وواحد بما في ذلك الخطوة HAM (+ HAM). لتطبيع للتدهور البروتين الناجم عن العلاج HAM، ينبغي للمرء أن تقسيم كل عينة إلى الثلثين، مع 1/3 من الخرز المستخدمة لسيطرة HAM، و 2 المتبقية / 3 يستخدم لعلاج + HAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحضير 1 إضافية.5 مل أنابيب على الجليد، وصفت بأنها سيطرة HAM مقابل كل عينة. بعد الخطوة 2.2، أجهزة الطرد المركزي بلطف حبات جميع العينات &quot;عند 0.5 XG / 1 دقيقة في 4 درجات مئوية (أجهزة الطرد المركزي في هذه السرعة، والمدة، ودرجة الحرارة لجميع الخطوات المتبقية ما لم ينص على خلاف ذلك)، ضع الأنابيب على الجليد، وإزالة طاف، و اعادة تعليق الخرز في 600 ميكرولتر من LB + NEM 10MM. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخرز العينات &#39;إعادة تعليق العازلة تحلل في NEM + 10MM، وجمع 200 ميكرولتر من الفور الطين المحللة-حبة العينة، والتفريغ في أنبوب لل-HAM أن العينة على الجليد. إضافة 300 ميكرولتر من إضافية LB + NEM 10mm إلى العينة HAM، ومبلغ إضافي 100 ميكرولتر إلى + عينة HAM لما مجموعه 500 ميكرولتر في كل عينة. احتضان الأنابيب لمدة 10 دقيقة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق (غسل) THE-HAM HAM وعينات + بلطف مع العازلة صرامة 0.5 مل، لكل عينة. تنفيذ هذه الخطوة بسرعة، على حضانة أطول SDS سيؤدي إلى إزالة الأجسام المضادة من متجهة منالخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل برفق جميع العينات ثلاث مرات في 0.5 مل / عينة من درجة الحموضة LB 7.2، وتدور باستمرار بين يغسل كما في الخطوة 3.2b. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء أداء الخطوة 3.5، إعداد العازلة HAM (الجدول 1). إضافة حجم مناسب من حل هيدروكسيل إلى أنبوب جديد، لتحقيق تركيز النهائي من 1M في حجم من 0.5 درجة الحموضة LB مل، 7.2 + عينة في HAM. إعداد المخزن المؤقت دائما HAM جديدة ليوم التجربة. إضافة 0.5 مل / عينة من درجة الحموضة 7.2 إلى LB-HAM جميع العينات، و 0.5 مل / العازلة عينة من عينات لجميع HAM HAM +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Nutate جميع العينات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT). لا تتجاوز 1 ساعة. </li></ol> 4. أسيل-البيوتين الصرف: البيوتين، وصفها BMCC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء أداء الخطوة 3.6، 2 مل من إعداد الأس الهيدروجيني 6.2 في عينة LB (الجدول 1)، كما في الخطوة 3.1. ضع الرقم الهيدروجيني 6.2 على الجليد LB لحين الحاجة إليها. إعداد محلول المخزون أيضا من البيوتين-BMCC (الجدول 1) مباشرة قبل استخدامها. تزن من exactly 2،1 ملغ من البيوتين-BMCC، وجمع في أنبوب 1.5 مل، وبلطف في حل سلفوكسيد ثنائي ميثيل 0.5 مل (DMSO) من خلال وضع على منصة هزاز في RT، لتحقيق تركيز 8MM (لا تستخدم ماصة لتفريق مسحوق ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد الانتهاء من الخطوة 3.6، يغسل بلطف حبات مرة واحدة في درجة الحموضة عازلة تحلل 6.2، لإزالة بقايا العازلة HAM. إزالة طاف ووضع العينات في الثلج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البيوتين-BMCC هو جزيء maliemide البيوتين مترافق التي لها قابلية عالية للجماعات ثيول خالية من cysteines (الشكل 1). أثناء أداء الخطوة 4.2، 0.5 مل من إعداد البيوتين-BMCC العازلة (الجدول 1) لكل عينة، في تركيز العمل بين 0.5 ميكرومتر إلى 5 ميكرومتر. تركيزات تزيد من 5 ميكرومتر سوف تشبع من المرجح أن البروتين المستهدف 6، وعادة لا ينبغي أن يتجاوز، ولكن هذا قد تختلف اعتمادا على البروتين الهدف المطلوب. إضافة 0.5 مل من البيوتين-BMCC العازلة لكل عينة، وnutate ل1 ساعة بالضبط في 4 ودرجة؛ C. لا تتجاوز 1 ساعة. </li></ol> 5. شطف من البروتين الهدف البيوتين، مترافق وSDS PAGE- <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد