فإن الكتاب أود أن أشكر اندريس سالازار (Oncovir، وشركة) للهدية من بولي ICLC.

1. العزلة والحفظ بالتبريد من PBMCs 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جو معقم و مطهر سنبلة واحدة من منافذ الوصول في كيس فصادة الكريات البيض باستخدام مجموعة نقل البلازما. باستخدام 60 مل حقنة، ونقل فصادة الكريات البيض التي تم الحصول عليها من المرضى إلى العقيمة 500 مل زجاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط مستوى الصوت من فصادة الكريات البيض إلى 2x حجمه الأصلي باستخدام درجة حرارة الغرفة RPMI. تخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج بلطف زجاجة من Ficoll-Paque PLUS. إضافة 12 مل Ficoll-PLUS Paque في العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف طبقة 30 مل من المنتج فصادة الكريات البيض المخفف إلى كل العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي يحتوي Ficoll. يجب الحرص على عدم تعكير صفو اجهة بين Ficoll وتعليق خلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1.3 و 1.4 حتى يتم الطبقات كل من فصادة الكريات البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي 50 مل أنابيب مخروطية في 1،000 × ز لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع عدم وجود الفرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد بعناية طبقة غائم من PBMCs من كل أنبوب وحوالةR إلى جديد معقم 50 مل أنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة RPMI إلى كل أنبوب إلى الحجم النهائي من 50 مل. المزيج بلطف بواسطة انقلاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 500 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية مع الفرامل الكاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة supernatants من كل أنبوب. Resuspend وكريات خلية من كل أنبوب وإضافة RPMI إلى الحجم النهائي من 50 مل. المزيج بلطف بواسطة انقلاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 500 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة supernatants من كل أنبوب. Resuspend وبركة معا في تعليق خلية واحدة إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبرزي حجم من PBMCs مجمعة تصل إلى 50 مل مع أكثر RPMI. المزيج بلطف بواسطة انقلاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف. Resuspend وبيليه الخلية في 50 مل RPMI. المزيج بلطف لضمان تعليق خلية موحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الخلايا وتحديد بقاء الخلية. حساب العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 300× ز لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. إعداد وسائل الإعلام التجميد. ويتكون سائل الإعلام تجميد 10٪ سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO؛ بيوتيك Miltenyi) في الإنسان AB مصل (وادي الطبية الحيوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف. resuspend الخلايا في تركيز النهائي من 2 × 10 8 خلية / مل في وسائل الإعلام تجميد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 1 مل aliquots في 1.8 مل cryovials. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل cryovials في الفريزر أسعار تسيطر عليها والبدء في تشغيل تجميد، برنامج 1. في نهاية المدى، ونقل على الفور الى cryovials المجمدة مرحلة البخار من الفريزر النيتروجين السائل. </li></ol> 2. اليوم 0: تمايز الخلايا الجذعية من حيدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30 مل من RPMI / بلازما ذاتي 1٪ إلى العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد مأخوذة من PBMCs المجمدة من قبل الإثارة لطيف في 37 ° C حمام الماء. عندما تحسنت تماما، نقل محتويات قارورة معقمة إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا لمدة 6 دقائقفي 500 × ز في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف و resuspend الخلايا مكعبات في حجم صغير من RPMI / بلازما ذاتي 1٪. ثم إضافة المزيد من RPMI / بلازما ذاتي 1٪ إلى الحجم النهائي من 50 مل. تخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى لمدة 6 دقائق في 500 × ز في درجة حرارة الغرفة. نضح طاف و resuspend بيليه في 50 مل RPMI / بلازما ذاتي 1٪. تخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الخلايا وتحديد بقاء الخلية. حساب العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 1.40 × 10 8 خلايا في 40 مل من RPMI / 1٪ البلازما ذاتي على 225 سم 2 EasyFlask. كرر حتى تم مطلي جميع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان EasyFlasks مسطح على جانبها ل1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة تحتوي على 5٪ CO 2 للسماح للحيدات التمسك القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما اكتمال الحضانة، وإزالة EasyFlask من الحاضنة، ويغسل مرتين لإزالة الخلايا غير ملتصقة USIنانوغرام 30 مل من prewarmed RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الثاني، إضافة 40 مل من RPMI / بلازما ذاتي 1٪ مع 400-1،000 وحدة دولية / مل IL-4 و 100-1،000 وحدة دولية / مل GM-CSF 5-8. لهذا البروتوكول، ونحن نستخدم 400 وحدة دولية / مل IL-4 و 100 وحدة دولية / مل GM-CSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 2 EasyFlasks أيام عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة تحتوي على 5٪ CO 2. </li></ol> 3. يوم 2: تغذية الخلايا الجذعية مع IL-4 و GM-CSF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 مل من RPMI / بلازما ذاتي 1٪ مع 400-1،000 وحدة دولية / مل IL-4 و 100-1،000 وحدة دولية / مل GM-CSF إلى كل EasyFlask. مزيج من قبل دوامات وهزاز على جانبها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان EasyFlasks لمدة 3 أيام أخرى (حتى يوم 5) عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة تحتوي على 5٪ CO 2. </li></ol> 4. يوم 5: حصاد الخلايا الجذعية غير ناضج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الثقافات التي يحوم بقوة قوارير وpipetting صعودا وهبوطا ل resuspend الخلايا غير ملتصقة وملتصقة فضفاضة. نقلخلايا المقطوع إلى جديد 50 مل أنابيب مخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatants و resuspend الكرية خلية في 50 مل RPMI / بلازما ذاتي 