الكتاب أود أن أشكر اليزابيث بلانشارد للحصول على المساعدة الفنية لها. النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا التقرير هي آراء أصحابها ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها.

<ol>
	<li>Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+airway+epithelial+cells+(calu-3):+a+model+of+human+respiratory+function,+structure,+and+inflammatory+responses.">Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses.</a> Critical care research and practice. 2010, (2010).</li><li>Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+air-interfaced+Calu-3+cell+layers+for+investigation+of+inhaled+drug+interactions+with+organic+cation+transporters+in+vitro.">Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro.</a> International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).</li><li>Baginski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+into+the+fate+of+inhaled+salmon+calcitonin+at+the+respiratory+epithelial+barrier.">Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).</li><li>Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc-mediated+transport+of+nanoparticles+across+airway+epithelial+cell+layers.">Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).</li><li>Vinhas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollen+proteases+compromise+the+airway+epithelial+barrier+through+degradation+of+transmembrane+adhesion+proteins+and+lung+bioactive+peptides.">Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides.</a> Allergy. 66, 1088-1098 (2011).</li><li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+(PADDOCC)+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations.">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).</li><li>Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+activity+of+wild+berry+juice+fractions+against+Streptococcus+pneumoniae+binding+to+human+bronchial+cells.">Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells.</a> Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).</li><li>Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+interaction+of+the+pneumococcal+surface+protein+SpsA+with+the+human+polymeric+immunoglobulin+receptor+(hpIgR).">Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR).</a> The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).</li><li>Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+passage+of+Neisseria+meningitidis+across+a+polarized+respiratory+epithelium.">Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium.</a> Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).</li><li>Grantham, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation+of+the+influenza+A+virus+M2+protein+is+not+required+for+virus+replication+in+vitro+but+contributes+to+virus+virulence.">Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence.</a> Journal of. 83, 8655-8661 (2009).</li><li>Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lycopene+enrichment+of+cultured+airway+epithelial+cells+decreases+the+inflammation+induced+by+rhinovirus+infection+and+lipopolysaccharide.">Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide.</a> The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).</li><li>Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+acute+respiratory+syndrome+(SARS)+coronavirus-induced+lung+epithelial+cytokines+exacerbate+SARS+pathogenesis+by+modulating+intrinsic+functions+of+monocyte-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells.</a> Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+innate+immune+responses+of+human+bronchial+epithelial+cells+to+severe+acute+respiratory+syndrome-associated+coronavirus+infection.">Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection.</a> PloS one. 5, e8729 (2010).</li><li>Hsu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+constitutive+type+I+interferon+response+in+bronchial+epithelial+cell+to+influenza+infection.">Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection.</a> PloS one. 7, e32947 (2012).</li><li>Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Calu-3+cell+line+as+a+model+of+in+vitro+respiratory+syncytial+virus+infection.">Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection.</a> Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).