Los autores agradecen a Tracy Young-Pearse y Atsushi Kamiya para proporcionar plásmidos. Este trabajo fue financiado por NEURON-ERANET DISCover a O y CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) para CK, y (DE 792/2-4) para MASS

Todos los experimentos con animales fueron autorizados por el responsable Landesministerium für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW, 87-51.05.2010.A301), de conformidad con la legislación nacional y europea. 1. En el útero de electroporación Este método ha sido descrito en detalle en JoVe para la rata por Walantus et al. 3, así como Rice et al. 4 y se resumen aquí sólo brevemente. Un tamaño de la camada de 6-8 cachorros se obtiene un buen resultado. Debe haber por lo menos dos embriones no electroporadas con el fin de aumentar la tasa de supervivencia global (ver más abajo). <ol><li> Preparar ADN-Mezcla que contiene 1,5 g / l de meta-plásmido (shRNA: pENTR-U6; Invitrogen, Eugene, Oregón / DISC1 sobreexpresión: pCAX 21), 0,5 g / l de luciferasa que contiene el plásmido (pCAX), 0,5 g / l de GFP que contiene el plásmido (pCAGGS 22) en 1x PBS solución teñida azul ligeroe con Fast Green Dye. </li><li> Preparar agujas de inyección de capilares de vidrio con una aguja de pipeta Extractor. Y esterilizar instrumentos quirúrgicos, ya sea en autoclave o por incubación con un desinfectante a base de alcohol (Kodan Tinktur forte). </li><li> Administrar una dosis pre-operatorio de la buprenorfina (0,05 mg / kg) 15 min antes de la cirugía a una rata preñada 16 días después de la fertilización (E16). Entonces anestesiar al animal en una cámara de isoflurano. <ol><li> Tras la anestesia, colocar la rata en una posición supina en una mesa de operación de calentado-C 37 ° con la máscara de respiración conectado al dispositivo de anestesia, mediante configuración de oxígeno a 0,4 L / min y isoflurano en 1,8%. </li><li> Después de afeitarse el abdomen, desinfectar la zona afeitada tres veces con Kodan Tinktur Forte (un desinfectante a base de alcohol). </li><li> Cubra la rata con paños estériles, exponiendo sólo el campo de operación afeitado. </li></ol></li><li> Realizar en el útero de la electroporación. <ol><li> Cortar el abdomen con un scissor lo largo de la línea alba (~ 2 cm). </li><li> Exponer los cuernos uterinos con cuidado con unas pinzas de anillo. </li><li> Tenga cuidado de mantener la pared del útero húmedo con PBS estéril calentado durante toda la cirugía. </li><li> Inyectar la solución de ADN con una aguja de vidrio fina en uno del ventrículo lateral de los embriones. </li><li> Coloque el electrodo 7 mm alrededor de la cabeza del embrión. Para golpear una población de células de las capas corticales superiores, realice el IUE en E16 23 y coloque el electrodo positivo en el hemisferio por encima del ventrículo inyectado con una ligera tendencia dorsal / lateral. Para dirigirse a las células del hipocampo cambian la colocación de los electrodos positivo hacia el lado opuesto de la ventrículo inyectado con lateral a ligeramente dirección dorsal (Figura 1). </li><li> Lleve a cabo la electroporación por cinco pulsos 50 ms a 55 V con 950 saltos ms con una onda cuadrada electroporador pulso. </li><li> Piezas de la primera embrión en el extremo vaginal de cada cuerno uterino con el fin de aumentar la Tque las posibilidades de supervivencia de todos los embriones. </li><li> Ponga los cuernos del útero de nuevo en la rata madre. </li><li> Stich de la pared abdominal con un material de sutura quirúrgica absorbible Vicryl. </li><li> Cierre la piel con el material de sutura Vicryl o con clips de sutura. </li><li> Coloque la rata madre de nuevo en la jaula y mantenerlo caliente durante 2-3 horas. </li><li> Mantenga las ratas solo en su jaula en la sala de instalaciones de animales y se alimentan ad libitum. Dan a luz entre E22-24. </li><li> Mantenga las crías de rata con su madre durante tres semanas y luego separarlos por sexo. </li></ol></li></ol> 2. La bioluminiscencia de imágenes en vivo de la reacción enzimática de luciferasa Este método se utiliza para analizar la posición de las células transfectadas en el útero. Electroporación-Co ADNc de luciferasa de luciérnaga se traduce en luciferasa activa, que, después de la metabolización de D-luciferina a oxiluciferina, emite