1٪. تخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الخلايا وتحديد بقاء الخلية. حساب العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لوحة 1-2 × 10 6 خلايا لكل بئر في 3 مل RPMI / بلازما ذاتي 1٪ مع 400 وحدة دولية / مل IL-4 و 100 وحدة دولية / مل GM-CSF في 6 جيدا لوحات زراعة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة التي تحتوي على 5٪ CO 2 بين عشية وضحاها. </li></ol> 5. يوم 6: النضج ومولدة جار الخلايا الجذعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكروغرام / مل KLH إلى 1/3 من الآبار في لوحات ثقافة 6 جيدا. دوامة لوحات لخلط. يضاف KLH فقط إلى 1/3 من الآبار لأنه يستخدم فقط KLH لقاح DC الأول. اللاحقة DC اللقاحات يخدعتين فقط الببتيدات مستضد الورم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن حفز البلدان النامية إلى أن تنضج استخدام محفزات مختلفة. كانت المحفزات نضوج الأكثر شيوعا التي تم استخدامها في الدراسات السريرية مزيج من السيتوكينات (IL-1 β، TNFα، وIL-6) والبروستاغلاندين E2 (PGE 2) 9،10. وفي الآونة الأخيرة، واستخدام تول مثل مستقبلات (TLR) منبهات اكتسبت شعبية 11،12. في هذا البروتوكول، إضافة 2 ملغ / مل Polyinosinic-Polycytidylic ميثيل السيلولوز حمض بولي-L-يسين (بولي ICLC) إلى الآبار وتخلط جيدا. بولي ICLC هو صياغة السريرية الصف من بولي IC أن تكون ثابتة مع بولي-L-*-يسين وميثيل السيلولوز (المصنعة من قبل Oncovir، وشركة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكروغرام / مل مستضدات الببتيد طويلة (NY-ESO-1 و / أو Melan-A/MART-1) إلى الآبار المحددة لها، كل تلقي جيدا فقط الببتيد واحدة لتجنب انتقال المنافسة 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة تحتوي على 5٪ CO &lt;الفرعية&gt; 2 O / N. </li></ol> 6. يوم 7: الحفظ بالتبريد من الخلايا الجذعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد DC الحل التجميد باستخدام البلازما ذاتي و 10٪ DMSO. أجهزة الطرد المركزي في حل تجميد DC في 2،000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة أي مواد الجسيمات. طاف لنقل صفت 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم الانتهاء من الحضانة بين عشية وضحاها، والحصاد وبركة جميع الآبار التي تحتوي على البلدان النامية نابض مع الببتيدات في أنابيب مخروطية 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 6 دقائق. إزالة supernatants. Resuspend وبيليه الخلية في 5 مل من RPMI / بلازما ذاتي 1٪. جعل إجمالي حجم ما يصل الى 50 مل مع RPMI / بلازما ذاتي 1٪. تخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الخلايا وتحديد بقاء الخلية. حساب العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatants و resuspend كل بيليه في 5 مل STERIجنيه بنسبة 0.9٪ كلوريد الصوديوم، USP ونقل إلى جديدة 15 مل أنابيب مخروطية. جلب كل تعليق الخلية إلى 14 مل مع أكثر العقيمة 0.9٪ كلوريد الصوديوم، USP. قبعة ومزيج من قبل انقلاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة السابقة مرتين. بعد الطرد المركزي مشاركة، وإزالة supernatants، والحصول على أقرب ما يمكن إلى الكريات الخلية دون إزعاج الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وكريات خلية في العاصمة الحل التجميد في 4-20 × 10 6 خلية / مل وقسامة 1 مل لكل قارورة CryoTube 1.8 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الثلاجة من الدرجة التي تسيطر عليها، البرنامج 1، لتجميد أسفل aliquots من اللقاحات DC ونقل على الفور إلى مرحلة البخار من الفريزر النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل. </li></ol> 7. الكثير اختبار الإصدار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يتم تقييم كل دفعة من لقاح العاصمة وتلبية معايير الافراج عن الكثير محددة (الجدول 1) قبل إصدارها للحقن في المرضى في الدراسة، وعادة بعد 5-6 أسابيع تحضير لقاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جدوى:تقييم جدوى لقاح DC باستخدام عداد الخلية الآلي. الحد الأدنى من مواصفات السلامة المقبول هو&gt; 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهوية: تقييم هوية البلدان النامية الناضجة (CD11c و+ CD14-CD83 +) من قبل التدفق الخلوي. النسبة المئوية للخلايا + CD11c و&gt; يجب أن يكون 50٪. النسبة المئوية للCD11c و+ CD14 + خلايا وينبغي أن يكون &lt;30٪ ونسبة CD11c و+، CD14، وينبغي أن تكون CD83 + الخلايا&gt; 50٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العقم: اختبار لقاح العاصمة عن وجود البكتيريا اللاهوائية والهوائية والفطريات عن طريق الثقافة المباشر والبقع غرام. تقييم لوجود الميكوبلازما باستخدام نظام الثقافة المباشر والحمض النووي تألقي الفحص تلطيخ مع خط الخلية المؤشر. لهذه الاختبارات، والحد الأدنى لمجموعة المواصفات هو أنه لا يوجد نمو لوحظ من جميع الثقافات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الذيفان الداخلي: تقييم محتوى الذيفان الداخلي باستخدام الحركية-QCL الحركية مقايسة LAL مولد اللون ويجب أن يكون &lt;50 الاتحاد الأوروبي / مل لتلبية الحد الأدنى من المعايير. </li><lط&gt; وظيفة: تقييم وظائف DC في تفاعل اللمفاويات مختلطة من قبل الحضانة مع الخلايا T خيفي. وتفيد التقارير وجود انتشار بالمقارنة مع البلدان النامية unstimulated (الشكل 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Lesterhuis, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+vaccines+in+melanoma:+from+promise+to+proof.">Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).</li><li>Sabado, R. L., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+dendritic+cell+immunotherapy+towards+successful+cancer+treatment.">Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment.</a> Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).</li><li>Schumacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keyhole+limpet+hemocyanin+(KLH)+conjugate+vaccines+as+novel+therapeutic+tools+in+malignant+disorders.">Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders.</a> J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, 1-2 (2001).</li><li>Jaatinen, T., Laine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+from+human+cord+blood+by+Ficoll-Paque+density+gradient.">Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).