الانتهاء من الخطوة 4.3، يغسل برفق جميع العينات مرة واحدة في درجة الحموضة LB 6.2. إبقاء جميع العينات على الجليد بينهما يغسل. إزالة 2X العازلة عينة SDS مع عدم وجود وكلاء الحد من (الجدول 1) من تخزين -20 درجة ذوبان الجليد و° ببطء على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل بلطف عينات ثلاث مرات في درجة الحموضة 7.5 + LB PMSF / مثبطات، والحفاظ على الجليد في عينات بين يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف للغسل الثالث، وترك حبات مكعبات في الطين مع العازلة المتبقية في الجزء السفلي من الأنبوب. تراجع ماصة مع طرف ذات القطر الصغير (تلميح تحميل هلام أو تلميح ماصة P2 كافية) في الجزء السفلي جدا من أنبوب من خلال الطين، وجمع أي بسرعة العازلة المتبقية، والحرص على عدم تناول أي الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكملة عينة SDS 2X العازلة مع DL-Dithiothreitol (DTT) لتحقيق تركيز النهائي من 5MM. إضافة40-50 ميكرولتر من العازلة عينة 2X + DTT 5mm إلى كل عينة. إذا لزم الأمر، دوامة حبات لخلط تماما مع المخزن المؤقت العينة، وأجهزة الطرد المركزي بسرعة عالية على الفور لجمع كل الخرز في بيليه، الغارقة في المخزن المؤقت العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغلي جميع العينات لمدة 10 دقيقة في 75-80 ° C. اسمحوا باردة لعينات RT ل10 دقيقة ≥ على رأس مقاعد البدلاء، وأجهزة الطرد المركزي في 16000 XG / 3 دقائق لحبات تماما بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مجلد كامل للبروتين مزال (طاف) من كل عينة إلى ممر واحد داخل هلام بولكرلميد مناسبة للغرب النشاف، وذلك باستخدام SDS-PAGE 7. تنظيم جميع العينات بحيث يتم تشغيل-HAM شاطف السيطرة و+ شاطف HAM لعينة واحدة على الفور المجاورة لبعضها البعض خلال SDS-PAGE (الشكل 2). بعد SDS-PAGE، ونقل إلى غشاء النيتروسليلوز أو PVDF. </li></ol> 6. يلطخ الغربية والكشف عن بروتين الهدف من Palmitoylation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد الانتهاء من 5،6 خطوة، وغسل الغشاءمرتين في تريس مخزنة المالحة (TBS 1X) لمدة 10 دقيقة على منصة هزاز في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منطقة عازلة لمنع الحظر غير محددة من العلامات وزنها من ألبومين المصل البقري (BSA)، لتحقيق الوزن 3٪ في حجم TBS 1X + توين-20 0.05٪ (TBS-T) غير كافية لغمر كامل الغشاء . لstreptavidin النشاف، منع دائما مع BSA وليس الحليب المجفف. منع الغشاء لمدة 1 ساعة عند RT على منصة هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الضد من BSA + TBS-T 0.3٪. أعادت إضافة Streptavidin-HRP الأجسام المضادة في 1 ملغ / مل في الماء المقطر، مخففة في 1:5،000-1:10،000. بمجرد الانتهاء من الخطوة 6.2، يغسل الغشاء مرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة، ثم احتضان الغشاء في محلول الأجسام المضادة Streptavidin على منصة هزاز إما ل1 ساعة في RT، أو بين عشية وضحاها في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء ثلاث مرات في TBS-T لمدة 10 دقيقة على منصة هزاز. من أجل الكشف عن إشارة palmitoylation، تعرض التلألؤ HRP باستخدام كيمياءiluminescent الركيزة عدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل تطبيع مستويات palmitoylation لكمية من البروتين من الفائدة التي كان immunoprecipitated، تجريد الغشاء باستخدام لطخة غربية عازلة للتجريد 5-10 دقيقة على منصة هزاز في RT. كرر الخطوات 6،1 حتي 6،4 باستخدام الأجسام المضادة الأولية ضد البروتين من الفائدة التي كانت في الأصل تستخدم لمناعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد palmitoylation من البروتين من الفائدة باستخدام صورة برامج التحليل، وتطبيع مستويات palmitoylation لكمية البروتين immunoprecipitated. </li></ol>

