המחברים מודים טרייסי יאנג-פירס וAtsushi קאמיה למתן פלסמידים. עבודה זו מומנה על ידי נוירון Eranet לגלות או וCK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) לCK, ו( DE 792/2-4) למיסה

כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי Landesministerium האחראי für נאטור, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW; 87-51.05.2010.A301) בהתאם ללאומי וחקיקה אירופאית. 1. ברחם Electroporation שיטה זו תוארה בפירוט ביופיטר לחולדה על ידי Walantus et al. 3, כמו גם רייס ואח&#39;. 4 והוא כאן סיכם רק לזמן קצר. גודל המלטה של ​​6-8 גורים מניב תוצאה טובה. לא צריך להיות לפחות שני עוברים שאינם electroporated על מנת להגדיל את שיעור ההישרדות הכולל (ראה להלן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-DNA המכילה תערובת 1.5 מיקרוגרם / μl של יעד פלסמיד (shRNA: pENTR-U6; Invitrogen, יוג&#39;ין, או ביטוי יתר / DISC1: pCAX 21), 0.5 מיקרוגרם / μl בלוציפראז המכיל פלסמיד (pCAX), 0.5 מיקרוגרם / μl-GFP המכיל פלסמיד (22 pCAGGS) בBlu אור הפתרון המוכתם 1x PBSדואר עם מהיר גרין דיי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מחטי הזרקה מתוך נימי זכוכית עם מחט פיפטה פולר. ולעקר מכשירי ניתוח או על ידי מעוקר או דגירה עם חומר חיטוי על בסיס אלכוהול (kodan Tinktur הצד החזק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלו מנה טרום ניתוחית של עצירות (0.05 מ&quot;ג / קילוגרם) 15 דקות לפני הניתוח לחולדה בהריון 16 ימים לאחר ההפריה (E16). ואז להרדים את החיה בחדר isoflurane. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההרדמה, מניח את החולדה בעמדת פרקדן על שולחן ניתוח חימם 37 ° C עם מסכת נשימה מחוברת למכשיר ההרדמה, שימוש בהגדרת חמצן ב0.4 ליטר / דקה וisoflurane ב1.8%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר גילוח הבטן, לחטא את האזור המגולח שלוש פעמים עם kodan Tinktur פורטה (חומר חיטוי על בסיס אלכוהול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את העכברוש עם בגדים סטריליים, חושף רק את שדה הפעולה המגולח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע ב electroporation ברחם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הבטן עם scissor לאורך alba Linea (~ 2 סנטימטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את קרן הרחם בזהירות עם מלקחיים טבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדאוג לשמור על קיר הרחם רטוב עם PBS סטרילי התחמם במהלך כל הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק פתרון ה-DNA עם מחט זכוכית דקה לתוך אחד של החדר לרוחב של העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה 7 מ&quot;מ סביב ראשו של העובר. להכות אוכלוסיית תאים של שכבות העליונות של קליפת המוח, לבצע IUE בE16 23 ולמקם את האלקטרודה החיובית בחצי הכדור מעל החדר המוזרק עם נטייה גב / עדין לצדדים. כדי למקד את התאים בהיפוקמפוס לשנות את מיקום האלקטרודה החיובי לצד השני יותר מאשר החדר הוזרק לרוחב למעט כיוון גב (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע electroporation על ידי חמישה 50 פולסים msec ב55 V עם 950 הפסקות אלפיות עם electroporator דופק גל מרובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חילוף העובר הראשון בסוף הנרתיק של כל קרן רחם על מנת להגדיל tהוא סיכויי הישרדות של כל העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את קרנות הרחם בחזרה לתוך החולדה האם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Stich דופן הבטן עם חומר תפר נספג Vicryl כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את העור עם חומר תפר Vicryl או עם קליפים תפר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החולדה האם חזרה לכלוב בבית ולשמור אותו חם ל2-3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את החולדות לבדו בכלוב בביתם בחדר מתקן בעלי החיים וכרצונך להאכיל. הם נותנים לידה בין E22-24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על גורי חולדה עם אמם במשך שלושה שבועות ולהפריד אותם לאחר מכן על ידי מגדר. </li></ol></li></ol> 2. הדמית חית פליטת אור של התגובה האנזימטית בלוציפראז שיטה זו משמשת כדי לנתח את המיקום של התאים ברחם transfected. cDNA גחלילית לוציפראז electroporated-Co מתורגם ללוציפראז הפעיל, אשר על חילוף חומרים של D-וציפרין לoxyluciferin, פולט פוטון (איור 2 </strong&gt;). הארה וכתוצאה מכך יכולה להיות מזוהה במוחם של חולדות צעירות electroporated חיוביים בספקטרום IVIS עד גיל סביב 35 ימים לאחר לידה (איור 4). במחקר הנוכחי, ההדמיה assay לוציפראז ופליטת האור בוצעה החל משעת P7. נקודת זמן זו נבחרה כדי לאפשר לאם וגורים להתאושש מלחץ לידה. כאשר בתחילה לעבוד עם הגורים בP0, הישרדות גור הושפעה באופן חמור שהגורים נמצאו מתים או נאכלו על ידי האם. בתחילה, גורי חולדה עם electroporation המוצלח מזוהים על ידי תמונת 2D-פליטת אור עם זמן חשיפה של שלוש דקות. בהמשך לכך, גורים חיוביים משמשים ליצירת תמונות 3D כדי לציין את המיקום של אזור electroporated. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל מלח נתרן D-וציפרין ב PBS לריכוז של 15 מ&quot;ג / מיליליטר ולעקר אותה על ידי סינון דרך מסנן מזרק סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הגורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הגור ביד אחת עם הבטן על גבי ולמתוח את הבטן במקצת. הזרק 10 μl / גרם של משקל גוף של intraperitoneal פתרון וציפרין. לאלה ישנים יותר וזריזים יותר, מראש לטשטש את הגורים עם isoflurane בחדר האינדוקציה לפני הזרקת וציפרין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את זרם isoflurane של מערכת גז הרדמת XGI-8 בתוך ספקטרום IVIS עם isoflurane 3%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את החוטם של בעל החיים לתוך הקונוסים האף זכוכית של מערכת ההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק את בעלי החיים בתנוחת שכיבה עד שהוא בהרדמה עמוקה (2-3 דק &#39;). לאחר מכן להפחית את זרם isoflurane 1.5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מדידת 2D-פליטת אור כדי לבחור גורים חיוביים מכל ההמלטה. השתמש בהגדרות הבאות <img alt="מסך 1" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen1.