تم دعم البحوث في المختبر من قبل معهد ماكس فون بيتنكوفر، لودفيج ماكسيميليان ميونيخ الجامعة، ومؤسسة البحوث الألمانية (DFG، مرحبا 1511/3-1)، والفراء Bundesministerium Bildung اوند Forschung (BMBF) &quot;الجينوم العدوى الطبية&quot; مبادرة ( 0315834C).

1. الاستعدادات لعزل LCV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسحة من البكتيريا المنتجة للبنوموفيلا DsRed اكسبريس 13،14 من أسهم الجلسرين على لوحات أجار CYE مع 5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول (CAM) قبل أربعة أيام العزلة LCV. احتضان هذه البكتيريا عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بذرة من 1 7 10 س د. discoideum المنتجة GFP-calnexin أو RAW264.7 الضامة الفئران في 75 سم ثقافة الأنسجة 2 1 قوارير عدوى قبل يوم. استخدم 10 مل HL5 المتوسطة مع 20 ميكروغرام / مل G418 لD. discoideum واحتضان والأميبات في 23 درجة مئوية. لRAW264.7 الضامة استخدام 10 مل RPMI 1640 متوسطة تستكمل مع FCS 10٪ (حرارة المعطل) والجلوتامين 1٪، وتنمو هذه الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. تستخدم ثلاثة على الأقل 75 سم 2 لكل القوارير العدوى والعينة (الحد الأدنى 6 × 10 7 الخلايا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم ثقافة بين عشية وضحاها مع L. بنوموفيلا من لوحة CYE. اخذت انبوب اختبار 15 مل مع 3 مل المتوسطة آيو 5 ميكروغرام / CAM مل. تطعيم مع 100 ميكرولتر من تعليق البكتيرية أن يؤديا إلى التطوير التنظيمي ل 600Nm من 0.1. احتضان الثقافة بين عشية وضحاها على عجلة دوران فوق 37 درجة مئوية في ل21-22 ساعة. </li></ol> 2. LCV العزلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير وسيلة د. خلايا discoideum لإزالة المضادات الحيوية، التي من شأنها أن تتداخل مع عدوى التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس القطر الخارجي للثقافة بين عشية وضحاها. وينبغي أن البكتيريا قد وصلت العدوى ذروتها في 1 ل 600Nm OD من ≥ 3، والتي تتطابق مع بكتيريا × 10 9 2 / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصيب الخلايا من خلال إضافة ما يقرب من 500 ميكرولتر من L. بنوموفيلا ثقافة بين عشية وضحاها إلى الخلايا المتنامية في 10 متوسطة HL5 مل (د discoideum) أو 10 مل RPMI 1640 (الضامة). وهذا يتوافق مع عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) 50. بعد ذلك، تتم مزامنة العدوى عن طريق الطرد المركزي من البكتيريا على الخلايا في ز × 500 لمدة 10 دقيقة. ويتبع الطرد المركزيمن قبل حضانة D. discoideum الخلايا في درجة مئوية (25) والضامة RAW264.7 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، على التوالي. الوقت عدوى من 1 ساعة وتشمل الخطوة الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الإصابة إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مرة واحدة لإزالة البكتيريا خارج الخلية. استخدام الثلج الباردة العازلة SorC عن د. discoideum والجليد الباردة في برنامج تلفزيوني عن RAW264.7 الضامة. أضف 3 مل HS العازلة، على أن تستكمل مع مثبطات الأنزيم البروتيني (روش) على كل قارورة وجمع الخلايا باستخدام مكشطة الخلية. تجمع العينات المطابقة في أنبوب اختبار 15 مليلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجانس العينة استخدام المحاقن مل 3 Luer لوك البلاستيك والفولاذ المقاوم للصدأ الخالط الكرة. تأكد من أن تعمل على الجليد. قبل أن تبدأ، وغسل الخالط الكرة مع الماء المقطر، لتجنب أي تلوث المنظفات والاحمرار مع عازلة الجليد HS الباردة للتخلص من فقاعات الهواء. استخدام تخليص الكرة 8 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل أول 3 مل في اوند حقنة تركيبها على الالخالط ه. اضغط على عينة ذهابا وإيابا تسع مرات خلال الخالط. تبادل المحاقن بعد ذلك لتجنب التلوث بمادة لا تهدف المتجانس. جمع وتجميع عينة متجانسة في