<ol>
	<li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity.">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation.">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456, 904-909 (2008).</li><li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation.">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36, 276-285 (2004).</li><li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+proteins:+purification+and+identification.">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).</li><li>Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+hippocampal+and+cortical+neurons+in+a+mixture+of+MEM++and+B27-supplemented+neurobasal+medium.">Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium.</a> Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).</li><li>Drisdel, R. C., Alexander, J. K., Sayeed, A., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+of+protein+palmitoylation.">Assays of protein palmitoylation.</a> Methods. 40, 127-134 (2006).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. W. e. s. t. e. r. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).</li><li>Huang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+palmitoyl+acyl+transferases+exhibit+distinct+substrate+specificity.">Neuronal palmitoyl acyl transferases exhibit distinct substrate specificity.</a> FASEB J. 23, 2605-2615 (2009).</li><li>Noritake, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+DHHC+palmitoylating+enzyme+mediates+activity-sensitive+synaptic+targeting+of+PSD-95.">Mobile DHHC palmitoylating enzyme mediates activity-sensitive synaptic targeting of PSD-95.</a> J. Cell Biol. 186, 147-160 (2009).</li><li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation+by+DHHC5/8+Targets+GRIP1+to+Dendritic+Endosomes+to+Regulate+AMPA-R+Trafficking.">Palmitoylation by DHHC5/8 Targets GRIP1 to Dendritic Endosomes to Regulate AMPA-R Trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li><li>Hayashi, T., Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+palmitoylation+of+NR2+subunits+regulates+NMDA+receptor+trafficking.">Dual palmitoylation of NR2 subunits regulates NMDA receptor trafficking.</a> Neuron. 64, 213-226 (2009).</li><li>Ho, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-Nitrosylation+and+S-Palmitoylation+Reciprocally+Regulate+Synaptic+Targeting+of+PSD-95.">S-Nitrosylation and S-Palmitoylation Reciprocally Regulate Synaptic Targeting of PSD-95.</a> Neuron. 71, 131-141 (2011).</li><li>Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+protein+palmitoylation+in+cellular+signaling.">Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling.</a> Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الفحص IP-ABE المقدمة هنا هي طريقة بسيطة وحساسة للغاية للكشف عن البروتينات palmitoylated في الخلايا العصبية قرن آمون مثقف الابتدائي، وذلك باستخدام تقنيات الكيمياء الحيوية القياسية في الغالب. هذا يجعل الفحص التكيف بسهولة للمختبرات مجهزة بالفعل مع النشاف الغربية المواد. الفحص IP-ABE يجمع بين معيار بروتوكول مناعي لعزل البروتين وشل واحد هدف، تليها الكيمياء ABE موضح سابقا 2-4 للكشف بسرعة مستويات البروتين بالميتات على الركيزة. تقنية ABE لديها مجموعة واسعة من التطبيقات لدراسة البروتينات palmitoylated في الأنسجة المختلفة، وخطوط الخلايا، بما في ذلك الفحص بالميتويل-البروتين على نطاق واسع لمحات palmitoylation العالمية، والكشف السريع عن مستويات من البروتين palmitoylation هدف واحد. وقد استخدمت الأوصاف السابقة للكيمياء مختلفة ABE تحلل الخلايا واستخراج الأساليب المنظفات من البروتوكول الاضافي العصبيةeins 2، 9، مجانا-ثيول الحصار 10 و 11 و biotinylation، وتنقية البروتين المستهدف 4، اعتمادا على تطبيق التجربة. وإضافة إلى نتائج بالميتات البروتينات العصبية في استهداف تجاه الأغشية الخلوية، والكشف عن جزء من بروتين palmitoylated الهدف يتطلب استخراجه من هذه الأغشية. وقد استخدمت منهجيات سبق وصفها ABE مجموعة متنوعة من 9 الأيونية والمنظفات غير الأيونية 8 إلى استخراج البروتينات الهدف المطلوب، واستخدام المنظفات خاصة تعتمد على البروتين المستهدفة والاتجار به غشاء المعروفة. هنا، ونحن الاستفادة من غير تغيير طبيعة والمنظفات غير الأيونية IGEPAL CA-630 لاستخراج البروتينات palmitoylated، التي لدينا لاستخراج والتحقق من صحة الكشف عن الخلايا العصبية palmitoylated catenin-δ البروتين (الشكل 2). هيكل IGEPAL CA-630 تضم مجموعة ضخمة وصلبة الرأس غير القطبية التي لاتعطيل البروتين التشكل