الخلايا الجذعية العضلية لا تزال مرتبطة مع مكانة الذاتية ويمكن التلاعب بها بسهولة، على سبيل المثال، من خلال العدوى سيرنا. هذه الطريقة تجعل من الممكن تحليل الخلايا الجذعية العضلية في الثقافة في وضع يشبه الوضع في الجسم الحي بشكل أوثق من نماذج الثقافة 2D القياسية من خلال الحفاظ على مكانة. تبدأ بقطع ماصة المبستر العقيمة مع قلم الماس.
لكل فأر، استخدم ماصة كبيرة مع فتحة حوالي 0.3 سنتيمتر وطول حوالي 10 إلى 12 سنتيمترا وماصة زجاجية ثانية مع فتحة صغيرة تبلغ حوالي 0.1 سنتيمتر وطولها حوالي 22 سنتيمترا. تنعيم حواف كل من ماصة عن طريق عقد نصائح ماصة في لهب الموقد بونسن لمدة خمس إلى 10 ثوان مع حركة لطيف. قبل الاستخدام مباشرة، قم بتغليف كل من المواسير بمصل الحصان العقيم عن طريق ملء المصصة بأكملها بمليلترين من مصل الحصان لمدة خمس دقائق، ثم حقن مصل الحصان والسماح للمصاطب بالجفاف لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
رش جميع المعدات والأطراف الخلفية للفأر مع 70٪ الإيثانول. استخدام المقص المنحني غرامة تصلب والمملقط الدقيق لإزالة الجلد وفضح العضلات الكامنة. إزالة اللفافة المحيطة بها مع ملقط منحني غرامة دون الإضرار العضلات الكامنة.
لإزالة الساق الأمامي أو TA، والاستيلاء على وتر TA البعيدة مع ملقط وقطع عليه مع مقص غرامة. في حين عقد TA في وتر, سحبه نحو الركبة وقطع العضلات على مقربة من الركبة لفضح عضلة EDL. رفع وتر EDL البعيدة مع ملقط منحني وقطع مع مقص الربيع فاناس غرامة.
فضح وتر EDL القريبة عن طريق سحب بعناية EDL نحو الركبة. ثم قطع وتر قريب مع مقص. احتضان عضلات EDL في أنبوب رد الفعل في 37 درجة مئوية في حمام مائي متداول.
وقف الهضم عندما تخفف العضلات وألياف ميل واحد مرئية. العمل تحت المجهر مناظير معقمة مجهزة لوحة التدفئة مسح العضلات مع وسيلة العزل الدافئة باستخدام ماصة كبيرة تتحمل. فصل العضلات مع ماصة كبيرة تتحمل حتى العدد المطلوب من الألياف العضلية تطفو بحرية في الحل.
لغسل الحطام، استخدم ماصة زجاجية صغيرة تحمل لنقل الألياف العضلية غير المتعاقد عليها إلى البئر الثاني مليئة وسيط العزل. ثم نقل 50 إلى 100 الألياف العضلية غير المتعاقد عليها إلى بئر واحد من لوحة بئر 24 مليئة المتوسطة ثقافة الألياف العضلية. احتضان الألياف العضلية في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 إلى 96 ساعة.
ربط الألياف العضلية عبر البراز الخلايا الجذعية العضلية بعد أربع ساعات من عزلة الألياف العضلية. الجمع بين 25 ميكرولتر من Opti-MEM مع حجم كل من سيرنا مع 25 ميكرولتر أوبتي-MEM تحتوي على 1.5 ميكرولتر من كاشف العدوى. احتضان مزيج رد الفعل لمدة خمس دقائق وإضافته إلى الخلايا في لوحة بئر 24.
ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لاحترام الوقت. يتم إظهار الخطوات الحاسمة فقط من بروتوكول تلطيخ المناعةfluorescent هنا. بعناية، تجاهل المتوسط ثقافة الألياف العضلية مع ترك بعض الحل في البئر.
إضافة 500 ميكرولتر من 2٪ paraformaldehyde لإصلاح الألياف العضلية مع الخلايا الجذعية العضلية المجاورة لها. احتضان لوحة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatant بعناية وغسل الألياف العضلية ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
قم بتغطية الطبق بالتنفويل أثناء خطوات الحضانة بعد الحضانة بأجسام مضادة ثانوية. استخدام قلم مسعور لرسم دائرة على شريحة زجاجية مجهرية. ثم نقل الألياف العضلية في أصغر حجم ممكن إلى الشريحة وتفريقها.
إزالة السائل المتبقي مع ماصة المبستر الصغيرة تتحمل أو ماصة 200 ميكرولتر. استخدام قطرتين من المتوسط تصاعد مائي وتغطية الألياف العضلية مع زلة غطاء. ثم السماح للشرائح لتجف وتخزينها في أربع درجات مئوية في الظلام تليها التحليل المجهري.
يوضح هذا البروتوكول اشتقاق وثقافة الألياف العضلية المفردة من عضلات مورين EDL. تم استخدام تلطيخ immunofluorescent لPax7 لتحديد نواة الخلايا الجذعية العضلية. تعرض المنطقة المكبرة الألياف العضلية بالخلية الجذعية العضلية المجاورة لها وتوضح إشارة الفلورة المناعية PAX7 في نواة الخلايا الجذعية العضلية.
يمكن تحليل تطور الخلايا الجذعية العضلية myogenic عن طريق التعبير عن علامة. ويرتبط وجود Pax7 وعدم وجود التعبير عن الميود مع الخلايا الجذعية العضلية هادئة من الألياف العضلية المعزولة حديثا. يمكن ملاحظة تعبير الميود في الخلايا الجذعية العضلية المنتشرة.
بعد 72 ساعة، تشكل الخلايا الجذعية العضلية مجموعات من الذرى مع حالات عضلية مختلفة، والتي توازيها التعبير عن علامات الميوجينية المختلفة. الخلايا Pax7 فقط هي الخلايا الجذعية ذاتية التجديد. Pax7 و MyoD خلايا إيجابية مزدوجة تتكاثر.
في حين أن الخلايا فقط ميو D هي الخلايا المتمايزة. أظهر نقل الحمض النووي الريبي للخلايا الجذعية العضلية تراكم السيتوبلازمي سيرنا بطريقة محببة مما يشير إلى امتصاص فعال. كشف القياس الكمي للخلايا الإيجابية باكس7 المصابة لكل ألياف عضلية أن عدد الخلايا المصابة زاد بنسبة تصل إلى 74٪ بعد 30 ساعة دون أي تأثير سلبي على أرقام الخلايا الجذعية العضلية.
عند محاولة هذا البروتوكول، من الأهمية بمكان تشريح EDL بعناية دون التسبب في أي ضرر. بالإضافة إلى إعادة إصابة سيرنا، يمكن تحليل الحيوانات المعدلة وراثيا أو الحضانة بالبروتينات المؤتلفة لإجراء المزيد من التحليلات الوظيفية للخلايا الجذعية العضلية على ألياف الميوفيبر المجاورة لها.