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר checkmark על צילום עם binning הבינוני וF / עצור בשעה 8, המצלמה לוקחת את התמונה מלמעלה לאחר תחילת המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן עירור קבע: בלוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר מסנן פליטה: פתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר Binning עד בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר F / עצור בבית 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א &#39;רמת שלב הגדרה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר זמן חשיפת הארה 180 שניות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצירת תמונות 3D על מנת לכמת טוב יותר את אזור electroporated מהגורים החיוביים, להשתמש בהגדרות DLIT הבאות לגחלילית בלוציפראז. <img alt="מסך 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר סימן ביקורת על צילום; המצלמה לוקחת את התמונה מלמעלה לאחר תחילת המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר סימן ביקורת על מבנה, את פני השטח של החיה נסרק על ידי IVIS לפני מדידת פליטת אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Use הבא מסנני פליטה וגדרות זמן חשיפה עד לגיל שבועיים: מסנן פליטה 1: 590 ננומטר, שניות 300 זמן חשיפה פליטת מסנן 2: 600 ננומטר, שניות 240 זמן חשיפה פליטת מסנן 3: 620 ננומטר, שניות 180 זמן חשיפה מסנן פליטה 4: 640 ננומטר, שניות 120 זמן חשיפה לחולדות מבוגרות יותר P20 מסנן פליטה 1: 600 ננומטר, שניות 300 זמן חשיפה פליטת מסנן 2: 620 ננומטר, שניות 300 זמן חשיפה פליטת מסנן 3: 640 ננומטר, שניות 300 זמן חשיפה <img alt="מסך 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> כתוצאה מהירידה בעוצמת אות בבעלי חיים מבוגרים יותר, את זמן החשיפה מוגדל לשלושה מסנני הפליטה הטובים ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמת השלב ב &#39;שנקבע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר Binning עד בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר F / עצור ב1 </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדידה, mar<html> k החולדות על ידי קוד אוזן של כדי להבדיל אותם אחד מהשני וכדי להתאים אותן לתמונות בשידור חי IVIS ההדמיה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של הליך המדידה, לכבות את זרם isoflurane ולשמור את העכברוש על הצלחת מחוממת לכמה דקות לפני שהחזרת אותו לכלוב שלה. </li></ol> 3. ניתוח של תמונות פליטת אור הדור של תמונות 3D, סרטי 3D והכימות של עוצמת הקול של מקור האות נעשה על ידי תוכנת תמונת חיים מותקנים מראש על ספקטרום IVIS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דור של תמונות 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לשחזר טופוגרפיה משטח, ולכן נקבע סף שבין 20-30%. <img alt="מסך 4" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen4.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="מסך 5" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen5.jpg" /> 6 &quot;src =&quot; een / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg &quot;/&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל שחזור 3D DLIT עם סף תמונה של 10% לכל אורך גל. <img alt="מסך 7" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen7.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen7large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="מסך 8" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen8.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen8large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="מסך 9" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen9.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen9large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור סרטי 3D באמצעות לחצן הנפשת בתוך סרגל הכלים 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אוריינטציות שונות של תמונת 3D, כמו גם נופי התקרבות כמסגרות מפתח ולחץ על &#39;# שיא &amp;39; כפתור, הקלטת המעבר מתפקיד אחד / נטייה למשנו. <img alt="מסך 10" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen10.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen10large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> </li></ol></li></ol> 4. בדיקת התנהגות בדיקות התנהגותיות בוצעו על מנת לקבוע אם מניפולציות גנטיות בתיווך IUE בחולדה עשויות ליזום השפעות ארוך טווח שנמשכות אל הבגרות. במקרה הספציפי הנוכחי, ההשפעה חולפת, ביטוי יתר חד צדדי באורך מלא DISC1 אדם קליפת המוח לאחר IUE נחקרה על ידי בדיקת תנועה בשדה פתוח (של), עם ובלי מינון נמוך של אמפטמין, כמבחן ספציפי לדופמין קשור התנהגות 24. בהליך דומה שבוצע על ידי Niwa et al. בעכברי IUE באמצעות מציאה DISC1, עכברי IUE אך לא שולט הראה רגישות יתרלאמפטמין 18. חולדות שברחם electroporated עם וקטור ביתר DISC1 נערכו בתנאי מעבדה עם שעות 12 אור 7:00-07:00 והיו כרצונך נמאס. בגיל 3 חודשים, חולדות עברו בדיקות התנהגותיות. לכימות תנועה כקריאת נתונים של תופעות אמפטמין, השטח פתוח של מערכת פעילות Tru סריקה ממוקמת בתא צליל והאור בודד היה בשימוש. מערכת זו מודדת את משך הזמן ולהרחיק את המהלכים של בעלי החיים, הזמן והמרחק בילו בשוליים או במרכזו של השדה הפתוח, כמו גם גידול התנהגות 25. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הראשון, לבדוק לאחר הזרקה מי מלח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק intraperitoneally משקל גוף μl 1 / גרם של תמיסת מלח (1x PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר ההזרקה, לשים את בעל החיים לתוך השטח הפתוח ולהתחיל את המדידה של מערכת TruScan. שיא 15 דקותד לחלק את הנתונים ל3 X 5 חלקי דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את בעלי החיים בחזרה לכלוב בבית שלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום שני, מבחן על הזרקת אמפטמין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק intraperitoneally משקל גוף μl 1 / גרם של 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון אמפטמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר ההזרקה לשים את בעל החיים לתוך השטח הפתוח ולהתחיל את המדידה של מערכת TruScan. שיא 15 דקות ולחלק את הנתונים ל3 X 5 חלקי דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את בעל החיים לכלוב בבית שלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תנועה והתנהגות גידול שנוצרה על ידי תוכנת Tru סריקה ספציפית. יצירת גרפים עם GraphPad (פריזמה) ולחשב נתונים סטטיסטיים על ידי תוכנת הסטטיסטיקה SPSS. </li></ol>