un fotón (Figura 2 </strong&gt;). La luminiscencia resultante se puede detectar en el cerebro de ratas jóvenes a electroporación positivos en un espectro IVIS hasta la edad de alrededor de 35 días después del nacimiento (Figura 4). En el presente estudio, se realizó el ensayo de luciferasa de imágenes y bioluminiscencia comenzando en P7. Este punto de tiempo fue elegido para permitir la madre y los cachorros para recuperarse del estrés del nacimiento. Cuando se trabaja inicialmente con los cachorros en P0, supervivencia de las crías se vio gravemente afectada en que los cachorros fueron encontrados muertos o ingeridos por la madre. Inicialmente, las crías de rata con electroporación con éxito son identificados por una imagen 2D-bioluminiscencia con un tiempo de exposición de tres minutos. Posteriormente, cachorros positivos se utilizan para crear imágenes en 3D con el fin de especificar la ubicación de la zona a electroporación. <ol><li> Diluir la sal de sodio-D luciferina en PBS a una concentración de 15 mg / ml y esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa estéril. </li><li> Sopesar los cachorros. </li><li> Tome el cachorro en una mano con el abdomen en la parte superior y estirar el abdomen ligeramente. Inyectar 10 l / g de peso corporal de luciferina intraperitoneal solución. Para los más viejos y más ágiles, pre-anestesiar a los cachorros con isoflurano en la cámara de inducción antes de la inyección de la luciferina. </li><li> Encienda la afluencia isoflurano del Sistema Gasista Anestesia XGI-8 dentro del espectro IVIS con 3% de isoflurano. </li><li> Ponga el hocico del animal en los conos de ojiva de cristal del Sistema de Anestesia. </li><li> Mantenga el animal en una posición boca abajo hasta que esté en anestesia profunda (2-3 min). Entonces reducir la afluencia isoflurano al 1,5%. </li><li> Elija una medición 2D-bioluminiscencia para seleccionar cachorros positivos de toda la camada. Utilice la siguiente configuración <img alt="Pantalla 1" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen1.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <ol><li> Establezca un CHECkmark en la fotografía con binning medio y F / Stop a las 8, la cámara toma una foto desde arriba después de comenzar la medición. </li><li> Establece filtro de excitación: bloque. </li><li> Establece filtro de emisiones: abierto. </li><li> Establecer Binning a medio. </li><li> Set F / Stop en 1. </li><li> Ajuste el nivel de la etapa A. </li><li> Establecer luminiscencia tiempo de exposición a 180 seg. </li></ol></li><li> Para la creación de imágenes en 3D con el fin de cuantificar mejor el área a electroporación de los cachorros positivos, utilice la siguiente configuración DLIT de luciferasa de luciérnaga. <img alt="Pantalla 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <ol><li> Establecer una marca de verificación en la fotografía, la cámara toma una foto desde arriba después de comenzar la medición. </li><li> Establecer una marca de verificación en la estructura, la superficie del animal se escanea por el IVIS antes de la medición de bioluminiscencia. </li><li> USE siguientes filtros de emisión y los ajustes de tiempo de exposición hasta la edad de dos semanas; Filtro de Emisiones 1: 590 nm, tiempo de exposición de 300 segundos Filtro de Emisiones 2: 600 nm, tiempo de exposición 240 sec Filtro de emisión 3: 620 nm, tiempo de exposición de 180 segundos Filtro de emisión 4: 640 nm, tiempo de exposición de 120 segundos Para las ratas mayores de P20 Filtro de Emisiones 1: 600 nm, tiempo de exposición de 300 segundos Filtro de Emisiones 2: 620 nm, tiempo de exposición de 300 segundos Filtro de emisión 3: 640 nm, tiempo de exposición de 300 segundos <img alt="Pantalla 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . Debido a la disminución de la intensidad de la señal en los animales más viejos, el tiempo de exposición se amplía para los tres mejores filtros de emisión. </li><li> Ajuste el nivel de la Etapa B </li><li> Establecer Binning a medio. </li><li> Set F / Stop en 1 </li></ol></li><li> Después de la medición, mar<html> k las ratas por un código earhole para diferenciarlos unos de otros y hacerlo coincidir con las imágenes en vivo de imágenes IVIS </li><li> Al final del procedimiento de medición, apague afluencia isoflurano y mantener la rata en la placa calentada durante algunos minutos antes de volver a su jaula. </li></ol> 3. Análisis de la bioluminiscencia Imágenes La generación de imágenes en 3D, películas en 3D y la cuantificación del volumen de la fuente de la señal se realiza mediante el software Living Image preinstalado en el espectro IVIS. <ol><li> Generación de imágenes en 3D <ol><li> En primer lugar, la reconstrucción de una topografía de la superficie, por lo tanto, establecer el umbral entre el 20-30%. <img alt="Pantalla 4" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen4.