الأصلية أو التفاعلات، ولكن الذي يسمح ارتباطه المناطق مسعور من البروتينات المرتبطة غشاء، وبالتالي منح امتزاج لهم والسماح لهم استخراج. يجب أن يكون استخراج البروتينات العصبية العديد مترجمة إلى الغشاء متشابك أو الكثافة بعد متشابك من نقاط الاشتباك العصبي باستخدام IGEPAL CA-630، ولكن قد لا ذوبان بعض تماما، وربما تتطلب استخدام المنظفات غير يبدل طبيعة مختلفة مثل تريتون X-100، التي لديها استخدمت سابقا للكيمياء ABE 2 و 8. وقد استخدمت العديد من الأوصاف الكيمياء ABE أيضا مختلفة كاشف biotinylation ثيول التفاعل جزيء من وصفنا هنا، ودعا البيوتين-HPDP (الحرارية العلمية)، وهو ما يتطلب أيضا وسائل مختلفة من البروتين تنقية 4. البيوتين-HPDP هو آخر ثيول التفاعل، جزيء البيوتين، مترافق maliemide الذي يحتوي على السندات ثاني كبريتيد في الذراع رابط maliemide، د هيكلياifferentiating أنه من البيوتين-BMCC، والتي لا تحتوي على هذه السندات ثاني كبريتيد. بعد biotinylation-ثيول من السيستين بروتين الحرة أو palmitoylated من البيوتين-HPDP، يمكن المشقوق السندات ثاني كبريتيد الناتجة بين البروتين المستهدفة والمجموعة البيوتين عن طريق الحد من الكواشف لاطلاق سراح مجموعة البيوتين وتجديد البروتين في صيغتها الغير معدلة، مما يجعل biotinylation من البيوتين-HPDP عابرة وقابلة للانتكاس. ولذلك، واستخدام هذا يتطلب تنقية كاشف biotinylation من البروتين المستهدف لالكواشف أفيدين يجمد، مثل streptavidin المغلفة الخرز. ومع ذلك، ثيول-biotinylation من البروتين المستهدف لالبيوتين-BMCC، كما وصفنا هنا، مستقرة ودائمة نسبيا، ويتطلب تنقية البروتين المستهدف من قبل الأجسام المضادة الموجهة ضد الهدف، وثبتوا على الخرز sepharose و. وقد استخدمت كل التقنيات ABE سابقا على نطاق واسع الشاشات، والكشف عن البروتينات واحدة من palmitoylation 2، 8-10، 12، وعلىIP-ABE الفحص وصفنا هنا هو الأمثل للكشف السريع عن palmitoylation من البروتينات واحد هدف العصبية. الأغلبية الساحقة من palmitoylation الخلوية ينطوي على إضافة عكسها من بالميتات إلى مجموعة من ثيول cysteines (وهو ما يسمى S-palmitoylation، ونحن التعميم باسم &#39;palmitoylation في هذا البروتوكول)، ومع ذلك يتعرضون مجموعة محدودة جدا من البروتينات لpalmitoylation لا رجعة فيه في جليكاين وبقايا السيستين من خلال تشكيل السندات أميد مستقرة، ووصف N-palmitoylation 13. واحد الحد من الكيمياء ABE هو عدم قدرتها على كشف N-palmitoylation نظرا لاستقرار السندات أميد، وهكذا ينبغي تأكيد الفرز من البروتين المستهدف لرواية palmitoylation باستخدام 3H-بالميتات وضع العلامات الأيضية 1. كما ذكر سابقا، يمكن الفحص IP-ABE تكييفها بسهولة لفحص palmitoylation في مقتطفات البروتين من مصادر متعددة، بما في ذلك ترانsfected خطوط الخلايا مغاير، والأنسجة الابتدائية، والثقافات العصبية الأولية من مناطق الدماغ متعددة. وقد استخدمت مقايسة IP-ABE لدراسة الاكتفاء palmitoylation من البروتينات السيستين إلى سيرين تحور لتحديد مكان وجود السيستين palmitoylated على طول البروتين الهدف 8، لدراسة ديناميكية دوران بالميتات على البروتينات في الخلايا العصبية مثقف متشابك في ظل ظروف القاعدية 10، والتغيرات في مستويات البروتينات palmitoylation العصبية بعد تحريض نشاط الخلايا العصبية 9. حساسية وقابلية التكيف للمقايسة IP-ABE جعلها مناسبة بشكل مثالي لدراسة ملامح palmitoylation من البروتينات العصبية، والأمثل للكشف عن التغيرات الدينامية في palmitoylation.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> IGEPAL CA-630 </td><td> سيجما </td><td> I8896 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fluka </td><td> 93482 </td><td></td></tr><tr><td> البروتيني المانع كوكتيل </td><td> روش البسيطة كاملة </td><td> 11 836 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> NEM </td><td> سيجما </td><td> E3876 </td><td></td></tr><tr><td> HAM الحل </td><td> سيجما </td><td> 46780-4 </td><td></td></tr><tr><td> BCA عدة البروتين الفحص </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 23225 </td><td> ضمان التوافق مع المنظفات اختيار </td></tr><tr><td> الخرز البروتين sepharose و G / A-المغلفة </td><td> GE للرعاية الصحية </td><td> 17-6002-35 </td><td></td></tr><tr><td> البيوتين-BMCC </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 21900 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-HRP </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 21126 </td><td> إعادة في 1 ملغ / مل في الماء </td></tr><tr><td> لطخة ويسترن الاحتياطي تجريد </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 21059 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of protein palmitoylation in cultured hippocampal neurons by immunoprecipitation and acyl-biotin exchange (abe)