<ol>
	<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).</li><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8.">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li><li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E16+Rat+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).</li><li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+Electroporation+followed+by+Primary+Neuronal+Culture+for+Studying+Gene+Function+in+Subset+of+Cortical+Neurons.">In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).</li><li>Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155 (2002).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+generation,+migration,+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation.">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J Comp Neurol. 483, 329-340 (2005).</li><li>Young-Pearse, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+function+for+beta-amyloid+precursor+protein+in+neuronal+migration+revealed+by+in+utero+RNA+interference.">A critical function for beta-amyloid precursor protein in neuronal migration revealed by in utero RNA interference.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 27, 14459-14469 (2007).</li><li>Niwa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+DISC1+by+in+utero+gene+transfer+disturbs+postnatal+dopaminergic+maturation+in+the+frontal+cortex+and+leads+to+adult+behavioral+deficits.">Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits.</a> Neuron. 65, 480-489 (2010).</li><li>Sapir, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+balance+of+the+polarity+kinase+MARK2/Par-1+is+required+for+proper+cortical+neuronal+migration.">Accurate balance of the polarity kinase MARK2/Par-1 is required for proper cortical neuronal migration.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 5710-5720 (2008).</li><li>Weinberger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+neuropathology+to+neurodevelopment.">From neuropathology to neurodevelopment.</a> Lancet. 346, 552-557 (1995).</li><li>Murray, R. M., Lewis, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+schizophrenia+a+neurodevelopmental+disorder?.">Is schizophrenia a neurodevelopmental disorder?.</a> British Medical Journal. 295, 681-682 (1987).</li><li>Kamiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+schizophrenia-associated+mutation+of+DISC1+perturbs+cerebral+cortex+development.">A schizophrenia-associated mutation of DISC1 perturbs cerebral cortex development.</a> Nat Cell Biol. 7, 1167-1178 (2005).</li><li>Miyoshi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted-In-Schizophrenia+1,+a+candidate+gene+for+schizophrenia,+participates+in+neurite+outgrowth.">Disrupted-In-Schizophrenia 1, a candidate gene for schizophrenia, participates in neurite outgrowth.</a> Mol Psychiatry. 8, 685-694 (2003).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+in+schizophrenia+1+regulates+neuronal+progenitor+proliferation+via+modulation+of+GSK3beta/beta-catenin+signaling.">Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling.</a> Cell. 136, 1017-1031 (2009).</li><li>Millar, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+two+novel+genes+by+a+translocation+co-segregating+with+schizophrenia.">Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia.</a> Hum Mol Genet. 9, 1415-1423 (2000).</li><li>Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted-in-Schizophrenia+1+(DISC1)+is+necessary+for+the+correct+migration+of+cortical+interneurons.">Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 738-745 (2012).</li><li>Niwa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+DISC1+by+in+utero+gene+transfer+disturbs+postnatal+dopaminergic+maturation+in+the+frontal+cortex+and+leads+to+adult+behavioral+deficits.">Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits.</a> Neuron. 65, 480-489 (2010).</li><li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+as+a+tool+for+genetic+manipulation+in+vivo+to+study+psychiatric+disorders:+from+genes+to+circuits+and+behaviors.">In utero electroporation as a tool for genetic manipulation in vivo to study psychiatric disorders: from genes to circuits and behaviors.</a> The Neuroscientist : a Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry 18. , 169-179 (2012).</li><li>Bai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex.">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. 6, 1277-1283 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 41, 335-344 (1999).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Featherstone, R. E., Kapur, S., Fletcher, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amphetamine-induced+sensitized+state+as+a+model+of+schizophrenia.">The amphetamine-induced sensitized state as a model of schizophrenia.</a> Progress in Neuro-psychopharmacology &amp; Biological Psychiatry. 31, 1556-1571 (2007).</li><li>Pum, M., Carey, R. J., Huston, J. P., Muller, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociating+effects+of+cocaine+and+d-amphetamine+on+dopamine+and+serotonin+in+the+perirhinal,+entorhinal,+and+prefrontal+cortex+of+freely+moving+rats.">Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats.</a> Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li></ol>