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Pantalla 5" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen5.jpg" /> een 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg &quot;/&gt; </li><li> Comience reconstrucción DLIT 3D con un umbral de imagen del 10% para cada longitud de onda. <img alt="Pantalla 7" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen7.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Pantalla 8" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen8.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Pantalla 9" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen9.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . </li><li> Cree películas en 3D utilizando el botón animar dentro de la barra de herramientas 3D. </li><li> Elige diferentes orientaciones de la imagen 3D, así como vistas de zoom como fotogramas clave y pulse el &#39;Record &amp; #39, el botón, la grabación de la transición de una posición / orientación a otra. <img alt="Pantalla 10" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen10.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . </li></ol></li></ol> 4. Las pruebas de comportamiento Las pruebas de comportamiento se realizó con el fin de determinar si la manipulación de genes mediados por IUE en ratas podrían iniciar efectos a largo plazo que persisten en la edad adulta. En el presente caso, el efecto de los transitorios, unilateral de larga duración DISC1 humana cortical sobreexpresión después IUE fue investigado por probar la locomoción en un campo abierto (OF), con y sin una dosis baja de la anfetamina, como una prueba específica para la dopamina relacionada comportamiento 24. En un procedimiento similar realizado por Niwa et al. En ratones IUE utilizando caída DISC1, los ratones IUE pero no los controles mostraron hipersensibilidada la anfetamina 18. Las ratas que fueron en el útero a electroporación con un vector que sobreexpresa DISC1 se llevaron a cabo en condiciones de laboratorio con 12 h de luz 07 a.m.-7 p.m. y se alimentaron ad libitum. A los 3 meses de edad, las ratas se sometieron a pruebas de comportamiento. Para la cuantificación de la locomoción como una lectura de los efectos de la anfetamina, un campo abierto de un sistema de actividad Tru Scan situado en una cámara de sonido y de luz aislados se utilizó. Este sistema mide el tiempo de duración y distancia el animal se mueve, el tiempo y la distancia que pasó en el margen o en el centro del campo, así como la cría de comportamiento 25. <ol><li> En el primer día, pruebe después de la inyección de solución salina <ol><li> Pesar los animales. </li><li> Inyectar por vía intraperitoneal 1 l / g de peso corporal de una solución salina (PBS 1x). </li><li> Inmediatamente después de la inyección, el sacrificio del animal en el campo abierto y comenzar la medición del sistema TruScan. Registro durante 15 minutos unad subdividir los datos en 3 x 5 partes min. </li><li> Ponga el animal de nuevo en su jaula. </li></ol></li><li> Segundo día, prueba en la inyección de anfetamina <ol><li> Pesar los animales. </li><li> Inyectar por vía intraperitoneal 1 l / g de peso corporal de una solución de anfetamina 0,5 mg / ml. </li><li> Inmediatamente después de la inyección de sacrificio del animal en el campo abierto y comenzar la medición del sistema TruScan. Registro durante 15 min y subdividir los datos en 3 x 5 partes min. </li><li> Volver al animal a su jaula. </li></ol></li><li> Analizar la locomoción y el comportamiento de crianza generado por un software específico Tru Scan. Crear gráficos con GraphPad (Prism) y calcular las estadísticas por el software de SPSS Statistics. </li></ol>