Palmitoylation هو تعديل المادة الدهنية في مرحلة ما بعد متعدية ينطوي على إلحاق حمض الكربون 16-الدهنية المشبعة، بالميتات، إلى بقايا السيستين من البروتينات الركيزة من خلال السندات thioester عطوب [مشاركة في 1]. Palmitoylation من البروتين يزيد hydrophobicity الركيزة لها، ويسهل عادة الاتجار تجاه الأغشية الخلوية. وقد أظهرت الدراسات الحديثة palmitoylation ليكون واحدا من التعديلات الدهون الأكثر شيوعا في الخلايا العصبية 1، 2، مما يدل على أن معدل دوران بالميتات هو آلية هامة من هذه الخلايا التي تنظم الاتجار واستهداف البروتينات. يمكن تحديد والكشف عن ركائز palmitoylated تحسين فهمنا لذلك الاتجار البروتين في الخلايا العصبية. وقد تم الكشف عن بروتين palmitoylation أعاقت في الماضي من الناحية الفنية نظرا لعدم وجود توافق في الآراء بين تسلسل بروتينات الركيزة، والاعتماد على الأيض labeliنانوغرام من بالميتويل-البروتينات مع 3 H-بالميتات، ومقايسة البيوكيميائية تستغرق وقتا طويلا مع انخفاض الحساسية. تطوير فحص الأسيل، البيوتين (ABE) تبادل تمكن أكثر سرعة وحساسية عالية الكشف البروتينات palmitoylated 2-4، وهو الأمثل لقياس دوران ديناميكية بالميتات على البروتينات العصبية. وتتألف الفحص ABE من ثلاث خطوات البيوكيميائية (الشكل 1): 1) الحصار لا رجعة فيه معدلة المجموعات ثيول السيستين باستخدام N-ethylmaliemide (NEM)، 2) الانقسام محددة وإماطة اللثام عن مجموعة السيستين palmitoylated في ثيول من هيدروكسيل (HAM)، و 3) وضع العلامات الانتقائي للالسيستين palmitoylated باستخدام كاشف biotinylation ثيول التفاعل، البيوتين، BMCC. تنقية البروتينات المعقدة البيروكسيديز ثيول-باتباع الخطوات ABE واختلف، وهذا يتوقف على الهدف العام المتمثل في التجربة. هنا، نحن تصف طريقة لتنقية بروتين palmitoylated الاهتمام الأساسي hippocampالخلايا العصبية من قبل شركة مناعي الأولية (IP) الخاص خطوة جسم مضاد ضد البروتين، يليه فحص ABE والغربية النشاف لقياس مستويات palmitoylation مباشرة من هذا البروتين، الذي يسمى الفحص IP-ABE. تم منخفض الكثافة الثقافات من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران الجنينية المستخدمة على نطاق واسع لدراسة الترجمة، وظيفة، والاتجار بها البروتينات العصبية، مما يجعلها مناسبة بشكل مثالي لدراسة الخلايا العصبية باستخدام البروتين palmitoylation الفحص IP-ABE. الفحص IP-ABE يتطلب أساسا IP القياسية والكواشف الغربية النشاف، ويقتصر فقط من قبل توافر أجسام مضادة ضد الركيزة الهدف. يمكن بسهولة أن تتكيف هذا الفحص للكشف عن وتنقية البروتينات palmitoylated بالنقل في مزارع الخلايا مغاير والثقافات العصبية الأولية المستمدة من مختلف أنسجة المخ كل من الماوس والفئران، وحتى الابتدائية أنسجة المخ نفسها.