המחברים של מחקר זה אינו בעלי עניין כספי במחקר זה ולא קבלו את חסותם על ידי תעשייה למחקר זה. דמי גישה פתוחה היו שנתרמו על ידי הודעה פרסום PerkinElmer בע&quot;מ.

המחקר שלנו מוכיח כי IUE מתאים כדי ליצור חולדות מבוגרים עם נוירונים להביע transgene באזור סלקטיבית של המוח וכי, כתוצאה מהתערבות זו, בעלי חיים אלה מציגים שינויים בהתנהגות המצביעים על הפונקציונליות של המניפולציה שבוצעה. במחקר זה, כדוגמא, חולדות overexpressing DISC1 באופן חד צדדי בחלק קטן של קליפת המוח הקדם חזיתית הראו רגישות יתר כלפי אמפטמין (איור 9). בחירת חולדות להצלחת electroporation ידי in vivo הדמיה פליטת אור הייתה יעילה בשליטה על השונות הטבועות של transfection תא IUE ויושם כדי ליצור קבוצות עם אזור IUE הומוגנית של השתנות בין נושא נמוכה לחקירות מאוחר יותר. במחקר זה, שלא הצליחו לבחור גורי Electroporated מההמלטה על ידי זיהוי של הקרינה-Induced GFP electroporated השותף בבעלי החיים שזה עתה נולד, אפילו thoאיכס באותו הזמן ובאותה החיה אות פליטת אור של לוציפראז אותה מידת שיתוף electroporated-ניתן הייתה לזהות לאחר הזרקת וציפרין (איור 6), וה-GFP להביע נוירונים היו עדיין קיימת במוח בגיל שישה חודשים. אנו מסיקים כי, בחולדה, תגובת לוציפראז / וציפרין הוא מתאים היטב כדי לבדל את בעלי חיים עם מוח electroporated המוצלח (איור 3). ניטור כמותי של הצלחה IUE מתייחס לעוצמת אות פליטת אור הנמדדת על ידי הספירה של פוטונים באותו זמן חשיפה (איור 3) ומתאים לפעילות האנזימטית של בלוציפראז הביע משנה. אותות פליטת אור קטנים הם לגילוי על ידי 100-200 סעיפים של פוטונים, ו, בזוהר של ~ 1,000-2,000 תאים מוכתמים GFP 1x10 4 פוטונים / sec / cm 2 / מופע steradian בהיסטולוגיה במוח החולדה בן 6 חודשים. חד פעמי האות הגבוה ביותרlayed זוהר של עד ~ 5x10 6 פוטונים / השני / / 2 סנטימטר steradian ו~ 64,000 סעיפים. בזן העכברים ספראג Dawley משמש, צפינו היחלשות אות פליטת אור אורכים עם עלייה בגיל והאות נעלמה מעבר לגיל P35 (איור 4). בשלב זה, אנחנו לא יודעים אם גם הארעיים, ביטוי הווקטור מבוסס פלסמיד של בלוציפראז פוחת, או אם אות פליטת אור מחלישה בשל מסת הגדלת מוח, או שניהם גורמים לאות נעלמת. עבור assay הפונקציונלי קיימים בחולדות המבוגרים, מבחר למחקרים התנהגותיים שרק עשה המבוסס על מיקומו של האות, אבל לא על ידי עוצמת אות פליטת אור. למרות שניטור פליטת אור כמותיים 3D אפשר הבחנה בין אזורי electroporated השונים (איור 5), accurateness היה מוגבל לתאים הנמצאים באגורת העומקnsion של המוח. איור 6 מראה דוגמא של electroporation בהיפוקמפוס שבו מדידת פליטת אור ב2D and 3D התמונה מצויינים מיקום טוב של electroporation. במוח שלאחר המוות גזור, אות ה-GFP-הקרינה זוהתה בערך באותו המצב כמו אות פליטת אור, המצביעה על מיקוד נכון של ההיפוקמפוס. אבל תוכניות היסטולוגיה שגם תאים בקליפת המוח הגבית של ההיפוקמפוס היו ממוקדים (איור 7). זה מצביע על כך assay פליטת אור הוא כלי שימושי כדי לזהות גורים חיוביים, IUE וגם יש לי רעיון של אזור electroporated, אבל סופו של דבר, הדמיה לא יכולה להחליף היסטולוגיה מורטם הודעה בדיוק למקם תאים ממוקדים באופן חיובי. ההפגנה שלנו מצביעה על הבטחה ליישום של טכנולוגית IUE ליצור מניפולציות ממוקדות עדינות של אזורים במוח בקליפת המוח או בהיפוקמפוס כדי לדמות aberrances בגהגירת ortical או פגמים התפתחותיות אחרים שעשוי להשפיע על בעלי החיים המבוגרים. בעוד electroporation הבילטראליים 26 יש את היתרון של השפעה צפויה גדולה יותר על התנהגות, יש גם יותר תמותה של עוברים. electroporation חד צדדי נבחר כדי להשוות בין שתי ההמיספרות עם אחד כבקרה פנימית, כמו גם להצגה שאפילו מניפולציה IUE באזור חד צדדי, קטן מספיק כדי לשנות את ההתנהגות. שינויים הנגרמים IUE בקישוריות או בארכיטקטורה בין הנוירונים ניתן אפוא להיגרם מבלי לעורר נגע וההתאמה הנדרשת של האזור להיות-מניפולציות-IUE עם מבחן התנהגותי המתאים תלוי בשאלה המדעית. ירי צרות גודל המלטה מופחת ישנן מספר הצעות בנוגע להגדלת ההישרדות של גורי IUE. ראשית, השימוש בנימי זכוכית דקות מאוד במהלך electroporation כדי למזער lesio רקמהn מומלץ. שנית, לא electroporate את העובר הראשון בסוף הנרתיק של כל קרן רחם: מותו של העובר שנולד הראשון מגדיל את הסיכוי של להפיל של כל עוברים האחרים. שלישית, לאחר לידה, חולדות אימהות לעתים קרובות להרוג חלק מצאצאיהם עקב מתח סביב הלידה. על מנת להפחית את לחץ נוסף, אל תתחילו עם ההדמיה לחיות מייד לאחר לידה, אבל לחכות לשבעה ימים. גילוי ה-GFP הקרינה של הגורים בשבוע לאחר לידה, אין אות של הקרינה או על ידי שימוש בהדמיה מיקרוסקופית הקרינה משקפת חי או דימות פלואורסצנטי עם IVIS הספקטרום (מצבי epifluorescence וtransfluorescence; לעירור ה-GFP / פליטה: 465/520 ננומטר ו500/540 ננומטר). יתכן ששניהם, ההולכה המוגבלת של אור עירור באורך גל והפליטה קצר דרך רקמות כמו הגולגולת ורקע autofluorescence הגבוה של העור למנוע באמצעות הקרינה תחת יורדribed תנאים בחולדה. כפי שניתן לראות באיור 6, אות לוציפראז בחי יכולה גם להתגלות במוח גזור (בלי גולגולת) ושם, גם אות הקרינה ניתן לזהות (איור 6 ד &#39;). בידול של פליטת אור באזורים במוח צפופים גם באיור 3D מיקומו של אזור פליטת אור לא ניתן לחזות ל100%. במיוחד תאים על גבי או מתחת לאזור חזה גם יכולים להיות ממוקדים בטעות וtransfected. המיקום המדויק צריך להיות נשלט על ידי היסטולוגיה נתיחה שלאחר המוות (הקרינה) (ראה איור 7).