أنبوب اختبار 15 مليلتر وأخذ عينة للتحليل 150 ميكروليتر المجهرية. قبل الشروع في عينة مختلفة تفكيك وغسل الخالط الكرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع جناسة مع CS 2٪ أو FCS لمدة 30 دقيقة على شاكر على الجليد أو على عجلة فوق الغزل (10-20 دورة في الدقيقة) في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حظر استخدام جسم مضاد الانجذاب-تنقية الابتدائية ضد صدق (تخفيف 1:3000) أو ضد أي علامة البكتيرية الأخرى ملزم حصرا للغشاء LCV. دوامة الحل الضد قبل إضافته إلى جناسة. احتضان العينة لمدة 1 ساعة على شاكر على الجليد أو على عجلة فوق الغزل (10-20 دورة في الدقيقة) في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غضون ذلك، وإعداد التدرج Histodenz. استخدام أنبوب الاختبار 15 مليلتر لكل التدرج وثلاث 75 سم 2 قوارير من عينة واحدة. خشب التنوبش، إضافة 5.75 مل من Histodenz 35٪ إلى أنبوب، والثانية، إضافة بعناية 5.75 مل من محلول Histodenz 10٪ على أعلى. بعد ذلك وضع بعناية في أنابيب أسفل أفقيا لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة جناسة مع كاشف الحجب والأجسام المضادة الأولية، وأجهزة الطرد المركزي في ز × 600 لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير عينة. تجاهل طاف وresuspend على بيليه في 1.5 مل HS العازلة. نقل العينات إلى أنبوب اختبار جديد 15 مل وأخذ عينة للتحليل 40 ميكرولتر المجهرية في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان وبيليه مع الجسم المضاد الثانوي - في 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على شاكر - MACS الماعز المضادة للأرنب مفتش الخرز الصغير (تخفيف 1:25) في غضون ذلك، وضع الأعمدة على حامل MACS المغناطيسية وتتوازن لهم 0.5 مل HS العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت لاحق، وتطبيق العينات إلى العمود. جمع 150 ميكرولتر من التدفق من خلال لتحليل مجهري لاحق. غسل العمود ثلاث مرات مع 0،5 العازلة HS مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأعمدة من تيهو المغناطيس وشطافة في LCVs مع 0،5 العازلة HS مل من التدفق على الفور. أخذ عينة 20 ميكرولتر لتحليل مجهري. ومن المتوقع أن الخطوة تنقية بواسطة المناعية المغناطيسي فصل الاستسلام لكل 1 × 10 7 المصابين د. خلايا discoideum حوالي 1 × 10 6 LCVs سليمة، والتي أثرت عن سبع مرات في شطافة مقارنة مع 13 التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب التدرج Histodenz العودة إلى الوضع العمودي وتحميل بعناية شطافة على القمة. منبذة الأنابيب في غرام × 3350 لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي أخذ 1.5 مل الكسور بدءا من الجزء السفلي من أنبوب الاختبار باستخدام طويل زجاج ماصة باستير. جمع تماما 8 أجزاء، كل من الجزء السفلي من أنبوب. لم يلاحظ أي الطبقات المرئية في الانحدار Histodenz المستمر. ومن المتوقع عادة على أعلى عائد من LCVs في جزء 4 في نسبة ~ 2 × 10 5 LCVs سليمة في 1 × 10 7 فيfected الأميبات 13. كميات صغيرة من LCVs موجودة أيضا في أجزاء 3 و 5 على التوالي. وهكذا، فإن العائد الإجمالي للLCVs المنقى هو ~ 1 × 10 6 LCVs سليمة في 6 × 10 7 المصابين د. خلايا discoideum 13. لا يمكن أن يؤديها انتعاش LCVs في درجة حرارة الغرفة (RT)، وLCVs تبدو مستقرة لعدة ساعات. </li></ol> 3. المجهرية تحليل العينات التي تم جمعها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 24 كذلك زراعة الأنسجة مسطحة القاع مع لوحة بولي-L-يسين coverslips المغلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة كل عينة التي اتخذت خلال تنقية LCV بالإضافة إلى 150 ميكرولتر من كل جزء كثافة التدرج في لوحة 24-جيدا. إضافة 0.5 مل العازلة HS إلى كل بئر لتخفيف تركيز Histodenz عالية. بعد ذلك، لوحة أجهزة الطرد المركزي في ز × 600 لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة بعناية وطاف