الفحص IP-ABE يكشف تحديدا ثيول-palmitoylation من بقايا السيستين على طول الركيزة البروتينات، ويمكن أن تستخدم لكشف palmitoylation من البروتينات العصبية immunoprecipitated بطريقة المبين في الشكل 1. العلاج من البروتين في الخلايا العصبية immunoprecipitated مع HAM (الشكل 1) يشق الربط بين thioester بالميتات ومجموعة السيستين في ثيول، مما يسمح لإدراجها محددة من البيوتين-BMCC على مجموعة ثيول المتاحة حديثا، والتي يمكن بعد ذلك يتم الكشف عن النشاف باستخدام الغربية. هذا الإغفال من الانقسام (ناقص HAM) HAM يمنع إدراج البيوتين-BMCC وظائف كعنصر تحكم سلبية على biotinylation محددة، بالميتويل من العينة زائد HAM، وبالتالي يجب دائما أن تدار المتاخمة للعينة زائد HAM لغربي النشاف بواسطة SDS-PAGE (الشكل 2). في تجربة الأمثل (الشكل 2A)، وpalmitoylationويمكن الإشارة من الخلايا العصبية catenin-δ البروتين 2 الكشف عن النشاف بسهولة من قبل لالبيوتين-BMCC بتركيز من 1 ميكرومتر، وذلك باستخدام streptavidin مترافق مع HRP، ضد موازية عينات ناقص وزائد HAM. إشارة محددة لpalmitoylation catenin-δ يظهر في حجمه وتوقع من 160kD، فقط في العينة زائد HAM. وأكد على خصوصية هذه الإشارة من قبل reprobing لcatenin-δ مع الأجسام المضادة المحددة التي تم استخدامها في البداية لأنها immunoprecipitate، مما أدى إلى إشارة في كل من العلاجات HAM في نفس الحجم المتوقع. وتعظيم الاستفادة من مقايسة IP-ABE (الشكل 2A) يؤدي إلى الملف الشخصي غرب النشاف لعينة ناقص HAM أن تكون مميزة بسهولة من العينة زائد HAM، ويسلك الحد الأدنى من عدم وجود إشارة palmitoylation. تركيز من البيوتين-BMCC تستخدم لتسمية cysteines palmitoylated يتطلب التحسين دقيق، وإذا كان تركيز تشبع فائقة من ثنائيةوسوف يتم استخدام otin-BMCC خلال الخطوات الكيمياء ABE (الشكل 2B)، الخلفية المفرطة وإشارات غير محددة تكون مرئية. A منحنى استجابة خطية لbiotinylation من البروتين العصبية palmitoylated، وعلى α7 مستقبلات أستيل النيكوتين، وذلك باستخدام البيوتين-BMCC قد سبق تحديدها 6، ويظهر بالقرب من التشبع الكامل في تركيز ميكرومتر 5-10. على الرغم من أن تركيز الأمثل للالبيوتين-BMCC سوف تنحرف قليلا اعتمادا على البروتين الهدف العصبية، والعلاج مع البيوتين-BMCC بتركيز أكثر من 5 ميكرومتر المرجح فائقة تشبع البروتين الهدف، والنتيجة في الملف الشخصي لطخة غربية مع خلفية واضحة وإشارات غير محددة. كانت تستخدم سابقا A بتركيز 0.5 ميكرومتر لالبيوتين-BMCC للكشف عن البروتينات palmitoylation العصبية الأخرى بما في ذلك 25-SNAP، huntingtin، مفارز مستقبلات أمبا GluA1 وGluA2، وparalemmin 8، وتحديد تركيز الأمثل لروايةويمكن تحقيق الهدف البروتين عن طريق التجربة والخطأ في عالم الأزياء الخطية، بدءا ضمن مجموعة من 0،5-5 ميكرومتر التي وصفنا هنا. الناتج طخة غربية الملامح streptavidin بين عينات ناقص وزائد HAM-δ لل-catenin palmitoylation تظهر مشابهة عندما تعامل مع 4 ميكرومتر البيوتين-BMCC (الشكل 2B)، مع إشارات إضافية في الخلفية أحجام مختلفة، مما يدل على أن biotinylation غير لائق حدث. هيدروكسيل هو عامل قوي الحد الذي يؤدي إلى تدهور محدودة من البروتين المستهدف بالإضافة إلى الانقسام بكفاءة الربط thioester. وبناء على ذلك، والتحسين الكيمياء ABE يتطلب واحد لتطبيع كمية البروتين immunoprecipitated المستخدمة في عينات ناقص وزائد HAM-(الخطوات 3،2 حتي 3،3). التطبيع يتطلب استخدام كمية مضاعفة من البروتين الهدف يجمد في مقابل عينة زائد ناقص HAM، والذي ينتج في الواقع في تمييزه يغربن النشاف لمحات عن البروتين الهدف، كما هو موضح لcatenin-δ (الشكل 2A، B). ومع ذلك، إذا لم يتم تطبيع كمية البروتين الهدف يجمد بين عينات ناقص وزائد HAM-، يمكن فقدان إشارة الناتجة طخة غربية لهدف البروتين في العينة زائد HAM، كما هو موضح لcatenin-δ عندما كميات متساوية من واستخدمت علاجات البروتين في كل من HAM (الشكل 2C). خصوصية الكيمياء ABE لوصفها البروتينات palmitoylated حساس جدا ويتطلب التحسين. المخاطر المشتركة التي ووجهت خلال فحص IP-ABE إدراج نتائج دون المستوى الأمثل هو مبين في 2B 2C والأرقام، وتدهور البروتين الهدف، بغض النظر عن العلاج HAM، والتي عادة تنتج من أقدم الكواشف ومخازن، ودرجة الحموضة غير صحيحة. من أجل تجنب هذه المزالق وتصحيح للكيمياء ABE دون المستوى الأمثل، ونضارة وتركيز الكواشف اللازمة لوينبغي دائما مخازن المدرجة في الجدول 1 أن تدرس، ويجب دائما التعديلات الرقم الهيدروجيني للجميع مخازن يتم التحقق قبل إلى تشغيل التجربة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> العازلة </td><td> العمل تركيز </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> العازلة تحلل (LB) </td><td> في O 2 H المقطر: 1٪ IGEPAL CA-630 50MM تريس، حمض الهيدروكلوريك كلوريد الصوديوم 150mM pH7.5 الجلسرين 10٪ </td><td> N / A </td><td> إعداد قبل التجربة وتخزينها في 4 درجات مئوية </td></tr><tr><td> NEM الحل </td><td> في EtOH 100٪: مسحوق مجفف بالتجميد NEM </td><td> 2 M </td><td> إعداد جديدة، وذلك مباشرة قبل الاستعمال. </td></tr><tr><td> صرامة العازلة </td><td> في LB: 10 مم 0.1٪ SDS MEM </td><td> N / A </td><td> قبل وقت قصير من إعداد استخدام، والحفاظ على