</li><li>Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+infection+of+human+airway+epithelial+cells+is+polarized,+specific+to+ciliated+cells,+and+without+obvious+cytopathology.">Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology.</a> Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).</li><li>Geys, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+the+pulmonary+translocation+of+nanoparticles:+a+preliminary+study.">In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study.</a> Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).</li><li>Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+culture+conditions+to+develop+an+in+vitro+pulmonary+permeability+model.">Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).</li><li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier.">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

عند إنشاء Calu-3 LCC في إدراج Transwell، قد لا خلايا استقطاب في كل شيء، أو لا استقطاب بالكامل، كما تم تعريفها من قبل طير ≥ Ω × 1000 سم 2 و≤ 1٪ موازنة الصوديوم فلوريسئين صبغ بين حجرات قمية وbasolateral. وبالإضافة إلى ذلك، قد Calu-3 خلايا في استقطاب LCC تماما، ولكن قد تكون غير متناسقة طير بين القياسات. على الرغم من التقلبات في القياسات طير من Calu-3 LCC طبيعية من يوم لآخر، ومن غير المتوقع تماما مرة واحدة الاستقطاب، وتقلب كبير في طير حتى ينخفض ​​بشكل طبيعي ثقافة مع التقدم في السن، والتي قد تكون اقل من 5 أسابيع أو ما دامت 12 أسبوعا بعد البذر. قدرة Calu-3 LCC لاستقطاب يعتمد في جزء منه على كيفية الحفاظ على الخلايا وsubcultured قبل الاستخدام في نظام Transwell. الخلايا التي نمت خارج التقاء 90٪ وأحادي الطبقة خلال subculturing، التي تم subcultured أكثر من 10 مرات من المخزون المجمدة، أو التي لا تكونEN المتوفرة مع الطازجة المتوسطة على جدول منتظم هم أقل عرضة للاستقطاب بالكامل، والاستقطاب أي من المرجح أن ينخفض ​​بسرعة. ويمكن أيضا عدم ناقصة أو الكلي من الاستقطاب يمكن أن يعزى إلى اختلاف في حجم المسام والمواد من Transwells تستخدم لCalu LCC-3، وإلى الكثير الكثير من التباين في تركيبة مماثلة Transwells وحجم المسام قد تؤثر أيضا الاستقطاب. يمكن أحجام أكبر المسام تسمح Calu-3 في النمو من خلال الغشاء Transwell في مقصورة basolateral، ومنع الثقافة من الاستقطاب. وأشار إلى عدم وجود الاستقطاب قد يكون أيضا بسبب نمو البكتيريا، من خلال ثقافة المتوسط ​​بظلالها، مما يؤدي إلى انهيار اللاحقة للمنعطفات ضيقة بين الخلايا Calu-3. قد يكون سبب القياسات طير متغير من Calu-3 LCC عن اضطرابات الميكانيكية للmonolayers Calu-3 خلية LCC، إدراج، أو لوحات أنفسهم. يجب أن يتم تنفيذ التغييرات والقياسات المتوسطة طير بدون نصائح أو ماصة الكهربائيةدي يؤدي لمس الخلايا. أثناء تنفيذ هذه العمليات، ينبغي الحرص على تجنب إدخال فقاعات الهواء إلى حجرات قمية وbasolateral، والتي سوف تعطيل قدرة voltohmmeter للكشف عن المقاومة. قد يقتصر أيضا على قدرة voltohmmeter للكشف عن المقاومة في ثقافة الاستقطاب التي هي في الواقع من تراكم البروتين يؤدي على القطب. قد تتم إزالة هذا تراكم مع طيف الرملي، أو قد يتم تصحيحها عن طريق الاستعاضة عن القطب. مرة واحدة Calu-3 LCC استقطاب تماما وطير في تزايد لم يعد، Calu-3 LCC على استعداد لاستخدامها كعامل في المختبر نموذج لوصف ردود المضيف الرئة الخلايا الظهارية لعدوى الجهاز التنفسي. هذا النظام يسمح أفضل توصيف الردود الاتجاه لمسببات الأمراض مقارنة أحادي الطبقة، خطوط الخلايا المستزرعة الرئة تستخدم عادة لدراسة مسببات الأمراض التنفسية، مثل التهاب الكبد وخلايا A549-2، مع مزايا إضافية من Calu-3 باي LCCنانوغرام أسرع لتطوير وبسهولة أكبر الحصول عليها، وأقل تكلفة لتوليد من الابتدائي، NHBE، الاستقطاب متباينة. مماثلة لNHBE، الاستقطاب Calu-3 إثبات مشددة تشكيل تقاطع، وإنتاج mucins. ولكن، خلافا NHBE، الاستقطاب Calu-3 خلايا لا تفرق في طبقات من الخلايا القاعدية والخلايا المهدبة العمودية الطلائية، وعدد قليل الاستقطاب Calu-3-أهداب الخلايا تطوير مثل التوقعات 19. وهكذا، على الرغم من المفيد لدراسة الردود الاستقطاب من الخلايا الظهارية الهوائية لإهانة الجهاز التنفسي، والاستقطاب Calu-3 LCC ليست نموذجا مثاليا لدراسة التنمية مجرى الهواء أو إعادة عرض ردا على إهانة أو إصابة الجهاز التنفسي. قد إنتاج المخاط من قبل الخلايا المستزرعة في المختبر تؤثر العدوى الخلوية، وكذلك الإفراج عن فيروس المعدية وانتشار الفيروس في نموذج الاستقطاب، وإجراء مقارنة مباشرة للإنتاج المخاط بين الاستقطاب LCC-3 Calu ولم تبلغ الاستقطاب، NHBE متباينة تم . A549 والخلايا التهاب الكبد A-2إعادة أسهل للثقافة من الخلايا-3 Calu، ولكن، خلافا Calu-3 LCC، فإنها لا تشكل الثقافات الاستقطاب عندما نمت على إدراج Transwell، وبالتالي هي نماذج مثالية لا لفحص في المختبر ردود الخلايا الظهارية المستقطبة لعدوى فيروس الجهاز التنفسي .