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Los autores de este estudio no tienen interés financiero en este estudio y no han sido patrocinados por la industria para este estudio. Las tarifas de acceso abierto fueron aportados por correo publicación PerkinElmer Inc..

Nuestro estudio demuestra que la IUE es adecuado para generar ratas adultas con neuronas que expresan un transgén en un área selectiva del cerebro y que, como resultado de esta intervención, estos animales presentan cambios en el comportamiento que indica la funcionalidad de la manipulación realizado. En este estudio, como un ejemplo, las ratas que sobreexpresan DISC1 unilateralmente en una pequeña parte de la corteza prefrontal mostraron hipersensibilidad hacia la anfetamina (Figura 9). Selección de las ratas para el éxito de la electroporación in vivo por imágenes de bioluminiscencia fue eficaz en el control de la variabilidad inherente de la transfección de células IUE y se aplicó para generar grupos con una superficie IUE homogénea de baja variabilidad interindividual para investigaciones posteriores. En este estudio, hemos podido seleccionar cachorros de la camada a electroporación mediante la detección de la fluorescencia inducida por GFP-co-electroporated en el animal recién nacido, incluso aunqueuf al mismo tiempo y en el mismo animal una señal de bioluminiscencia de la luciferasa igualmente co-electroporación podría ser detectado después de la inyección luciferina (Figura 6), y la neuronas que expresan GFP estaban aún presentes en el cerebro a una edad de seis meses. Llegamos a la conclusión de que, en la rata, la reacción luciferasa / luciferina es muy adecuado para diferenciar los animales con cerebros electroporadas exitosas (Figura 3). El control cuantitativo de éxito IUE se refiere a la fuerza de la señal de bioluminiscencia que se mide por los recuentos de fotones dentro del mismo tiempo de exposición (Figura 3) y corresponde a la actividad enzimática de luciferasa co-expresado. Las señales pequeñas bioluminiscencia son detectables por 100-200 cargos de fotones, y, en un resplandor de ~ 1x10 4 fotones / s / cm 2 / mostrar estereorradián 1.000-2.000 células GFP-manchado en la histología en 6 meses de edad el cerebro de rata. La más alta disp señallayed una radiación de hasta ~ 5x10 6 fotones / s / cm 2 / estereorradián y ~ 64.000 cuentas. En la cepa de rata Sprague Dawley utilizado, se observó un debilitamiento de la señal de bioluminiscencia longitudinalmente con aumento de la edad y la señal desapareció más allá de la edad de P35 (Figura 4). En este punto, no sabemos si alguno de lo transitorio, de expresión basado en vectores plásmido de luciferasa disminuye, o si la señal de bioluminiscencia se debilita debido al aumento de la masa cerebral, o ambos, son las causas de la desaparición de la señal. Para el ensayo funcional presente en las ratas adultas, la selección para los estudios de comportamiento se limitó a hacer sobre la base de la ubicación de la señal, pero no por la fuerza de la señal de bioluminiscencia. A pesar de que la supervisión de bioluminiscencia cuantitativa 3D permite la diferenciación entre las diferentes zonas a electroporación (Figura 5), su exactitud se limitó para las células situadas en la moneda de diez centavos profundidadnsion del cerebro. Figura 6 muestra un ejemplo de una electroporación del hipocampo, donde la medición de bioluminiscencia en la 2D y la imagen 3D indicó un buen posicionamiento de la electroporación. En el cerebro post mortem diseccionado, se detectó una señal de GFP fluorescencia o menos a la misma posición que la señal de la bioluminiscencia, lo que indica la orientación correcta del hipocampo. Pero muestra la histología de que también las células en la corteza dorsal del hipocampo habían sido blanco (Figura 7). Esto indica que el ensayo de bioluminiscencia es una herramienta útil para detectar, cachorros IUE positivos y también para tener una idea de la zona a electroporación, pero, en última instancia, la imagen no puede sustituir a la histología post mortem para localizar exactamente las células positivamente orientadas. Nuestra demostración indica promesa para la aplicación de la tecnología de IUE para generar sutiles manipulaciones específicas de regiones cerebrales corticales o del hipocampo para simular aberrances en Cmigración ortical u otros defectos del neurodesarrollo que pueden influir en el animal adulto. Si bien la electroporación bilateral 26 tiene la ventaja de un efecto probablemente más grande en el comportamiento, también hay más de mortalidad de los embriones. Electroporación unilateral fue elegido con el fin de comparar los dos hemisferios con uno como un control interno, así como para mostrar que incluso manipulación IUE en una pequeña región unilateral, es suficiente para cambiar el comportamiento. Los cambios inducidos por el IUE en la conectividad o la arquitectura entre las neuronas pueden así ser inducida sin provocar una lesión y el partido requiere de la región a-ser-IUE manipulada con la prueba de comportamiento apropiado depende de la pregunta científica. Solución de problemas Reducción del tamaño de la camada Hay varias sugerencias con respecto a aumentar la supervivencia de las crías de IUE. En primer lugar, el uso de capilares de vidrio muy finas durante la electroporación con el fin de minimizar el tejido LesioSe recomienda n. En segundo lugar, no electroporar el primer embrión al final vaginal de cada cuerno uterino: la muerte de los primogénitos de embriones aumenta las posibilidades de una interrupción de todos los otros embriones. En tercer lugar, después del nacimiento, las ratas madre a menudo matan a parte de su progenie debido al estrés perinatal. Con el fin de reducir el estrés adicional, no comenzar con la formación de imágenes en directo justo después del nacimiento, pero esperar durante siete días. Detección de buenas prácticas agrarias en la fluorescencia de los cachorros A la semana después de su nacimiento, no hay señal de fluorescencia, ya sea usando la fluorescencia binocular en directo imágenes microscópicas o imágenes de fluorescencia con el IVIS Spectrum (modos de epifluorescencia y transfluorescence; para la excitación GFP / Emisión: 465/520 nm y 500/540 nm). Es posible que ambos, la transmisión limitada de onda de excitación y emisión de luz corta a través del tejido, como el cráneo y el alto fondo de autofluorescencia de la piel a prevenir el uso de la fluorescencia bajo la described condiciones en la rata. Como se muestra en la Figura 6, la señal de luciferasa en el animal vivo también se puede detectar en el cerebro diseccionado (sin cráneo) y allí, también una señal de fluorescencia es detectable (Figura 6D). Diferenciación de la bioluminiscencia en áreas del cerebro estrechamente espaciados Incluso en la ilustración 3D la ubicación de la zona de la bioluminiscencia no se puede predecir a 100%. Especialmente las células en la parte superior o debajo de la superficie prevista también pueden utilizarse y se transfectaron de forma accidental. La posición exacta tiene que ser controlado por post mortem (fluorescencia) la histología (véase la Figura 7).