الجليد. </td></tr><tr><td> الرقم الهيدروجيني 7،2 LB </td><td> في LB: ضبط PH إلى 7.2 بالضبط </td><td> N / A </td><td> استخدام الرقم الهيدروجيني متر لضبط درجة الحموضة مباشرة قبل الاستخدام. </td></tr><tr><td> HAM العازلة </td><td> في الرقم الهيدروجيني LB 7.2: ألبوم الحل HAM </td><td> 1 M (تركيز النهائي HAM) </td><td> إعداد فورا قبل الاستخدام. </td></tr><tr><td> LB الرقم الهيدروجيني 6،2 </td><td> في LB: ضبط درجة الحموضة إلى 6.2 بالضبط </td><td> N / A </td><td> نفس الرقم الهيدروجيني للLB 7،2 </td></tr><tr><td> الأسهم البيوتين-BMCC الحل </td><td> في DMSO: 2.1 ملغ البيوتين-BMCC الحل </td><td> 8 مم </td><td> إعداد فورا قبل الاستخدام. </td></tr><tr><td> البيوتين-BMCC العازلة </td><td> في الرقم الهيدروجيني LB 6.2: إضافة البيوتين-BMCC الحل </td><td> 1 حتي 5 ميكرومتر (البيوتين النهائية-BMCC التركيز) </td><td> إعداد فورا قبل الاستخدام. </td></tr><tr><td> 2<html> X العازلة عينة SDS، لا الاختزال </td><td> في O 2 H المقطر: 5٪ 5٪ SDS الجلسرين 125mM تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 0.01٪ زرقة البروموفينول </td><td> N / A </td><td> إعداد قبل التجربة، وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. تكملة مع DTT 5 مم قبل الاستخدام. </td></tr></tbody></table> الجدول 1. يمكن إعداد مخازن والكواشف اللازمة لفحص IP-ABE. العديد من مخازن تحلل قبل بدء التجربة، ولكن يجب فحص درجة الحموضة وتعديلها على الفور قبل استخدامه مع عداد الرقم الهيدروجيني، لضمان نجاح الكيمياء ABE. وينبغي إعداد غالبية الأسهم حلول جديدة لكل تجربة، مباشرة قبل الاستخدام. العديد من المخازن المؤقتة تتطلب الكواشف الشائعة في معظم المختبرات المجهزة لالكيمياء الحيوية، ويتم سرد المعلومات مع التخصص الكواشف بائع في جدول الكواشف والمعدات. الصفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1.jpg" alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1highres.jpg" /> الشكل 1. وهي lysed التخطيطي للمناعي والأسيل، البيوتين صرف مقايسة (IP-ABE) لتنقية وكشف palmitoylation من البروتينات العصبية. مثقف الخلايا العصبية قرن آمون، (1) يتم تنقيته ثم بروتين الهدف باستخدام الأجسام المضادة هدف محدد، وثبتوا على sepharose و حبات المغلفة مع البروتين G أو A. والبروتين الهدف هو تنقية ثم (2) تعامل مع N-ethylmaliemide (NEM) لربط بشكل لا رجعة فيه وكتلة الأحرار ثيول (-SH) مجموعات على طول cysteines معدلة (C). وبعد ذلك البروتين الهدف (3) تعرض لمعاملة مع هيدروكسيل (HAM)، مما أدى إلى انشقاق محددة من السندات thioester في cysteines palmitoylated وإماطة اللثام عن مجموعة ثيول palmitoylated مجانا (-SH). المقبل، والهدف هو البروتين (4) treateد مع جزيء البيوتين ثيول التفاعل، البيوتين، BMCC، مما أدى إلى biotinylation محددة من السيستين palmitoylated. وأخيرا، (5) ومزال البروتين الهدف المعقدة البيروكسيديز وإزالتها من الأجسام المضادة وحبة. البروتين الهدف مع السيستين في palmitoylated (ق) الموسومة مع البيوتين الآن مناسبة لهلام الكهربائي SDS بولي الأكريلاميد (SDS-PAGE)، والغربية النشاف مع streptavidin للكشف عن palmitoylation من البروتين في الخلايا العصبية تنقيته. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig1large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2.jpg" alt="الشكل 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2highres.jpg"/> الشكل 2. الكشف عن palmitoylation من catenin-δ البروتين الخلايا العصبية باستخدام مقايسة IP-ABE. كانت تزرع الخلايا العصبية قرن آمون الفئران ما قبل الابتدائيوصف viously 5، في مناطق ذات كثافة من 130 خلية / مم 2 حتى النضج في 14DIV، هي lysed ذلك الحين، وتخضع لفحص IP-ABE للكشف عن palmitoylation من ركيزة حددت مؤخرا العصبية palmitoylated، وδ-catenin 2. المنقى immunoprecipitates (آي بي إس) من catenin-δ (البروتين الهدف) تم عزل باستخدام 5 ميكروغرام من الأجسام المضادة δ-catenin لكل عينة (المختبرات تنبيغ BD)، وتعرضوا بعد ذلك لSDS-PAGE بالتوازي ناقص وزائد هيدروكسيل (HAM) العينات. تم الكشف عن Palmitoylation من غرب النشاف (WB) مع streptavidin-HRP (palmitoylation)، وجردت الغشاء وتعرض لWB-catenin reprobe لδ. (أ) ممثل الأمثل IP-ABE نتيجة لpalmitoylated catenin-δ (رأس السهم) تعامل مع البيوتين 1 ميكرومتر، BMCC، مما يدل على خصوصية للكشف عن الكيمياء ABE ثيول-palmitoylated البروتينات من العينات IP. (B) A الدعوة موجهة دون المستوى الأمثلsentative IP-ABE نتيجة لcatenin-δ، حيث تم استخدام تركيز الزائدة من 4 ميكرومتر البيوتين-BMCC، مما أدى إلى إشارات غير محددة والخلفية في كل من عينات ناقص وزائد HAM-(السهام). (C) لم تطبيع ممثل آخر دون المستوى الأمثل IP-WB ABE لcatenin-δ، حيث تم استخدام المفرط تركيز ميكرومتر 4 من البيوتين-BMCC، وكمية البروتين المستخدم لهذا النموذج IP زائد HAM لبوساطة HAM تدهور البروتين، مما أدى إلى فقدان إشارة في الضفة الغربية reprobe لcatenin-δ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig2large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE at JoVE.com