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> الكواشف </td></tr><tr><td> Calu-3 </td><td> ATCC </td><td> HTB-55 </td><td></td></tr><tr><td> 0،05٪ التربسين - EDTA 0.02٪ </td><td> Gibco / إينفيتروجن </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> النسر متوسطة الأساسية الدنيا (EMEM) </td><td> Gibco / إينفيتروجن </td><td> 07-00100DK </td><td></td></tr><tr><td> الجنين المصل البقري (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> حرارة تعطيل، 56 ° C، 30 دقيقة </td></tr><tr><td> غير الضرورية الأحماض الأمينية 100X (10 ملم) </td><td> Gibco / إينفيتروجن </td><td> 11140 </td><td> متجر في C ° 4 في الظلام </td></tr><tr><td> الجلوتامين L- </td><td> Gibco / إينفيتروجن </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco / إينفيتروجن </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> EMEM-10٪ FBS (EMEM-10٪) </td><td></td><td></td><td> تكملة EMEM مع FBS المعطل للحرارة إلى 10٪ مصل، مرشح العقيمة </td></tr><tr><td> EMEM-20٪ FBS + ملاحق (EMEM-20٪ + S) </td><td></td><td></td><td> تكملة EMEM لتركيزات النهائي: FBS المعطل للحرارة بنسبة 20٪ 1X الأحماض الأمينية؛ 2 مم L-الجلوتامين؛ HEPES ملي 10؛ العقيمة مرشح </td></tr><tr><td> 24-وحات جيدة Transwell </td><td> كورنينج COSTAR </td><td> 3472 </td><td> 3 المساحة المسام ميكرومتر، والبوليستر </td></tr><tr><td> التريبان الأزرق </td><td> Gibco / إينفيتروجن </td><td> 15250 </td><td></td></tr><tr><td> الإيثانول </td><td> سيجما </td><td> E7023 </td><td> إعداد إلى 70٪ باستخدام معقم DH 2 O </td></tr><tr><td> Dulbecco في PBS (D-PBS) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> غير الفلورسنت العازلة </td><td></td><td></td><td> 118 مم كلوريد الصوديوم؛4،75 بوكل مم؛ 2.53 ملي CaCl 2 × H 2 O؛ 2،44 ملم MgSO 4؛ 1،19 ملم KH 2 PO 4؛ 25 مم NaHCO 3 في الماء المعقم؛ العقيمة مرشح </td></tr><tr><td> الصوديوم فلوريسئين </td><td> سيجما </td><td> 6377 </td><td> 1 ملغ / مل في المخزن المؤقت غير معقمة الفلورية؛ العقيمة مرشح، بعيدا عن الضوء؛ المحل في 4 درجات مئوية تصل إلى 6 أشهر </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPMENT </td></tr><tr><td> Voltohmmeter </td><td> أدوات الدقة العالم </td><td></td><td></td></tr><tr><td> STX2 الكهربائي </td><td> أدوات الدقة العالم </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ELISA لوحة قارئ </td><td></td><td></td><td> قادرة على قياس 486 أو 490 A A </td></tr></tbody></table>

establishing a liquid-covered culture of polarized human airway epithelial calu-3 cells to study host cell response to respiratory pathogens in vitro

السطوح قمية وbasolateral من الخلايا الظهارية الهوائية تظهر الاستجابات الاتجاه إلى التعرض الممرض في الجسم الحي. وهكذا، مثالية نماذج في المختبر لدراسة الاستجابات الخلوية لمسببات الأمراض التنفسية استقطاب، وتشكيل السطوح قمية وbasolateral. ويتمايز نموذج واحد مثل الإنسان الطبيعي الخلايا الظهارية القصبية (NHBE). ومع ذلك، فإن هذا النظام يتطلب عينات أنسجة الرئة والخبرات وعزل الخلايا الظهارية زراعة الأنسجة من، والوقت لإنشاء واجهة الثقافة الهواء السائل. Calu-3 خلايا، والمستمدة من الشعب الهوائية والسرطان الغدي الإنسان، هي النموذج البديل للنظر في استجابة الخلايا الظهارية الهوائية القريبة لإهانة الجهاز التنفسي 1، مركبات الدوائية 2-6 و 7-9 والبكتيرية والفيروسية مسببات الأمراض، بما في ذلك فيروس الأنفلونزا، فيروسات الانف والمتلازمة التنفسية الحادة - المرتبطة التاجى 10-14. مؤخرا، ثأظهرت الإلكتروني التي Calu-3 خلايا عرضة لفيروس الجهاز التنفسي المخلوي (RSV) في العدوى على نحو يتفق مع NHBE 15،16. هنا، ونحن من التفصيل إرساء