Acyl-الراتنج ساعد التقاط أو ACYL-RAC هو طريقة حساسة وموثوق بها التي يمكن استخدامها للكشف عن البروتين S-acylation في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية. هذا البروتوكول يتجاوز بعض القيود المفروضة على وضع العلامات الأيضية ووضع العلامات الراديو، ويسمح الكشف في وقت واحد من S-acylation من البروتينات المتعددة. ليس فقط الخلايا الحية ولكن أيضا الأنسجة الأولية والعينات المجمدة.
يمكن أن تنظم S-acylation مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية مثل الاتجار بالبروتين، واستهداف غشاء البلازما، ونقل الإشارة، ونقل الحديد، والتفاعلات البروتينية البروتينية. من المهم استخدام محلول هيدروكسيلامين الطازج مع الرقم الH المعدل بعناية لكل تجربة لضمان شق فعال ومحدد للسندات thioester. مع مظاهرة من هذه الطريقة انها حاسمة لخطوات مثل الكلوروفورم، الميثانول هطول الأمطار.
وينبغي أن تكون بيليه شكل فطيرة التي تم الحصول عليها خلال هذه الخطوة التعامل بعناية فائقة. يمكن أن يكون هشا وفقدان جزئي للعينة خلال خطوة يمكن أن يؤدي إلى انتعاش العينة متفاوتة. إثبات الإجراء سيكون سافانا ويست، طالبة دراسات عليا من مختبرنا.
للحصول على الخلايا، وجمع الخلايا ذات الاهتمام في أنبوب الطرد المركزي المخروطي. وإزالة أي حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي. غسل بيليه في 5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
وعلى الفور إعادة تثبيت الخلايا في 600 microliters من عازلة التحلل أعدت حديثا. تهيج العينة في 1,500 الثورات في الدقيقة الواحدة في شاكر الحرارة لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. قبل تطهير الليساتيات، بيليه المنظفات والمواد القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي.
في نهاية الطرد المركزي، وجمع lysate مسح في ما قبل تبريد 1.5 ملليلتر microcentuge أنبوب على الجليد. وإجراء برادفورد أو bicinchoninic حمض المقايسة لتقدير تركيز البروتين وفقا للبروتوكولات القياسية. إضافة الميثانول والكلوروفورم إلى lysate في نسبة 2:1.
هز بقوة لخلق تعليق متجانسة والطرد المركزي عينة لجمع بيليه البروتين في واجهة بين مراحل مائي وعضوية. إمالة الأنبوب، واستخدام إبرة أو هلام تحميل تلميح لpirate أكبر قدر ممكن من المذيبات. الهواء يجف بيليه البروتين لبضع دقائق.
قبل خلط محتويات الأنبوب بلطف مع 600 ميكرولترات من الميثانول ، مع الحرص على عدم تفتيت بيليه. بعد إزالة بعناية غسل الميثانول، وتجفيف بيليه البروتين على أعلى مقاعد البدلاء لمدة خمس دقائق تقريبا. المقبل، resuspend بيليه البروتين في 200 ميكروليتر من 2SHB العازلة.
ودوة في 42 درجة مئوية و 1,500 الثورات في الدقيقة في شاكر الحرارة. عندما يتم حل بيليه، إضافة 200 ميكرولترات من 0.2٪ MMTS في 2SHB إلى العينة. واحتضان البروتين لمدة 15 دقيقة في 42 درجة مئوية و 1500 الثورات في الدقيقة الواحدة في شاكر الحرارة.
في نهاية الحضانة، أداء 3:4 ترسيبات الميثانول الكلوروفورم كما هو موضح. لإزالة MMTS، حل بيليه في 100 ميكرولترات من 2SHB العازلة الطازجة مع دوامة. وتمييع العينة مع 300 ميكرولترات من العازلة A بعد كل هطول الأمطار.
بعد هطول الأمطار النهائي، حل العينات في 200 ميكرولترات من 2SHB العازلة وتمييع مع 240 ميكرولترات من العازلة A.Measure تركيز البروتين مرة أخرى وتوضع جانبا 40 ميكرولترات من كل عينة والضوابط المدخلات. تقسيم العينات إلى اثنين من وحدات التخزين متساوية من 200 ميكرولترات. ووضع علامة على الأنابيب بالإضافة إلى الهيدروكسيلين وناقص الهيدروكسيلين.
إضافة 50 ميكروليترات من إعداد حديثا محايدة اثنين من الهيدروكسيل أمين المولار إلى تركيز نهائي من 400 ملليمولار إلى أنبوب الهيدروكسيلين زائد. و50 ميكرولترات من كلوريد الصوديوم الولياري المحايد إلى التحكم السلبي، أنبوب الهيدروكسيلامين ناقص. ثم إضافة 30 microliters من الطين حبة TS إلى كل أنبوب.
وتدوير الأنابيب لمدة ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة غسل الخرز أربع مرات مع 1٪ SDS في العازلة A لإزالة أي الهيدروكسيلامين المتبقية. بعد الغسيل الأخير، قم بغسل كل عينات الخرز بثلاثة عمليات طرد دقيقة صغيرة لطيفة.
الطامح بعناية سراويل و resuspending الخرز في 500 ميكرولترات من 1٪ SDS في العازلة A في كل غسل. بعد الغسيل الأخير، تدور بلطف أسفل الخرز كما هو موضح. ويُفطّن أكبر قدر ممكن من الافرائب دون إزعاج الخرز.
لاستعادة البروتينات من الخرز، إضافة 50 ميكرولترات من 4٪ SDS عينة العازلة لكل أنبوب واحتضان العينات في 80 درجة مئوية و 1،500 الثورات في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في شاكر الحرارة. في نهاية الحضانة، والسماح للعينات تبرد قبل الطرد المركزي إلى بيليه تماما الخرز. ثم استخدم تلميح تحميل الجل لنقل البروتينات المائلة إلى أنابيب جديدة 1.5 ملليلتر.
وتشغيل العينات على هلام SDS-PAGE لتحليل S-acylation من البروتينات ذات الأهمية من قبل النشاف الغربية. يمكن الكشف عن التيروزين كيناز Lck في lysates تعامل مع محايدة اثنين من الهيدروكسيلامين المولار. لشق السندات thioester بين بقايا السيستين والحمض الدهني moiety.
Stripping وإعادة استخدام الأجسام المضادة ضد البروتينات Fyn وLAT تثبت أن acyl-resin ساعد في التقاط المقايسة يمكن استخدامها لتحليل S-acylation من البروتينات المتعددة في نفس الوقت. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة الكشف عن S-acylation من Lck، فين، وLAT في splenocytes الماوس الأساسي. يشير إلى أن هذا التعديل يتم حفظه بين نوعين.
بالإضافة إلى تحديد رواية S-acylated البروتينات، ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتقييم التغيرات في البروتين S-acylation تحت ظروف بيولوجية مختلفة. وقد زاد عدد البروتينات S-acylated التي تم تحديدها حديثًا بشكل كبير بعد أن كان الضعف يعني تقنية سريعة وموثوقة مثل Acyl-RAC. بالإضافة إلى تحديد رواية S-acylated البروتينات، ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتقييم التغيرات في البروتين S-acylation تحت ظروف بيولوجية مختلفة.
