الحيوانات المعدلة وراثيا أساسية للبحوث الطبية الحيوية الحديثة لأنها تسمح بإجراء دراسات عن وظائف الجينات في الكائنات الحية. وقد طبقت أساليب مختلفة من التعديلات الجينية في الدراسات الحيوانية. هنا، نقدم تقنية فعالة يمكن الوصول إليها على نطاق واسع تستخدم ناقلات العدسي كوسيلة لدمج المتحولين جنسيا في جينوم جنين الفئران.
بعد إدارة gonadotropin المشيمية البشرية ، ورفيقة خمسة أسابيع من العمر الجرذان الإناث في ويستار واحد إلى واحد مع خصوبة جنسية ثلاثة إلى 10 أشهر من الذكور ويستار. في 8 إلى 10 a.m في صباح اليوم التالي، تحقق من الإناث لوجود المكونات المهبلية وحصاد oviducts من الإناث مع قابس التزاوج في موعد أقصاه 10 .m.
في طبق جمع يحتوي على متوسط M2 مُدفأ مسبقًا. عندما تم جمع جميع oviducts، نقل الأنسجة إلى طبق 35 ملليمتر تحتوي على M2 المتوسطة التي تم تسخينها مسبقاً مع 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر من الهيالورونيداز من الخصيات البقرية ووضع الطبق تحت مجهر ستيريو. استخدم ملقطًا ناعمًا لفتح جدران oviduct واضغط على أمبولاً حتى يتم تحرير الأجنة.
لتسهيل إطلاق الأجنة من خلايا الكامولو، استخدم ماصة نقل الزجاج متصلة بأنبوب اسبيرات يعمل بالفم إلى ماصة الأجنة بلطف صعودا وهبوطا. عندما يتم إطلاق جميع الأجنة، قم بغسل الخلايا عدة مرات في وسط M2 جديد لإزالة الحطام الهيالوروني والخلوي. نقل الأجنة إلى 50 قطرات ميكرولتر الفردية من M16 المتوسطة قبل التوازن التي تغطيها الزيوت المعدنية في طبق 60 ملليمتر.
ثم ضع الطبق في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية مع غلاف جوي ثاني أكسيد الكربون 5٪ حتى حقنها. بالنسبة للضخ الدقيق للمتجهات الناقلة في إطار zona pellucida من الأجنة مرحلة خلية واحدة ، استخدم سحب ماصة لإعداد الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات الدقيقة بوروزيليكات مع خيوط. بعد كل مرة يتم فيها تغيير خيوط أو يتم استخدام شعري زجاجي جديد، قم بتشغيل اختبار منحدر لتعيين المعلمات المثلى.
بعد ذلك ، استخدم طرف microloader لتحميل ما يقرب من اثنين microliters من محلول العدسي الطازج المذاب في ماص الحقن الدقيق تحت غطاء تدفق اللامينار. أضف قطرة 100 ميكرولتر من M2 متوسطة إلى مركز الغطاء من طبق بيتري 60 ملليمتر. تغطية المتوسطة مع النفط المعدني وجبل ماصة عقد والفيروس حملت الشعرية microinjection على micromanipulator.
ضع طبق الحقن المجهري تحت مجهر مقلوب ونقل 15 إلى 20 جنينًا من خلية واحدة في مرحلة الخلية الواحدة إلى قطرة M2 في طبق الحقن الدقيق. القبض على جنين واحد مع ماصة عقد واستخدام التكبير 400 مرة والشعيرات الدموية الزجاجية لحقن محلول العدسي فيروسيل تحت pellucida زونا في الفضاء ما بينيتلين عقد الشعرية تحت pellucida زونا للحظة بعد أن تم تسليم الفيروس. عندما يتم حقن جميع الأجنة ، استخدم ماصة دقيقة لإعادة الخلايا المحقونة إلى طبق الثقافة وإعادة الطبق إلى حاضنة زراعة الخلايا حتى زرعها.
لإعداد الأمهات بالتبني لنقل الجنين، رفيقة ناضجة جنسيا Sprague-Dawley الإناث مع الذكور المنوية والتحقق من الإناث في صباح اليوم التالي عن المكونات المهبلية. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لدواسة منعكس في الإناث تخدير مع سد قابلة للحياة، وتطبيق مرهم على عيون الحيوان وحلق الفراء من الجزء الخلفي من كل. ضع الفأر الأول في موضعه المعرض على سطح نظيف على منصة تدفئة تحت مجهر جراحي.