ثقافة الاستقطاب السائل المغطاة، (LCC) من الخلايا-3 Calu، مع التركيز على التفاصيل التقنية لزراعة الخلايا والنمو Calu-3، والحفاظ على الخلايا التي تم زرعها في LCC، ونقدم الأسلوب لتنفيذ عدوى فيروس الجهاز التنفسي من الاستقطاب خلايا-3 Calu. للحصول على الاستقطاب باستمرار Calu LCC-3، Calu-3 يجب خلايا subcultured بعناية قبل زراعة في إدراج Transwell. يجب Calu-3 الثقافات أحادي الطبقة تظل دون التقاء 90٪، وينبغي subcultured أقل من 10 مرات من المخزون المجمدة، ويجب أن يتم توفير بانتظام مع المتوسط ​​الطازجة. مثقف مرة واحدة في Transwells، لا بد من التعامل معها Calu-3 LCC بعناية. عدم انتظام وسائل الإعلام وتعطيل التغييرات الميكانيكية أو المادية للطبقات الخلية أو لوحات تؤثر سلبا الاستقطاب للعدة ساعات أو أيام. ويتم رصد الاستقطاب من خلال تقييم عبر الظهارية المقاومة الكهربائية (طير) ويتم التحقق من خلال تقييم السلبي للموازنة الصوديوم فلوريسئين بين حجرات قمية وbasolateral 17،18. الهضاب طير مرة واحدة عند أو فوق 1000 سم 2 × Ω، Calu-3 LCC على استعداد لاستخدامها لدراسة الاستجابات الخلوية لمسببات الأمراض في الجهاز التنفسي.

عندما نمت وسائل المغطاة الثقافات (LCC) في نظم الثقافة Transwell، كما هو موضح في الشكل 1، Calu-3 خلايا استقطاب وتطوير متميزة السطوح قمية وbasolateral. وفقا للطريقة الموصوفة هنا، المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (طير) من Calu LCC-3 تصل إلى الهضبة عند أو فوق 1000 سم 2 × Ω في غضون 3 أسابيع بعد الغرس ومثال الذي يظهر في الشكل 2. وشكلت منعطفات ضيقة بين الخلايا الاستقطاب السلبي موازنة منع من جزيئات صغيرة بين حجرات قمية وbasolateral. وبالتالي، يتم استخدام فلوريسئين الصوديوم تعديل موازنة فحص للتأكد من الاستقطاب Calu-3 LCC 15،17،18. كما طير من monolayers الخلية Calu-3 في زيادات LCC، ومقدار فلوريسئين أن equilibrates بشكل سلبي في مقصورة basolateral النقصان. مرة واحدة في طير هو 1،000 × Ω سم 2، ومقدار فلوريسئين أن equilibrates في<html> إلى المقصورة basolateral و≤ 1٪، كما هو موضح في الشكل 3، وبالتالي، تعتبر Calu-3 LCC أن تكون مستقطبة بشكل كامل عندما هو طير ≥ Ω × 1000 سم 2. قد طير قياس ذروة Calu-3 LCC تختلف من تجربة إلى تجربة. ومع ذلك، مرة واحدة هضبة القيم طير لأي تجربة معينة، قد، غير مصاب تماما الاستقطاب Calu-3 LCC تكون مستقرة لمدة 5 إلى 12 أسابيع بعد البذر. قد يكون سبب غياب التنمية المقاومة في Transwell-مثقف Calu-3 من قبل عدة عوامل على النحو المبين في الجدول 1. مرة واحدة في طير من Calu-3 الهضاب LCC عند أو فوق 1000 سم 2 × Ω، هذا النموذج هو على استعداد لاستخدامها لفحص ردود الخلايا الظهارية الهوائية لمسببات الأمراض التنفسية، بما في ذلك فيروس الجهاز التنفسي المخلوي (RSV). التعرض لنتائج RSV في انخفاض أسرع في نزاهة ثقافة الاستقطاب مقارنة العدوى وهمية من الخلايا (الشكل 4). = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig1.jpg" /> الشكل 1. تزرع الخلايا المقطع العرضي تمثيل Transwell-مثقف الخلايا. على سطح الغشاء القمي إدراج. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" /> الشكل 2. التنمية العابرة للالظهارية المقاومة الكهربائية (طير) واستقطاب Calu-3 الخلايا بعد البذر في إدراج Transwell. وفي كل نقطة الوقت، كما يتم تقديم طير متوسط ​​سم × Ω ± 2 SEM من 32 بئرا مستقلة عن التجربة ممثل واحد. <img alt="الشكل 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" /> الشكل 3. السلبي equili<html> هو تحول دون bration من فلوريسئين الصوديوم في مقصورة basolateral من monolayers الخلية Calu-3 كما تصبح الخلايا الاستقطاب. يتم تقديم البيانات التراكمية من أربع تجارب مستقلة. كل نقطة بيانات يمثل القياس الفردية. <img alt="الشكل 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" /> الشكل 4. RSV إصابة LCC Calu-3 الاستقطاب