הפיתוח של electroporation ברחם השיטה (IUE) המאפשר אפנון של ביטוי גנים במוח המתפתח, היה פריצת דרך שכן הוא אפשר לומד התפתחות נוירולוגית בקלות יחסית. 1-7 שינויים ברמות ביטוי של גן מטרה ב אזור ספציפי במוח במהלך התפתחות עוברית ו / או סביב הלידה במכרסמים הודגמו לביקורתי התפשטות ההשפעה עצבית, הגירה, arborization, וקישוריות. 8-10 סכיזופרניה היא מחלת נפש מורכבת עם תסמינים חריפים וכרוניים שכבר קשורים להפרעות התפתחותיות 11, 12 ולכן רבים מהגנים שזוהו המועמד לסכיזופרניה נחקרים להשפעות ויסות פוטנציאליות על התפתחות נוירולוגית, כמו למשל לשבש-in-סכיזופרניה גן -1 (DISC1) 13-15. התפתחות המוח היא regulated על ידי גורמים גנטיים ויחסי הגומלין שלהם עם סביבה אשר ממלאים תפקידים בתקופות טרום, פרי ולאחר לידה התפתחותית. גורם סיכון גנטי אחד עיקרי להפרעות התנהגותיות שונות הוא מוביל מציאה DISC1 16 גן. DISC1 פגמים הגירה בעכברים 13, 17, ומניפולציה של ביטוי DISC1 בקליפת המוח מתפתח על ידי IUE הוכח השפעה על התנהגותם של עכברים בוגרים 18. יש מניפולציה ביטוי גנים במוח על ידי IUE מספר יתרונות 19 על הדור של קווי בעלי חיים מהונדסים. ראשית, ביטוי גנים בתוך תחומי העניין יושג בתוך שבועות עד חודשים ולא כמה דורות של רבייה קווי מכרסם מהונדסים. שנית, מנגנוני פיצוי במהלך ההתפתחות מוקדמת שעשויה להגן על פנוטיפים בבעלי חיים מהונדסים בתאי מין 20 נמנעים. שלישית, באמצעות מיקוד רק אוכלוסיית תאים ספציפית או אזור הספציפי של המוח, migratiאו הבדלי התפשטות ניתן להשוות באופן ישיר עם הלא המוטציה או לשלוט בצד נגדי אם electroporations חד צדדי הם נבחרו. מצד השני, IUE אין את הדיוק של cre / תזמון מונחה אמרגן מושרה לקס ביטוי ורק subpopulation של התאים באזור מסוים הוא ממוקד שמוביל לסוג של פסיפס דפוס ביטוי גנים. עבור רבים יישומים ניסיוניים במכרסמים מבוגרים, transfection חולף של מספר מוגבל של תאים באזור במוח עשוי להיות מספיק, או אפילו רצויה, כך שהיתרון הגדול של מכרסמים יציבים, germline-מהונדס הוא זניח. למעשה, IUE כדאי לבדוק האם חלק מהתאים שפותחו באופן חריג עלולים להשפיע על רשת של תאים או מעגלים שלמה. יתרון נוסף עשוי להיות היכולת להדגים השפעות תאים אוטונומיים שאינן של גן בשל אופי הפסיפס של הלהיט. יתר על כן, הדור של חולדות מהונדסים ונוקאאוט הוא עדיין בחיתוליו והשימוששל IUE במין זה ללימוד השלכות התפתחות המוח סוטה הוא של ריבית גבוהה. עד כה, מכשול עיקרי של שימוש IUE לחקירת השלכות התערבות באותם בעלי חיים כבוגרים הוא חוסר ההצלחה electroporation ניטור. עד כה, ה-GFP-שיתוף transfected תאי עצב ניאון בגורי חולדה יילוד החי לא ניתן היה להבחין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי משקפת מתאים או עם דימות פלואורסצנטי של ספקטרום IVIS. כדי להתגבר על מכשול זה, אנו לשתף transfected גן כתב לוציפראז וביצעו הדמיה לחיות פליטת אור של גורים על ידי quantitation 3 ממדים (3D) של האזור במוח IUE. כדוגמא להוכחת הישימות של שיטה זו בassay פונקציונלי לאחר מכן בודקת את המניפולציה הגנטית התפתחותיות, הזרקה משותפת של פלסמידים המכילים DISC1 אנושי, לוציפראז, וה-GFP לתוך החדר לרוחב של עוברי עכברים <sup&gt; 3 ואחריו electroporation עם אלקטרודה פינצטה בוצעו. בעוד אותות הקרינה לא ניתן היה להבחין בשלבי לידה in vivo, אות פליטת אור מוצקה נובעת מחילוף חומרי וציפרין על ידי הגן בלוציפראז transfected השותף זוהתה עד חמישה שבועות לאחר לידה. 3D-מדידות של כימות האזור במוח electroporated אפשר לפיה גורים עם electroporation מספיק או במקום זוהו מלכתחילה, ובכך, מה שמאפשר ההקצאה של בעלי החיים IUE (גן של עניין ומקושקש שליטה) לקבוצות ניסוי עם התאמת אזורים במוח electroporated של השתנות נמוכה . השימוש בחולדות IUE בוגרות בפרדיגמות התנהגותי הודגמה כדוגמא לתועלת של פרוטוקול זה.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>without calcium, without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin, sodium salt</td>
			<td>SynChem OHG, Germany</td>
			<td>BC218</td>
			<td>CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>CAS: 2353-45-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Amphetamine</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>A 5880</td>
			<td>CAS: 51-63-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kodan Tinktur forte</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH, Germany</td>
			<td>104 005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material / product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Novato, California, USA</td>
			<td>borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Tujunga, California, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrode</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>7 mm in diameter platinum disc electrodes (<a href="http://www.sonidel.com/product_info.php?products_id=129" target="_blank">CUY650P7</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Straight, 12 cm (14002-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave pulse electroporator (CUY21SC)</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>(CUY21SC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl surgical suture material</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Norderstedt, Germany</td>
			<td>3-0; 2 Ph. Eur;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip Applicator</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Reflex 9 mm (12032-09)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Darmstadt, Germany</td>
			<td>0.45 &#956;m cellulose acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum</td>
			<td>Caliper Life Science / PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, MassachusettsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, Massachuset tsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-field</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td>(40 x 40 x 39 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tru Scan activity system</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="4">Table of recipes</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Number</td>
						<td>Buffer name</td>
						<td>Content</td>
						<td>Comments </td>
					</tr>
					<tr>
						<td>1</td>
						<td>DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing</td>
						<td>1.5 &#956;g/&#956;l pCAX humanDISC-1, 
						0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 
						10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixture are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>2</td>
						<td>DNA-Mixure for control</td>
						<td>0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA1, 0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA2, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAGGS-GFP 10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixure are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>3</td>
						<td>Fast green Dye</td>
						<td>10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>4</td>
						<td>D-luciferin solution</td>
						<td>15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>5</td>
						<td>Amphetamine solution</td>
						<td>0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of topically transgenic rats by in utero electroporation and in vivo bioluminescence screening