غطي الجرذ بغطاء معقمة مع فتحة صغيرة تقطع على أسفل الظهر و قومي بشق جلدي يبلغ سنتيمترين تقريباً موازياً للعمود الفقري القطني. استخدام مقص حاد لجعل قطع في جدار البطن واستخدام ملقط لفهم وسادة الدهون المبيض. سحب المبيض وoviduct من تجويف البطن على قطعة من 0.9٪ شاش كلوريد الصوديوم غارقة.
تحميل M2 المتوسطة، ثلاث فقاعات من الهواء، والأجنة في الشعرية نقل. استخدام microscisors لجعل شق صغير في oviduct بين infundibulum و ampulla وإدراج غيض من ماصة نقل في شق. طرد الأجنة وفقاعات الهواء بلطف في oviduct ، ثم استخدم ملقطًا حادًا لوضع الجهاز التناسلي مرة أخرى في تجويف البطن.
خياطة جدار البطن مع خياطة حمض متعدد الكليات القابلة للامتصاص وإغلاق شق الجلد مع مقاطع الجرح ووضع الحيوان في قفص نظيف على لوحة الاحترار مع رصد حتى إعادة شغل كامل. إلى قطع القناة المنوية الاصحاح الاصحاح المحتملة، بعد إعداد الفئران الذكور لعملية جراحية كما هو موضح، واستخدام 70٪ الإيثانول وفرك الجراحية لتطهير الجلد على الخصية. اضغط بلطف على البطن لفضح الخصيات في الكيس الكيس وتغطية الجرذ مع ستائر معقمة مع ثقب صغير فوق موقع الجراحة واستخدام مقص scrotal لجعل شق 0.5 سنتيمتر في منتصف الكيس.
دفع بعناية الخصية إلى اليسار وتحديد مكان الأوعية الدموية بين الخصية وخط الوسط كما قناة بيضاء مع وعاء دموي واحد. استخدام ملقط صانع الساعات لسحب بلطف vas deferens من كيس scrotal وعقد السفينة مع ملقط، واستخدام مقص غرامة لإزالة جزء سنتيمتر واحد من القناة. كرر الإجراء للخصي الثاني كما أظهرت للتو وإغلاق الجلد مع الغرز حمض متعدد الكوليك امتصاص.
ثم ضع الجرذ في قفص نظيف على لوحة دافئة مع المراقبة حتى إعادة شغل الوظائف بالكامل. وفي هذه التجربة التمثيلية التي تم فيها حقن أجنة منفردة عدة مرات، ولدت ثمانية فئران من أجنة تم حقنها مرتين، وتأكد أن ثلاثة منها تحمل ال transgene. ولم ينقل أحد المؤسسين الترانسجين إلى ذرية واستخدمت ثلاث إناث بالتبني لكل إعداد تجريبي.
سمح النهج المختار بتوليد خطوط فئران ثابتة محورة وراثياً تعبر عن بروتين الاندماج TDP-43-eGFP تحت سيطرة المشبك العصبي في مروج واحد في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي. نتج عن التحول عبر النسل القائم على فيروس العدين إدخال نسخة واحدة من transgene كما يتضح من PCR الكمية. عندما تم استخدام هذه الطريقة لناقلات أخرى من فيروسات عدسي، لوحظ تقريبا 90٪ معدل البقاء على قيد الحياة.
وكانت النسبة المئوية للأجنة التي نجت من الحقن برونويك أقل بكثير. وعموما، تشير هذه النتائج إلى أن الجرذان الحامل يمكن أن تستخدم كأمهات حاضنة ذات كفاءة مماثلة. وتجدر الإشارة إلى أن البيانات الرقمية التي تم تحليلها لجولات فردية من الحقن المجهري تشير إلى أن فعالية الزرع تعتمد بشكل مباشر على عدد الحقن في جنين واحد وبشكل غير مباشر على الحمل الفيروسي.
ويضمن استخدام ناقلات فيروسات العدتي التكامل الجيني وانتقالها من المتحولين جنسيا ويسهل معدل بقاء عالية من الأجنة micromanipulated حتى عندما يتم إجراء حقن تحت الجلد متعددة. ويمكن تطبيق هذا الإجراء بفعالية على الأنواع الأخرى ويمكن اعتباره بديلاً عن التغاير التقليدي.