El desarrollo de la electroporación in utero método (IUE), que permite una modulación de la expresión génica en el cerebro en desarrollo, ha sido un gran avance, ya que permitió estudiar el neurodesarrollo con relativa facilidad. 1-7 Cambios en los niveles de expresión de un gen diana en una región específica del cerebro durante el desarrollo embrionario y / o perinatal en los roedores se demostró de manera crítica la influencia proliferación neuronal, migración, arborización y conectividad. 8-10 La esquizofrenia es una enfermedad mental compleja, con síntomas agudos y crónicos que se han relacionado con alteraciones del desarrollo neurológico 11, 12 y, por tanto, muchos de los genes candidatos identificados para la esquizofrenia son investigados por posibles efectos de modulación sobre el desarrollo neurológico, como por ejemplo para la interrupción-en-la esquizofrenia -1 (DISC1) gen 13-15. El desarrollo del cerebro es regulatcado por factores genéticos y sus interacciones con el medio ambiente que juegan un papel en la pre,-períodos de desarrollo peri y postnatal. Un factor de riesgo genético importante para diversos trastornos de comportamiento es DISC1 los 16 genes. DISC1 cables desmontables a defectos de la migración en los ratones 13, 17, y la manipulación de la expresión DISC1 en el desarrollo de la corteza por IUE se ha demostrado que el impacto comportamiento de los ratones adultos 18. La manipulación de la expresión génica cerebro por IUE tiene varias ventajas sobre 19 la generación de líneas de animales transgénicos. En primer lugar, la expresión de genes dentro de las áreas de interés se logra en cuestión de semanas o meses en lugar de varias generaciones de cría líneas de roedores transgénicos. En segundo lugar, se evitan los mecanismos de compensación durante el desarrollo temprano que pueden blindar fenotipos en los animales de la línea germinal de ingeniería 20. En tercer lugar, a través de la orientación sólo una población celular específica o área específica del cerebro, migratio diferencias de proliferación pueden ser comparados directamente con la no-mutante o de control del lado contralateral si se eligen electroporaciones unilaterales. Por otro lado, IUE no tiene la exactitud de CRE / LOX temporización inducida-promotor impulsado de expresión y sólo una subpoblación de las células en un área determinada está dirigido conduce a una especie de mosaico de patrón de expresión génica. Para muchas aplicaciones experimentales en roedores adultos, una transfección transitoria de un número limitado de células en una región del cerebro puede ser suficiente, o incluso deseado, de modo que la principal ventaja de la línea germinal, roedores-transgénicas estables es insignificante. De hecho, la IUE es útil para investigar si algunas células desarrolladas anormalmente puede afectar a toda una red de células o circuitos. Otra ventaja puede ser la capacidad de demostrar los efectos no-células autónomas de un gen debido a la naturaleza del mosaico de la exitosa. Por otra parte, la generación de ratas transgénicas y knockout se encuentra todavía en su infancia y el usode IUE en esta especie para el estudio de las consecuencias del desarrollo cerebral aberrantes es de gran interés. Hasta el momento, el mayor obstáculo de la utilización de IUE para la investigación de las consecuencias de intervención en aquellos animales que a los adultos es la falta de éxito de la vigilancia de la electroporación. Hasta ahora, GFP-co-transfectadas neuronas fluorescentes en las crías de rata recién nacidos vivos no se pudo detectar con un microscopio de fluorescencia binocular adecuado o con la formación de imágenes de fluorescencia del espectro IVIS. Para superar este obstáculo, que co-transfectadas un gen indicador de luciferasa y se realizó la bioluminiscencia de imágenes en vivo de las crías por 3 dimensiones (3D) la cuantificación de la zona del cerebro IUE. Como un ejemplo para demostrar la aplicabilidad de este método en un ensayo funcional más adelante prueba de la manipulación genética del desarrollo neurológico, un co-inyección de plásmidos que contienen DISC1 humana, luciferasa, y GFP en el ventrículo lateral de embriones de rata <sup&gt; 3 seguido por electroporación con un electrodo de pinza se realizó. Si bien las señales de fluorescencia no podían ser detectados en etapas postnatales en vivo, una señal de bioluminiscencia sólido derivado del metabolismo luciferina por el gen de la luciferasa co-transfectadas se detectó hasta cinco semanas después del nacimiento. 3D-mediciones de la cuantificación permitido área cerebral a electroporación mediante el cual se identificaron los cachorros con electroporación insuficiente o equivocada desde el principio, por lo tanto, lo que permite la asignación de los animales IUE (gen de interés y revueltos control) a los grupos experimentales con áreas cerebrales electroporadas emparejados de baja variabilidad . El uso de ratas adultas IUE en paradigmas de comportamiento se demostró como un ejemplo de la utilidad de este protocolo.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>without calcium, without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin, sodium salt</td>
			<td>SynChem OHG, Germany</td>
			<td>BC218</td>
			<td>CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>CAS: 2353-45-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Amphetamine</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>A 5880</td>
			<td>CAS: 51-63-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kodan Tinktur forte</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH, Germany</td>
			<td>104 005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material / product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Novato, California, USA</td>
			<td>borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Tujunga, California, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrode</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>7 mm in diameter platinum disc electrodes (<a href="http://www.sonidel.com/product_info.php?products_id=129" target="_blank">CUY650P7</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Straight, 12 cm (14002-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave pulse electroporator (CUY21SC)</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>(CUY21SC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl surgical suture material</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Norderstedt, Germany</td>
			<td>3-0; 2 Ph. Eur;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip Applicator</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Reflex 9 mm (12032-09)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Darmstadt, Germany</td>
			<td>0.45 &#956;m cellulose acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum</td>
			<td>Caliper Life Science / PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, MassachusettsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, Massachuset tsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-field</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td>(40 x 40 x 39 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tru Scan activity system</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="4">Table of recipes</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Number</td>
						<td>Buffer name</td>
						<td>Content</td>
						<td>Comments </td>
					</tr>
					<tr>
						<td>1</td>
						<td>DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing</td>
						<td>1.5 &#956;g/&#956;l pCAX humanDISC-1, 
						0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 
						10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixture are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>2</td>
						<td>DNA-Mixure for control</td>
						<td>0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA1, 0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA2, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAGGS-GFP 10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixure are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>3</td>
						<td>Fast green Dye</td>
						<td>10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>4</td>
						<td>D-luciferin solution</td>
						<td>15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>5</td>
						<td>Amphetamine solution</td>
						<td>0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of topically transgenic rats by in utero electroporation and in vivo bioluminescence screening