</li><li>Eichler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+study+on+in+vitro+characterization+of+dendritic+cells.">Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells.</a> Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).</li><li>Feuerstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+production+of+cryopreserved+aliquots+of+antigen-preloaded,+mature+dendritic+cells+ready+for+clinical+use.">A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use.</a> J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).</li><li>O'Neill, D., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+autologous+peptide-+and+protein-pulsed+dendritic+cells+for+patient-specific+immunotherapy.">Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy.</a> Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).</li><li>de Vries, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypical+and+functional+characterization+of+clinical+grade+dendritic+cells.">Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells.</a> J. Immunother. 25, 429-438 (2002).</li><li>Jonuleit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+cytokines+and+prostaglandins+induce+maturation+of+potent+immunostimulatory+dendritic+cells+under+fetal+calf+serum-free+conditions.">Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions.</a> Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).</li><li>Lee, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+grade+cocktail+of+cytokines+and+PGE2+results+in+uniform+maturation+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells:+implications+for+immunotherapy.">A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy.</a> Vaccine. 20, A8-A22 (2002).</li><li>Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+immune+system+to+treat+cancer.">Harnessing the immune system to treat cancer.</a> J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).</li><li>Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+agonists:+are+they+good+adjuvants?.">Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?.</a> Cancer J. 16, 382-391 (2010).</li><li>Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+dominance,+competition+and+T+cell+affinity+maturation.">Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation.</a> Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).</li><li>Bogunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR4+engagement+during+TLR3-induced+proinflammatory+signaling+in+dendritic+cells+promotes+IL-10-mediated+suppression+of+antitumor+immunity.">TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity.</a> Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).</li><li>Verdijk, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyriboinosinic+polyribocytidylic+acid+(poly(I:C))+induces+stable+maturation+of+functionally+active+human+dendritic+cells.">Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells.</a> J. Immunol. 163, 57-61 (1999).</li><li>Rouas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(I:C)+used+for+human+dendritic+cell+maturation+preserves+their+ability+to+secondarily+secrete+bioactive+IL-12.">Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12.</a> Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).</li><li>Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th1-polarizing+capacity+of+clinical-grade+dendritic+cells+is+triggered+by+Ribomunyl+but+is+compromised+by+PGE2:+the+importance+of+maturation+cocktails.">Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails.</a> J. Immunother. 28, 480-487 (2005).</li><li>Krause, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+is+a+key+factor+for+monocyte-derived+dendritic+cell+maturation:+enhanced+T+cell+stimulatory+capacity+despite+IDO.">Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO.</a> J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).</li><li>Morelli, A. E., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+under+the+spell+of+prostaglandins.">Dendritic cells under the spell of prostaglandins.</a> Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).</li><li>Adams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+(DC)+based+therapy+for+cervical+cancer:+use+of+DC+pulsed+with+tumour+lysate+and+matured+with+a+novel+synthetic+clinically+non-toxic+double+stranded+RNA+analogue+poly+[I]:poly+[C(12)U]+(Ampligen+R).">Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R).</a> Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).</li><li>Colombo, M. P., Trinchieri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-12+in+anti-tumor+immunity+and+immunotherapy.">Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).</li><li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity.">Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).</li><li>Dhodapkar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+broad+T-cell+immunity+in+humans+after+a+single+injection+of+mature+dendritic+cells.">Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells.</a> J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).</li><li>Schuler-Thurner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+of+tumor-specific+type+1+T+helper+cells+in+metastatic+melanoma+patients+by+vaccination+with+mature,+cryopreserved,+peptide-loaded+monocyte-derived+dendritic+cells.">Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells.</a> J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).</li></ol>

