توجد العديد من البروتوكولات لعزل myofibers واحد من عضلات الهيكل العظمي للفئران البالغة. تم وضع بروتوكول لدينا للفئران الصغيرة جدا وللفئران الصغيرة مع myofibers هشة جدا. يمكن استخدام هذا الإجراء الموحد لدراسة الخلايا الجذعية العضلية بمساعدة myofiber خلال تطوير ما بعد الولادة أو في نماذج الماوس للأمراض التي تجعل myofibers عرضة بشكل خاص للإجهاد الميكانيكي.
سيتم إثبات هذا الإجراء من قبل غلوريا بيغولي، طالبة الدكتوراه، وفيديريكا لوسيني، وهي طالبة ما بعد الدكتوراه، وكلاهما من مختبر. لتشريح العضلات والحصاد، واستخدام دبوس لإصلاح طرف واحد الخلفي من القتل الرحيم، فأرة صغيرة جدا أو صغيرة جدا على لوحة تشريح، واستخدام ملاقط حادة لرفع الوتر السفلي من tibialis الأمامي إلى ارتفاع الكاحل. قطع وتر واستخدام مقص غرامة لقطع كل وسيلة حول العضلات إلى وتر على مستوى الرضفة.
وضع العضلات في أنبوب من حل الهضم ورفع الوتر السفلي من الاكسونتوروم لونجوس، وسحب بلطف إلى أعلى على وتر لفصل الاكستينوروم مُمَسَع من العضلات الأخرى. قطع وحصاد العضلات. تدوير الساق لعرض عضلات الظهر ورفع وتر أخيل.
سوف تُفصل عضلة المعدة تلقائيًا عن العضلات الأخرى. قطع الوتر العلوي في الجزء الخلفي من الرضفة ووضع العضلات في حل الهضم. ارفع الوتر الخارجي للساق ولف الملاقط تحت الوتر لفصل الوتر بلطف عن العضلة.
ثم، قطع لحصاد العضلات وجمع نفس العضلات من الساق الأخرى بنفس الطريقة. عندما يتم جمع جميع العضلات، ضع أنبوب الجمع في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 45 إلى 50 دقيقة وعكس الأنبوب بقوة 10 مرات كل 10 دقائق. عندما تبدأ العضلات في تخفيف و myofibers تصبح مرئية، يهز العينات مرة أخيرة قبل نقل بعناية تعليق الهضم في قبل تدفئة أو مصل طبق بيتري المغلفة 100 ملليمتر تحتوي على 10 ملليلتر من محلول الغسيل.
لعزل myofibers واحد، ووضع الطبق تحت مجهر تشريح واستخدام مصل الحصان المغلفة 200 ميكرولتر تلميح ماصة لاختيار بعيدا ألياف العضلات الفردية. نقل myofibers قابلة للحياة في مصل الحصان المغلفة 35 ملليمتر طبق بيتري تحتوي على خمسة ملليلتر من محلول الغسيل قبل الدافئة. عندما تم جمع كل من myofibers قابلة للحياة ، وتكف عينات myofiber في حاضنة ثقافة الخلية لمدة خمس دقائق.
إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من myofibers، استخدم ماصة زجاجية كبيرة الحجم لتثرية عينة الأنسجة العضلية المتبقية حتى يتم تحرير ألياف إضافية ميكانيكياً. عندما تم جمع ما يكفي من myofibers ، ضع الطبق في حاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعة واحدة لفترة توازن إضافية. في نهاية الحضانة، نقل myofibers الفردية إلى جديد، قبل تدفئة طبق مصل الحصان المغلفة التي تحتوي على المتوسطة الثقافة المناسبة وإعادة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية.
لتحليل مناعي من myofibers، بعد ربط عبر، وإزالة جميع ولكن بما فيه الكفاية فائقة، وليس لإزالة أي ألياف وإضافة إلى نفس أنبوب ملليلتر واحد من 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لاحتضان لمدة خمس دقائق مع الانفعالات لطيف. في نهاية الحضانة ، والسماح للألياف لتسوية لمدة خمس دقائق قبل استبدال عظمى مع 1.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. بعد خمس دقائق من الانفعالات اللطيفة ، اسمح للألياف بتسوية خمس دقائق أخرى قبل استبدال الماظر بمحلول الحجب.
بعد ساعة واحدة من الانفعالات اللطيفة، استبدل محلول الحجب بحل حظر جديد يحتوي على أجسام مضادة أولية ذات أهمية لاحتضان ليلي عند أربع درجات مئوية مع هياج لطيف. في صباح اليوم التالي، وغسل الألياف مع ثلاثة يغسل لمدة خمس دقائق في ملليلتر واحد من 0.25٪ Tween 20 في برنامج تلفزيوني باستخدام التحريض لطيف وخمس دقائق من الترسيب في درجة حرارة الغرفة للغسيل. بعد الغسيل الأخير ، قم بتسمية الألياف مع الأجسام المضادة الثانوية ذات الفلوروكروم المناسبة المخففة في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات اللطيفة ، المحمية من الضوء ، تليها ثلاثة غسلات في PBS بالإضافة إلى 0.1 ٪ Tween ، محمية من الضوء ، كما هو موضح.
بعد الغسيل الأخير، استبدل المابير بميليلتر واحد من محلول DAPI لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع تحريض لطيف، محمي من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل الألياف واستخدام ماصة محلول حظر المغلفة مع طرف قطع لجمع الألياف ونشر الألياف بعناية على شريحة زجاجية. ضع الشريحة تحت مجهر تشريح، وباستخدام الضوء الطبيعي الذي تعكسه المرآة فقط، استخدم رأس ماصات 200 ميكرولتر جديد لنشر الألياف وإزالة الحل الزائد.
بعد إزالة الحل الزائد، والسماح للشريحة لتجف في الظلام لمدة 10 إلى 15 دقيقة حتى يبقى حجم صغير جدا من الحل. ثم، إضافة حجم مناسب من المتوسطة المتصاعدة على الألياف قبل وضع بعناية زلة غطاء على الأنسجة. لاسترداد عدد كاف من الألياف الطويلة والقابلة للحياة التي يمكن أن تبقى 96 ساعة في عامل النمو المتوسطة الغنية، يتم حصادها عادة أربعة عضلات مختلفة وهضمها.
فقط الألياف الأكثر سليمة ينبغي نقلها إلى الوسط ثقافة. وينبغي التخلص من الألياف المكسورة وغيرها من الحطام. بعد 72 ساعة من الثقافة، تقوم خلايا القمر الصناعي المنشط بإنشاء مجاميع الخلايا المرتبطة بالميوفايبر.
نلاحظ أن ثقافة الخلية المستمدة من دلتا لامين ثمانية 11 الفئران السلبية المزدوجة تتشكل من قبل عدد أقل من الخلايا. بعد 96 ساعة، الخلايا الأقمار الصناعية هي التعبير عن MyoG، تصبح مرئية داخل الكتلة الخلية، والشروع في التمايز نحو myofibers جديدة. وتجدر الإشارة إلى أن ديناميات تأخر تمايز الخلايا الساتلية لوحظ في homozygous متحولة لين فئران خروج المغلوب بالمقارنة مع نظرائهم من النوع البرية.
تأكد من ممارسة خطوات تشريح العضلات كما حصاد العضلات سريعة ودقيقة أمر ضروري لنجاح التجربة. تسمح هذه التقنية بتتبع الخلايا الساتلية المفردة أثناء التنشيط والتمايز ، مما يسهل دراسة العمليات الرئيسية التي تقوم عليها نمو العضلات وتجديدها في ظل ظروف فسيولوجية مرضية مختلفة.