<html> ב electroporation ברחם (IUE) היא טכניקה המאפשרת שינוי גנטי של תאים במוח לחקר התפתחות עצבית. עד כה, השימוש בIUE לחקירת התנהגות או neuropathology במוח הבוגר היה מוגבל על ידי שיטות מספיקות לניטור ההצלחה transfection IUE ידי טכניקות לא פולשנית בבעלי חיים לאחר לידה של. לצורך המחקר הנוכחי, חולדות E16 שימשו לIUE. לאחר הזרקה תוך חדרי של חומצות גרעין לעוברים, מיקום של האלקטרודות פינצטה היה קריטי למיקוד או קליפת המוח מתפתח או היפוקמפוס. חדרית הזרקה משותפת וelectroporation של ניטור גן בלוציפראז מוותר של תאי transfected לאחר לידה לאחר הזרקת וציפרין intraperitoneal בגור P7 החי מורדם על ידי in vivo פליטת אור, תוך שימוש במכשיר IVIS ספקטרום עם תוכנת כימות 3D. class = &quot;jove_content&quot;&gt; אזור הגדרה על ידי פליטת אור באופן ברור יכולה להבדיל בין electroporations קליפת המוח והיפוקמפוס ולזהות אות אורכים לאורך זמן של עד 5 שבועות לאחר לידה. טכניקת הדמיה זו אפשרה לנו לבחור גורים עם מספר מספק של תאי transfected הנחה הכרחיים למפעילים השפעות ביולוגיות, ולאחר מכן, לבצע חקירות התנהגות ב3 חודשים של גיל. כדוגמא, מחקר זה מוכיח כי IUE עם הגן האנושי באורך מלא DISC1 אל קליפת מוח העכברוש הוביל לרגישות יתר אמפטמין. GFP transfected-Co ניתן היה לזהות בתאי עצב בדואר מיקרוסקופ פלואורסצנטי מורטם בcryosections המציין ביטוי גנים נוכח ב≥ 6 חודשים לאחר לידה. אנו מסיקים כי הדמיה פליטת אור לאחר לידה מאפשרת הערכת ההצלחה של transfections החולף עם IUE בחולדות. חקירות על ההשפעה של מניפולציות גנטיות אקטואליים במהלך neurodevelopmenלא במוח הבוגר והקישוריות שלה הם הקלו באופן משמעותי. עבור רבים שאלות מדעיות, טכניקה זו יכולה להשלים או אפילו להחליף את השימוש של חולדות מהונדסים ומספקת טכנולוגיה חדשנית למדעי המוח התנהגותיים.