En electroporación in utero (IUE) es una técnica que permite la modificación genética de las células en el cerebro para investigar el desarrollo neuronal. Hasta ahora, el uso de IUE para investigar el comportamiento o la neuropatología en el cerebro adulto se ha limitado por métodos insuficientes para la vigilancia del éxito de la transfección IUE mediante técnicas no invasivas en animales postnatales. Para el presente estudio, se utilizaron ratas E16 para la IUE. Después de la inyección intraventricular de los ácidos nucleicos en los embriones, el posicionamiento de los electrodos de pinza era crítico para la orientación o bien el desarrollo de la corteza o el hipocampo. Ventricular co-inyección y la electroporación de un monitoreo gen de la luciferasa permitido de las células transfectadas después del nacimiento después de la inyección intraperitoneal luciferina en el anestesiados crías P7 vivo por bioluminiscencia in vivo, utilizando un dispositivo de IVIS Spectrum con el software de cuantificación 3D. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Definición de Zona por bioluminiscencia puede diferenciar claramente entre electroporaciones corticales y del hipocampo y detectar una señal en sentido longitudinal en el tiempo hasta 5 semanas después del nacimiento. Esta técnica de formación de imágenes nos permitió seleccionar las crías con un número suficiente de células transfectadas asumidos necesario para desencadenar efectos biológicos y, posteriormente, para llevar a cabo las investigaciones de comportamiento a 3 meses de edad. Como un ejemplo, este estudio demuestra que la IUE con el gen DISC1 humana de longitud completa en la corteza de rata dio lugar a hipersensibilidad anfetamina. GFP transfectadas-CO puede ser detectado en las neuronas post mortem por microscopía de fluorescencia en secciones criogénicas que indican la expresión de genes presentes en ≥ 6 meses después del nacimiento. Llegamos a la conclusión de que imágenes de bioluminiscencia postnatal permite evaluar el éxito de las transfecciones transitorias con IUE en ratas. Las investigaciones sobre la influencia de los tópicos manipulaciones génicas durante neurodevelopment en el cerebro adulto y su conectividad se facilita en gran medida. Para muchas preguntas científicas, esta técnica puede complementar o incluso reemplazar el uso de ratas transgénicas y proporcionar una tecnología novedosa para la neurociencia conductual.