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

إضافة إلى عكسها من بالميتات البروتينات مهم المنظم الاتجار البروتين داخل الخلايا. هذا هو موضع اهتمام خاص في الخلايا العصبية حيث يتم palmitoylated البروتينات متشابك كثيرة. نحن نستخدم طريقة بسيطة للكشف عن البروتينات الحيوية palmitoylated في الخلايا العصبية مثقف، والتي يمكن تكييفها لأنواع الخلايا والأنسجة المتعدد.

الكشف عن بروتين Palmitoylation في الخلايا العصبية قرن آمون بواسطة مثقف مناعي والبورصات الأسيل، البيوتين (آبي)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

detection-protein-palmitoylation-cultured-hippocampal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

35.2K Views.  University of British Columbia. إضافة إلى عكسها من بالميتات البروتينات مهم المنظم الاتجار البروتين داخل الخلايا. هذا هو موضع اهتمام خاص في الخلايا العصبية حيث يتم palmitoylated البروتينات متشابك كثيرة. نحن نستخدم طريقة بسيطة للكشف عن البروتينات الحيوية palmitoylated في الخلايا العصبية مثقف، والتي يمكن ت?...

Video: Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection والثقافة الأولية من الخلايا العصبية الجنينية الماوس الحصين والقشرية

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

مضان الانتعاش بعد Photobleaching (FRAP) من البروتينات المرتبطة دلاليا الإسفار في العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الحصين مثقف

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

تعديل العمليات العصبية والنقل الميتوكوندريا : تصوير مباشر في الخلايا العصبية الحصين خلال فترات طويلة

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

تحليل الصرف العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي لؤلؤ

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

حفز النمو في الخلايا العصبية شجيري متعاطف مثقف

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران قبل الولادة

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

يعاير الحمض النووي من التلف في الخلايا العصبية قرن آمون باستخدام مقايسة المذنب

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين الابتدائية

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

مضان وتلألؤ بيولوجي التصوير من التحت خلوية كا<sup&gt; 2+</sup&gt; في المسنين الحصين الخلايا العصبية

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.