<html> איור 3 הופעות חי מדידות הדמיה של שלושה גורי חולדה ב P7 לאחר ההזרקה של וציפרין / קילוגרם משקל גוף 150 מ&quot;ג. הבדלים של עוצמת אות מציינים את השונות ביעילות של IUE גלויים. אותות פליטת אור חזקים נרשמו עד P36 (איור 4). באיור 5, את היכולת להגדיר electroporation קליפת המוח (5A דמויות ו5C) והיפוקמפוס (5B דמויות ו5D) על ידי הדמיה פליטת אור מתוארת. קורלציה של אות פליטת אור (איור 7 א) עם אות הקרינה שלה לאחר הסרת גולגולת (איור 7) ותאי ה-GFP-electroporated המקביל במוח cryosectioned (איור 8) בשעה P14 מתוארת באיורים 6-8. ראוי לציין, שלא היה זיהוי של אות הקרינה בחולדות חיות בכל נקודת זמן. אוהל &quot;&gt; בvivo הדמיה פליטת אור מאפשרת אפליה מקורבת של אזורים במוח electroporated השונים על ידי 2D (5A דמויות ו5 ב) שהוא השתפר מאוד עם תכנית DLIT של תוכנת IVIS ספקטרום יצירת תמונות 3D (5 ג דמויות ו5D). בדוגמאות שמוצגת , Electroporation של קליפת המוח הקדם חזיתית בהיפוקמפוס ויכול להיות מכובד. יש לציין כי בעוד במטרה electroporate ההיפוקמפוס, יכולים להיות גם פגעו בכמה תאי אב לגב הקליפה שוכבת של ההיפוקמפוס (איור 7). חולדות באופן חד צדדי ברחם electroporated עם וקטור pCAX לתוך קליפת המוח, ולאחר מכן ביתר DISC1 האנושי באורך מלא נחקרו על שני ספונטני והיפראקטיביות מושרה אמפטמין כבוגרים. חולדות electroporated עם pCAX-DISC1 היו רגישות למינון נמוך של אמפטמין. חולדות אלה עברו באופן משמעותי את מומחדש לאחר טיפול אמפטמין מאשר לאחר ההזרקה מי מלח, ואילו בעלי שליטה לא (איור 10). <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig1.jpg" /> איור 1. ערכה של עמדת אלקטרודה ל) electroporation electroporation קליפת המוח ו-B) בהיפוקמפוס, ירוקה = הזריק DNA-Mix בתוך החדר. <img alt="איור 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig2.jpg" /> איור 2. תגובת לוציפראז. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig3.jpg" /> איור 3. מדידת הארה של חולדות P7 לאחר ההזרקה של 150 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף luciferine; זמן חשיפה 180 שניות;) חולדה ללא אות הארה; B) חולדה<html> עם אות פליטת אור חלשה; חולדה C) עם אות הארה חזקה. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig4.jpg" /> איור 4. קו זמן של מדידות פליטת אור ברציפות מאותו העכברוש לאחר ההזרקה של 150 luciferine מ&quot;ג / קילוגרם הוכחת חלון זמן שבו הצלחה גדול IUE ניתן לאתרם. <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig5.jpg" /> . איור 5 איור של הבדלים בין electroporation קליפת המוח והיפוקמפוס ב P7) וארוחת בוקר) תמונות 2D;. C) &amp; D) תמונות 3D;) &amp; C) מקליפת המוח; B) &amp; D) מההיפוקמפוס.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg &quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה. <img alt="איור 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig6.jpg" /> איור 6. איור של electroporation E16 היפוקמפוס של גור חולדה בP14) 2D-תמונה של פליטת אור B) איור 3D של C אות פליטת אור) גזור מוח עם האות D פליטת אור) מוח עם אות EPI-GFP פלואורסצנטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146fig6large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig7.jpg" /> איור 7. פירוט של תמונת הקרינה מסעיף cryo 20 מיקרומטר של אותו מוח החולדה P14 electroporated עם פלסמיד המכיל GFP ולוציפראזוקטור, מכתים גרעינים עם DAPI; CA1-3 = קורנו Ammonis 1-3; DG = המשונן gyrus; FC = Fasciolarum cinereum. וידאו 1. 3D אנימציה של ההיפוקמפוס electroporated עכברוש בP14. <img alt="איור 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig8.jpg" /> איור 8. ערכת מבחן אמפטמין: הזרקה מי מלח ביום הראשון לפני משפט 15 דקות, 24 שעות מאוחר יותר אמפטמין הזרקה לפני הבדיקה בתא השטח הפתוח. <img alt="איור 9" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig9.jpg" /> איור 9. מבחן אמפטמין. גרף עמודות מראים מרחק שעבר (בסנטימטרים) של בעלי החיים שתועדו על ידי מערכת TrueScan מעל 15 ברים לבנים = קבוצת ביקורת דקות;. פסים אפורים = קבוצת overexpressing DISC1; קבוצת ביקורת n = 10; קבוצת ביטוי יתר DISC1 n = 11; ANOVA: geno * p = טיפול 0.043; מבחן t למלוח זמן כולל לעומת NS אמפטמין = לא pcontrol המשמעותי = 0.172, pDISC1 = 0.001.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening at JoVE.com