<html> La Figura 3 muestra viven mediciones de imágenes de tres crías de rata en P7 después de la inyección de 150 mg luciferina / kg de peso corporal. Las diferencias de intensidad de la señal que indica la variabilidad en la eficiencia de la IUE son visibles. Señales de bioluminiscencia Se registraron fuertes hasta P36 (Figura 4). En la Figura 5, la capacidad de definir cortical (Figuras 5A y 5C) y del hipocampo (Figuras 5B y 5D) por electroporación imágenes de bioluminiscencia se representan. Correlación de la señal de bioluminiscencia (Figura 7A) con su señal de fluorescencia después de la eliminación del cráneo (Figura 7B) y las células GFP-electroporación correspondientes en el cerebro cryosectioned (Figura 8) en P14 se representan en las Figuras 6-8. De nota, no había detección de una señal de fluorescencia en ratas vivas en cualquier punto de tiempo. tienda de campaña &quot;&gt; En vivo de imágenes de bioluminiscencia permite la discriminación aproximado de diferentes áreas del cerebro a electroporación por 2D (figuras 5A y 5B) que se mejora en gran medida con el programa DLIT del software de IVIS Espectro de generación de imágenes en 3D (Figuras 5C y 5D). En los ejemplos mostrados , la electroporación de la corteza prefrontal y el hipocampo podía distinguirse. Cabe señalar que mientras que el objetivo para electroporar el hipocampo, algunas células progenitoras de la corteza acostado dorsal del hipocampo pueden también ser golpeado (Figura 7). Las ratas de manera unilateral en el útero a electroporación con pCAX vector en el córtex y posteriormente sobreexpresan longitud DISC1 humano pleno fueron investigados por tanto espontánea como la hiperactividad inducida por anfetamina como adultos. Las ratas sometidas a electroporación con pCAX-DISC1 eran hipersensibles a una baja dosis de anfetamina. Estas ratas se movieron significativamente more después de tratamiento con anfetaminas que después de la inyección de solución salina, mientras que los animales de control no lo hizo (Figura 10). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de la posición del electrodo para A) electroporación y B corteza) electroporación hipocampo; verde = inyecta ADN-Mix en el ventrículo. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig2.jpg" /> Figura 2. Reacción de la luciferasa. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig3.jpg" /> Figura 3. Medición de luminiscencia de ratas P7 después de la inyección de 150 mg / kg de peso corporal luciferina; tiempo de exposición 180 seg; Una) de rata sin señal de luminiscencia; B) de rata<html> con una señal de bioluminiscencia débil, C) de la rata con una señal de luminiscencia fuerte. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig4.jpg" /> Figura 4. Línea de tiempo de las mediciones de bioluminiscencia consecutivos de la misma rata después de la inyección de 150 mg / kg luciferina demostrando una ventana de tiempo grande donde el éxito IUE puede ser detectado. <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig5.jpg" /> . Figura 5 Ilustración de las diferencias entre la electroporación cortical y del hipocampo en P7 A) y B) imágenes 2D;. C) y D), ver fotos en 3D, A) y C) de la corteza; B) y D) del hipocampo.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg &quot;&gt; Haga clic aquí para ver más grande la figura. <img alt="La figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig6.jpg" /> Figura 6. Ilustración de E16 electroporación del hipocampo de una cría de rata en P14 A) 2D-imagen de bioluminiscencia B) Ilustración 3D de la señal de bioluminiscencia C) diseccionó cerebro con bioluminiscencia señal D) del cerebro con GFP señal de epi-fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146fig6large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig7.jpg" /> Figura 7. Detalle de una imagen de fluorescencia de una sección crio 20 m de la misma P14 cerebro de rata a electroporación con GFP y luciferasa que contiene el plásmidovector, tinción de núcleos con DAPI; CA1-3 = Cornu Ammonis 1-3; DG = giro dentado, FC = Fasciolarum cinereum. Video 1. Animación 3D de un hipocampo de rata a electroporación en P14. <img alt="Figura 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig8.jpg" /> Figura 8. Esquema de prueba de anfetaminas: la inyección de solución salina primer día antes de la prueba de 15 minutos, 24 horas más tarde la inyección de anfetaminas antes de la prueba en la cámara de campo abierto. <img alt="Figura 9" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig9.jpg" /> La Figura 9. Prueba de anfetaminas. Gráfico de barras que muestra la distancia recorrida (en cm) del animal registrado por un sistema TrueScan más de 15 min barras blancas = grupo de control;. Barras grises = grupo sobreexpresan DISC1; grupo control n = 10; DISC1 grupo sobreexpresión n = 11; ANOVA: * geno tratamiento p = 0,043; prueba t para el tiempo total de solución salina vs ns = anfetaminas no Pcontrol significativo = 0,172, pDISC1 = 0,001.