قد وردت في كتاب الدعم المالي من الجهات التالية: المعاهد الوطنية للصحة (AI061684، AI071078، AI044628، وK08 AI084578 (ميلر))، ومؤسسة بيل وميليندا غيتس، مؤسسة دوريس ديوك الخيرية، معهد بحوث السرطان، التحالف من أجل أبحاث مرض الذئبة، والزمرد مؤسسة. نينا بهاردواج هو coinventor على براءات الاختراع المتعلقة بإعداد واستخدام الخلايا الجذعية لمعالجة الحصانة. الكتاب ليس لديهم انتماءات الأخرى ذات الصلة أو المشاركة المالية مع أي منظمة أو كيان له مصلحة مالية في الصراع أو المالية مع الموضوع أو المواد التي نوقشت في مخطوطة وبصرف النظر عن تلك المفصح عنها.

المرحلة الأولى والثانية وقد أظهرت التجارب السريرية من DCS الوحيدات المستمدة أنها تحفز الاستجابات المناعية في المرضى لكن النجاح كان محدودا السريرية 1. قد يكون هذا يرجع جزئيا إلى عدم وجود توافق في الآراء بشأن كيفية توليد البلدان النامية الأمثل للاستخدام immunotherapeuti...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td fo:width="2in">Reagent/Supplies/Equipment</td>
 <td>Manufacturer</td>
 <td>Catalog No.</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI-1640 medium with L-glutamine</td>
 <td>BioWhittaker</td>
 <td>12-702F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1M HEPES buffered saline</td>
 <td>BioWhittaker</td>
 <td>17-737E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
 <td>BioWhittaker</td>
 <td>17-516F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human albumin, 25% solution USP</td>
 <td>Aventis Behring</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll-Hypaque PREMIUM</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>17-5442-03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human AB serum</td>
 <td>Valley Biomedical</td>
 <td>HP1022</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile saline USP</td>
 <td>Hospira</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CryoMACS DMSO </td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>170-076-303</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml</td>
 <td>Berlex</td>
 <td>A02266</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MACS GMP IL-4</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>170-076-101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml</td>
 <td>Oncovir</td>
 <td>NA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>VACMUNE KLH</td>
 <td>Biosyn</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>225 sq cm EasyFlasks</td>
 <td>Nalgene Nunc</td>
 <td>159934</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Falcon 6-well tissue culture plates</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>353046</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.8 ml CryoTube vials</td>
 <td>Nalgene Nunc</td>
 <td>377267</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Controlled Rate Freezer</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>CryoMed</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy

بينما أثبتت الدراسات السريرية أن اللقاحات DC مستضد محملة آمنة والعلاج واعدة للأورام 1، يبقى فعاليتها السريرية التي ستنشأ. الطريقة الموضحة أدناه، التي أعدت وفقا للإجراءات التصنيع الجيدة (GMP) المبادئ التوجيهية، هو تعظيم الاستفادة من طريقة إعداد فيفو السابقين الأكثر شيوعا لتوليد أعداد كبيرة من البلدان النامية للدراسات السريرية 2. لدينا وسيلة تستخدم TLR الاصطناعية 3 ناهض Polyinosinic-Polycytidylic ميثيل السيلولوز حمض بولي-L-يسين (بولي ICLC) لتحفيز البلدان النامية. أنشئت لدينا دراسة سابقة أن بولي ICLC هو أقوى التحفيز نضوج الفرد بالنسبة للبلدان النامية الإنسان وفقا لتقييم زيادة إفراز من CD83 CD86 و، تحريض انترلوكين 12 (IL-12)، عامل نخر الورم (TNF)، انترفيرون غاما الناجمة عن بروتين 10 (IP-10)، interleukmin 1 (IL-1)، والنوع الأول إنترفيرون (الإنترفيرون)، والحد الأدنى من انترلوكين 10 (IL-10) الإنتاج. </p&gt; يتم التمييز البلدان النامية من خلايا وحيدات النوى المجمدة الدم المحيطي (PBMCs) التي حصلت عليها فصادة الكريات البيض. يتم عزل PBMCs بواسطة الطرد المركزي المتدرج Ficoll والمجمدة في مأخوذة. في يوم 1، ويتم إذابة PBMCs ومطلي على قوارير زراعة الأنسجة لتحديد لحيدات التي تلتزم سطح البلاستيك بعد 1-2 ساعة الحضانة عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة. بعد الحضانة، ويتم غسل الخلايا الليمفاوية قبالة ويتم تربيتها وحيدات ملتصقة لمدة 5 أيام في وجود انترلوكين 4 (IL-4) ومحببة عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (GM-CSF) للتمييز إلى البلدان النامية غير ناضجة. في يوم 6، ونابض البلدان النامية غير ناضجة مع البطلينوس هيموسيانين (KLH) بروتين ثقب المفتاح التي هي بمثابة مراقبة لجودة اللقاح، وربما تعزيز المناعية للقاح 3. يتم تحفيز البلدان النامية إلى أن تنضج، محملة مستضدات الببتيد، وحضنت بين عشية وضحاها. في يوم 7، يتم غسلها الخلايا، وجمدت في 1 مليلتر مأخوذة تحتوي على4-20 × 10 6 خلايا باستخدام المجمد سعر للرقابة. يتم تنفيذ الكثير الإفراج اختبار للدفعات من البلدان النامية ويجب أن تستوفي الحد الأدنى من المواصفات قبل أن يتم حقنها في المرضى.