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

ניתן להשפיע על גנים בזמן ההתפתחות של קליפת המוח או ההיפוקמפוס של החולדות באמצעות electroporation ברחם (IUE) בE16, כדי לאפשר שינויים מהירים וממוקד בקישוריות עצבית למחקרים מאוחרים יותר של התנהגות או neuropathology בבעלי חיים מבוגרים. אחרי לידה בתחום ההדמיה vivo על שליטה בהצלחת IUE מתבצעת על ידי פליטת אור של הפעלת לוציפראז transfected השותף.

דור של חולדות למריחה מהונדסים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation ו<em&gt; בvivo</em&gt; הקרנת פליטת אור

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

generation-topically-transgenic-rats-utero-electroporation-vivo

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

13.4K Views.  Medical School Düsseldorf.  ניתן להשפיע על גנים בזמן ההתפתחות של קליפת המוח או ההיפוקמפוס של החולדות באמצעות electroporation ברחם (IUE) בE16, כדי לאפשר שינויים מהירים וממוקד בקישוריות עצבית למחקרים מאוחרים יותר של התנהגות או neuropathology בבעלי חיים מבוגרים. אחרי לידה בתחום

Video: Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In vivo ג&#39;ין העברה בתאי שוואן בעצב מכרסמים Sciatic ידי Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein prionoids, which cause neuropathology within the central nervous system (CNS). Here we describe that intraglossal or intraperitoneal injection of alpha-synuclein fibrils into bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which overexpress human alpha-synuclein with the A53T mutation from the prion protein promoter and firefly luciferase from the promoter for glial fibrillary acidic protein (Gfap), is sufficient to induce neuropathologic disease. In comparison to homozygous Tg(M83+/+) mice that develop severe neurologic symptoms beginning at an age of 8 months, heterozygous Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) animals remain free of spontaneous disease until they reach an age of 22 months. Interestingly, injection of alpha-synuclein fibrils via the intraperitoneal route induced neurologic disease with paralysis in four of five Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice with a median incubation time of 229 &#177;17 days. Diseased animals showed severe deposits of phosphorylated alpha-synuclein in their brains and spinal cords. Accumulations of alpha-synuclein were sarkosyl-insoluble and colocalized with ubiquitin and p62, and were accompanied by an inflammatory response resulting in astrocytic gliosis and microgliosis. Surprisingly, inoculation of alpha-synuclein fibrils into the tongue was less effective in causing disease with only one of five injected animals showing alpha-synuclein pathology after 285 days. Our findings show that inoculation via the intraglossal route and more so via the intraperitoneal route is suitable to induce neurologic illness with relevant hallmarks of synucleinopathies in Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice. This provides a new model for studying prion-like pathogenesis induced by alpha-synuclein prionoids in greater detail.

Peripheral injection of alpha-synuclein fibrils into the peritoneum or tongue of Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which express human alpha-synuclein with the familial A53T mutation and firefly luciferase, can induce neuropathology, including neuroinflammation, in their central nervous system.