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Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Los genes pueden ser manipulados durante el desarrollo de la corteza o el hipocampo de la rata en el útero a través de electroporación (IUE) en el E16, para permitir modificaciones rápidas y focalizadas en la conectividad neuronal para estudios posteriores de comportamiento o neuropatología en los animales adultos. Postnatal de imágenes in vivo para el control del éxito IUE se realiza mediante bioluminiscencia de la activación de luciferasa co-transfectadas.

Generación de ratas transgénicas por vía tópica<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación y<em&gt; En vivo</em&gt; Detección bioluminiscencia

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

generation-topically-transgenic-rats-utero-electroporation-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

13.4K vistas.  Medical School Düsseldorf.  Los genes pueden ser manipulados durante el desarrollo de la corteza o el hipocampo de la rata en el útero a través de electroporación (IUE) en el E16, para permitir modificaciones rápidas y focalizadas en la conectividad neuronal para estudios posteriores de comportamiento o neuropatología en los animales adultos. Postnatal de imágenes in vivo para el control del éxito IUE se realiza mediante bioluminiscencia de la activación de lucife...

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Investigación

Neurociencias

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

La expansión de las células madre embrionarias y adultas neurales por<em&gt; In Utero</em&gt; La electroporación o inyección estereotáxica Viral

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

La manipulación genética del ratón en desarrollo a través de Hipotálamo<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

En Vivo Transferencia de genes a células de Schwann en el nervio ciático de roedores mediante electroporación

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein prionoids, which cause neuropathology within the central nervous system (CNS). Here we describe that intraglossal or intraperitoneal injection of alpha-synuclein fibrils into bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which overexpress human alpha-synuclein with the A53T mutation from the prion protein promoter and firefly luciferase from the promoter for glial fibrillary acidic protein (Gfap), is sufficient to induce neuropathologic disease. In comparison to homozygous Tg(M83+/+) mice that develop severe neurologic symptoms beginning at an age of 8 months, heterozygous Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) animals remain free of spontaneous disease until they reach an age of 22 months. Interestingly, injection of alpha-synuclein fibrils via the intraperitoneal route induced neurologic disease with paralysis in four of five Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice with a median incubation time of 229 &#177;17 days. Diseased animals showed severe deposits of phosphorylated alpha-synuclein in their brains and spinal cords. Accumulations of alpha-synuclein were sarkosyl-insoluble and colocalized with ubiquitin and p62, and were accompanied by an inflammatory response resulting in astrocytic gliosis and microgliosis. Surprisingly, inoculation of alpha-synuclein fibrils into the tongue was less effective in causing disease with only one of five injected animals showing alpha-synuclein pathology after 285 days. Our findings show that inoculation via the intraglossal route and more so via the intraperitoneal route is suitable to induce neurologic illness with relevant hallmarks of synucleinopathies in Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice. This provides a new model for studying prion-like pathogenesis induced by alpha-synuclein prionoids in greater detail.

Peripheral injection of alpha-synuclein fibrils into the peritoneum or tongue of Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which express human alpha-synuclein with the familial A53T mutation and firefly luciferase, can induce neuropathology, including neuroinflammation, in their central nervous system.