ما بين 10 - 20٪ من PBMCs بدءا تفرق في البلدان النامية في نهاية فترة التربية. البلدان النامية الناضجة هي CD11c و+، CD14، CD83 +، CD40 +، وCCR7 + (الشكل 1). وهم يعربون عن مستويات عالية من فئة MHC الأول والثاني جزيئات والجزيئات costimulatory CD80 CD86 و. أيضا بفعل بولي ICLC مستويات أقل من PDL-1 بالمق?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy at JoVE.com

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

يوصف الأسلوب الأكثر استخداما لتوليد أعداد كبيرة من الخلايا الجذعية ذاتي (DCS) لاستخدامها في العلاج بالخلايا الجذعية السرطانية. يستخدم الأسلوب IL-4 و GM-CSF للتمييز البلدان النامية من حيدات. يتم تحفيز البلدان النامية غير ناضجة لتنضج ومن ثم تحميلها مع مستضدات قبل أن يتم حقنها مرة أخرى في جسم المريض.

إعداد ورم مستضد محملة الخلايا الجذعية الناضجة لعلاج مناعي

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

preparation-tumor-antigen-loaded-mature-dendritic-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.1K Views.  NYU Langone Medical Center. يوصف الأسلوب الأكثر استخداما لتوليد أعداد كبيرة من الخلايا الجذعية ذاتي (DCS) لاستخدامها في العلاج بالخلايا الجذعية السرطانية. يستخدم الأسلوب IL-4 و GM-CSF للتمييز البلدان النامية من حيدات. يتم تحفيز البلدان النامية غير ناضجة لتنضج ومن ثم تحميلها مع مستضدات قبل أن يت?...

Video: Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

الفئران نموذج تفعيل CD40 - B من الخلايا

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

بروتوكول الأمثل لترنسفكأيشن كفاءة الخلايا الجذعية من دون نضوج الخلايا

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

عزل خلايا الرئة ماوس شجيرى

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

جيل من الخلايا T CAR للعلاج بالتبني في سياق ورم أرومي دبقي مستوى الرعاية

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

جيل غير ناضج، ناضج ومولد للتحمل الجذعية خلايا مع اختلاف الاستقلابية الظواهر

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

مقايسة على أساس CFSE لدراسة الهجرة من الجلد الفئران الخلايا الجذعية في تصريف الغدد الليمفاوية خلال العدوى مع<em&gt; المتفطرة البقرية</em&gt; عصيات كالميت غيران

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

التنمية والتحقق من جزيء واحد أولتراسينسيتيفي الصفيف الرقمي المرتبط بالانزيم مقايسة الممتز للبشرية انترفيرون-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university centers worldwide. While ECP&#8217;s clinical efficacy and exemplary safety profile have driven its widespread use, elucidation of the underlying mechanisms has remained a challenge, partly owing to lack of a laboratory ECP model. To overcome this obstacle and create a simple, user-friendly platform for ECP research, we developed a scaled-down version of the clinical ECP leukocyte-processing device, suitable for work with both mouse models, and small human blood samples. This device is termed the Transimmunization (TI) chamber, or plate. In a series of landmark experiments, the miniaturized device was used to produce a cellular vaccine that regularly initiated therapeutic anti-cancer immunity in several syngeneic mouse tumor models. By removing individual factors from the experimental system and ascertaining their contribution to the in vivo anti-tumor response, we then elucidated key mechanistic drivers of ECP immunizing potential. Collectively, our results revealed that anti-tumor effects of ECP are initiated by dendritic cells (DC), physiologically generated through blood monocyte interaction with platelets in the TI plate, and loaded with antigens from tumor cells whose apoptotic cell death is finely titrated by exposure to the photoactivatable DNA cross-linking agent 8-methoxypsoralen and UVA light (8-MOPA). When returned to the mouse, this cellular vaccine leads to specific and transferable anti-tumor T cell immunity. We verified that the TI chamber is also suitable for human blood processing, producing human DCs fully comparable in activation state and profile to those derived from the clinical ECP chamber. The protocols presented here are intended for ECP studies in mouse and man, controlled generation of apoptotic tumor cells with 8-MOPA, and rapid production of physiologic human and mouse monocyte-derived DCs for a variety of applications.

The transimmunization (TI) device or plate and related protocols have been developed to replicate the key features of extracorporeal photochemotherapy (ECP), in an experimental setting, allowing for production of physiologically activated, tunable dendritic cells (DCs) for cancer immunotherapy.

بروتوكول جديد لتوليد الخلايا العصبية المناعية الفسيولوجية

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...