وتحديد العينات مع بارافورمالدهيد 4٪ (منهاج العمل) لمدة 20 دقيقة في RT. بعد تثبيت غسل العينات مرتين. لناه SorC عن د. discoideum وبرنامج تلفزيوني لمدة RAW264.7 الضامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل عينات من GFP-calnexin تعبير د. discoideum، التي اتخذت في خطوات مختلفة خلال العزلة LCV، مباشرة على شرائح من الزجاج باستخدام Vectashield على سبيل المثال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عينات من RAW264.7 الضامة، التي اتخذت في خطوات مختلفة خلال العزلة LCV، مع حل حجب (1٪ في جيش صرب البوسنة PBS) لمدة 10 دقيقة في RT. استخدام أجسام مضادة لمكافحة صدق الأولية إلى وصمة عار في LCVs واحتضان ل1H في غرفة رطبة في RT (تقارب-المطهرون أرنب المضادة للصدق، 1:1000 في عرقلة عازلة). في وقت لاحق، وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال المضادة للأرنب Cy5؛ 1:200 في عرقلة الحل) لمدة 30 دقيقة في غرفة رطبة ومظلمة في RT. أخيرا، وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ويشن منها على شرائح من الزجاج باستخدام Vectashield على سبيل المثال. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مورفولوجيا والنزاهة وكمية من LCVs معزولة عن GFP-calnexin تعبير د. ديسويتم تحليل coideum أو من RAW264.7 الضامة بواسطة المجهر مضان مجهزة مرشحات كافية. </li></ol> 4. ممثل النتائج ويمكن متابعة نوعية وانتاجية وتنقية LCV بواسطة المناعية تقارب الفصل والطرد المركزي المتدرج الكثافة من قبل مضان المجهري (الشكل 1). لمحة عامة عن العينات التي تم جمعها خلال العزلة LCV من د. ويرد discoideu متر أو الضامة (الشكل 2). وجناسة من L. بنوموفيلا المصابين البالعات يظهر LCVs سليمة، ولكن أيضا الكثير من الحطام الخلية والبكتيريا خارج الخلية. بعد التكوير العينة، وكانت الصورة مماثلة لجناسة، وأحيانا أكثر كثافة قليلا. منذ LCVs سليمة يجب ان يلتزم العمود، والتدفق من خلال معظمها يحتوي على بكتيريا خارج الخلية والحطام الخلية. بعد يبلغ حجمه على عينة من العمود، ويحتوي على شطافة LCVs سليمة في كميات كبيرة. في أيدينا، وLCV purificati<html> على ما يبدو أكثر فعالية لد. discoideum من لالضامة. في D. discoideum للفجوات الممرض تظهر مستدير والعائد من LCVs معزولة أكثر من 10 أضعاف مقارنة مع الضامة (الشكل 3). في البلدان ذات الاستهلاك المنخفض الضامة سليمة ملطخة الأجسام المضادة المختلفة تظهر أيضا أكثر غير منتظمة الشكل. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig1.jpg" /> نظرة عامة على الشكل التخطيطي 1. من العزلة LCV. أ) عزل LCVs بواسطة المناعية المغناطيسي الفصل باستخدام جسم مضاد الانجذاب-تنقية ضد بروتين صدق المستجيب البكتيرية، وإضفاء الطابع المحلي على وجه الحصر لغشاء LCV. وتستخدم MACS الثانوية الدقيقة حبة الديناميكي الأجسام المضادة والمغناطيس 1 لعزل LCVs من حطام خلية. ب) بعد LCVs فصل المناعة المغناطيسي وتنقيته مزيد من كثافة Histodenz الطرد المركزي المتدرج. يتم إثراء LCVs في جزء 4. upload/4118/4118fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. العينات التي تم جمعها خلال تنقية LCV. صور من جناسة، بيليه، التدفق من خلال وشطافة من د. وصفت discoideum أو الضامة. هذه العينات تبين L. بنوموفيلا المنتجة DsRed اكسبريس (الحمراء) في د. discoideum المنتجة GFP-calnexin إشارة (أخضر، لوحة العليا) أو في الضامة ملطخة جسم مضاد لمكافحة صدق (سماوي، اللوحة السفلى). الحانات، و 10 ميكرون. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig3.jpg" /> الشكل 3. تنقية LCVs من د. discoideum أو الضامة. هذه العينات تبين جزء 4 بعد كثافة Histodenz الطرد المركزي المتدرج من L. بنوموفيلا المنتجة DsRed اكسبريس (الأحمر) في (أ) د. discoideum المنتجة GFP-calnexin إشارة (الخضراء) أو (B). في الضامة ملطخة جسم مضاد لمكافحة صدق (السماوي) الحانات، و 10 ميكرون.

<ol>
	<li>Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+spp.+outdoors:+colonization,+communication+and+persistence.">Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).</li><li>Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot/Icm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila.">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS ONE. 6, e17638 (2011).</li><li>Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchors+for+effectors:+subversion+of+phospho-inositide+lipids+by+Legionella.">Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella.</a> Front Microbiol. 2, 91 (2011).</li><li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors.">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li><li>Kima, P. E., Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+calnexin+expression+on+phagosomes+to+isolate+Leishmania+parasitophorous+vacuoles.">Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles.</a> Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).</li><li>L&#252;hrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages.">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).</li><li>Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+Mycobacterium+and+the+macrophage+analyzed+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).</li><li>Fernandez-Mora, E., Polidori, M., L&#252;hrmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Rhodococcus+equi-containing+vacuoles+is+arrested+after+completion+of+the+early+endosome+stage.">Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage.</a> Traffic. 6, 635-653 (2005).</li><li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y.+pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).</li><li>Shevchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Legionella-containing+phagosomes+isolated+from+Dictyostelium.">Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium.</a> Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).</li><li>Brombacher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab1+guanine+nucleotide+exchange+factor+SidM+is+a+major+phosphatidylinositol+4-phosphate-binding+effector+protein+of+Legionella+pneumophila.">Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila.</a> J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).</li><li>Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Legionella-containing+vacuoles+by+immuno-magnetic+separation.">Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).</li><li>Urwyler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Legionella+vacuoles+purified+by+magnetic+immunoseparation+reveals+secretory+and+endosomal+GTPases.">Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases.</a> Traffic. 10, 76-87 (2009).</li><li>Mampel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planktonic+replication+is+essential+for+biofilm+formation+by+Legionella+pneumophila+in+a+complex+medium+under+static+and+dynamic+flow+conditions.">Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وعلى النقيض من الأساليب المنشورة سابقا، ويستند هذا البروتوكول على خطوتين، لأول مرة فصل LCVs بواسطة نهج المناعية المغناطيسي، والثانية، وتنقية من LCVs بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة. ويمكن عزل LCV اتباعها بسهولة بواسطة المجهر مضان، عندما يتم استخدام أي من البكتيريا...

purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes

والانتهازية الممرض الفيلقية المستروحة هو جرثومة الاميبا المقاوم، والذي يتطابق أيضا في الضامة السنخية وبذلك يكون الالتهاب الرئوي &quot;داء الفيالقة&quot; (1). في البالعات الأوالي والثدييات، L. بنوموفيلا توظف آلية الحفظ على تشكيل معين، والنسخ، متساهل مقصورة، و &quot;البكتيريا التي تحتوي على فجوة&quot; (LCV). LCV تشكيل يتطلب البكتيرية ICM / نقطة إفراز الرابع نوع النظام (T4SS)، والتي translocates ما يصل الى 275 &quot;المستجيب&quot; البروتينات في الخلايا المضيفة. والمستجيبات التلاعب البروتينات المضيفة، وكذلك نسبة الدهون والتواصل مع إفرازي، العضيات endosomal والميتوكوندريا 2-4. تشكيل LCVs يمثل عملية معقدة وقوية وزائدة عن الحاجة، والتي من الصعب فهم بطريقة اختزالية. مطلوب نهج تكاملي لفهم شامل تشكيل LCV، بما في ذلك تحليل عالمي للمسارالتفاعلات عامل ogen في استضافة وديناميتها الزمانية والمكانية. وذلك كخطوة أولى نحو تحقيق هذا الهدف، وتنقيته LCVs سليمة وتحليلها بواسطة البروتيوميات وlipidomics. وقد تم التحقيق في تكوين وتشكيل الممرض المحتوية على فجوات بواسطة تحليل البروتين باستخدام اللوني السائل أو 2 مد هلام الكهربائي بالإضافة إلى مطياف الكتلة. آوى فجوات معزولة عن إما discoideum التربة الاجتماعية Dictyostelium الأميبا أو البالعات الثدييات الليشمانيا 5، 6 الليستيريا، المتفطرة 7، Rhodococcus 8، 9 أو السالمونيلا النيابة البكتيريا. 10. ومع ذلك، فإن البروتوكولات المستخدمة في تنقية هذه الدراسات وقتا طويلا ومملا، لأنها تتطلب على سبيل المثال المجهر الإلكتروني لتحليل LCV مورفولوجيا والنزاهة والطهارة. بالإضافة إلى ذلك، هذه البروتوكولات لا استغلال الميزات الخاصة للفجوة الممرض لENrichment. الطريقة المعروضة هنا يتغلب على هذه القيود من خلال توظيف دال discoideum المنتجة للعلامة LCV الفلورسنت وذلك عن طريق استهداف البكتيرية صدق بروتين المستجيب، الذي انتقائي المراسي لغشاء LCV عن طريق الربط بين فوسفتيدلينوستول 4-الفوسفات (PtdIns (4) P) 3،11. يتم إثراء LCVs في خطوة أولى من قبل المناعية المغناطيسي الفصل باستخدام جسم مضاد الانجذاب-تنقية الابتدائية ضد صدق والأجسام المضادة الثانوية بالإضافة إلى حبات المغناطيسي، ثم في مرحلة ثانية من قبل الطرد المركزي Histodenz الكلاسيكية التدرج الكثافة 12،13 (الشكل 1) . دراسة بروتيوم من LCVs المعزولة من د. وكشفت discoideum أكثر من 560 بروتينات الخلية المضيفة، بما في ذلك البروتينات المرتبطة الحويصلات البلعمية، الميتوكوندريا، وأوروبا وجولجي، وكذلك GTPases عدة، والتي لم تكن قد تورطت في تشكيل LCV قبل 13. LCVs التخصيب وتنقيته معحدد بروتوكول هنا يمكن تحليل مزيد من الفحص المجهري (المناعي، المجهر الإلكتروني)، طرق كيميائية حيوية (الغربية وصمة عار) والنهج البروتين أو lipidomic.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes at JoVE.com

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

توضح هذه المقالة طريقة لعزل وتنقية سليمة<em&gt; البكتيريا</em&gt; التي تحتوي على فجوات (LCVs) من الاميبا والضامة. البروتوكول على مرحلتين تشمل تخصيب LCV بواسطة المناعية المغناطيسي الفصل باستخدام الأجسام المضادة ضد علامة LCV البكتيرية وتنقية المزيد من الطرد المركزي المتدرج الكثافة.

تنقية من الفجوات المرضي من<em&gt; البكتيريا</em&gt; المصابة البالعات

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

purification-of-pathogen-vacuoles-from-legionella-infected-phagocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

12.4K Views.  Ludwig-Maximilians-Universität. توضح هذه المقالة طريقة لعزل وتنقية سليمة البكتيريا التي تحتوي على فجوات (LCVs) من الاميبا والضامة. البروتوكول على مرحلتين تشمل تخصيب LCV بواسطة المناعية المغناطيسي الفصل باستخدام الأجسام المضادة ضد علامة LCV البكتيرية وتنقية المزيد من الطرد المركزي المتدرج...

Video: Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

غزو ​​الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

في يوم واحد خطة سير العمل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية ومضادات الميكروبات اختبار المقاومة من زرع الدم

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

تنقية والتصور من Lipopolysaccharide من البكتريا سالبة الجرام بواسطة استخراج مائي، الفينول الساخن

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

الخلية الحية المجهرية فيديو البلعمة الممرض الفطرية

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

متساوي التضخيم (LAMP) فحوصات بوساطة حلقة للكشف عن أنواع محددة من<em&gt; الأيمرية</em&gt; التي تصيب الدجاج

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA تنقية من داخل الخلية المزروعة<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; في خلايا البلاعم

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

التنمية وتحديد جزء من السكان رواية من المستمدة العدلات-الإنسان البالعات العملاق<em&gt; في المختبر</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

التكشف وظيفة من المستجيب البكتيرية من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة باستخدام الخميرة شاشة ثنائية مختلطة

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.