تسارع انخفاض في سلامة أحادي الطبقة. المستقطب Calu-3 خلايا والمصابين RSV-A2 في وزارة الداخلية 1 = في يوم 0، وتمت مراقبة القطبية لمدة 8 أسابيع بعد العدوى. ويرد ممثل تجربة واحدة. يتم عرض البيانات في مقاومة متوسط ​​من 8 آبار مستقلة في الإصابة ± SEM في نقطة زمنية. * P &lt;0.05 بين الثقافات وهمية وRSV-A2 المصابين، على النحو الذي يحدده للطالب اختبار t. طرق &quot;&gt; <tbody><tr><td> قضية </td><td> القرار (ق) </td></tr><tr><td> المقاومة ليست قابلة للقياس </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي فقاعات الهواء في الآبار </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخلايا Calu-3 التي تم subcultured من المخزون المجمدة أقل من 10 مرات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تسمح Calu-3 خلايا لتصل إلى 100٪ في التقاء ثقافة فرعية أحادي الطبقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن الخلايا لا تنمو على البلاستيك أقل بكثير من إدراج (تشير إلى أن الخلايا قد نمت من خلال مسام إدراج) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح 2-3 أسابيع بعد الغرس من أجل التنمية الكاملة المقاومة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من تكوين وحجم المسام من إدراج المستخدمة، تغيير إذا لزم الأمر (مستحسن إدراج البوليستر، 0.3 ميكرون حجم المسام، لا الطلاء، انظر المواد للحصول على التفاصيل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من جودة القطب، الرملي بلطف لإزالة البروتينات المتراكمة من طرف، واستبدال إذا لزم الأمر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق المتوسطة لنمو البكتيريا </li></ul&gt; </td></tr><tr><td> المقاومة تتطور، ولكن لم يبلغوا الاستقطاب الكامل (≥ Ω × 1000 سم 2) </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إتاحة المزيد من الوقت لاستقطاب لتطوير (قد تتخذ في بعض الأحيان تصل إلى 4 أسابيع) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخلايا Calu-3 التي تم subcultured من المخزون المجمدة أقل من 10 مرات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تسمح Calu-3 خلايا لتصل إلى 100٪ في التقاء ثقافة فرعية أحادي الطبقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال باستمرار المتوسطة في الثقافات Transwell، بالتناوب بين النهار والثالثة والرابعة ثم بعد الرضاعة السابقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا فقط على إدراج الثقافة التي يتم وضعها في الصفوف الخارجي للوحات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الكثير مختلفة من إدراج Transwell </li></ul></td></tr><tr><td> خلايا استقطاب تماما، ولكن المقاومة ليست متسقة من قراءة واحدة إلى أخرى </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تعطيل أو كومة لوحات في الحاضنة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تسبب الاهتزاز في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية في حين Transwell بلاتويجري التعامل معها ES </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي فقاعات الهواء في الآبار </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تخل طبقة الخلايا مع نصائح ماصة عند تغيير أداء وسائل الإعلام أو قراءات طير </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستخدم الانسان 200 ميكرولتر المتوسطة في المقصورة القمي، وانخفاض الصوت قد يؤدي إلى قراءات غير مستقرة طير </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من جودة القطب، الرملي بلطف لإزالة البروتينات المتراكمة من طرف، واستبدالها إذا لزم الأمر </li></ul></td></tr></tbody></table> الجدول 1. حل المشاكل التي قد تنشأ المشاكل عندما زراعة الخلايا Calu-3 في Transwells. عوامل متعددة تسهم في استقطاب كاملة من خلايا-3 Calu في السائل المغطاة الثقافات، وعلى الأرجح من التي أبرزت في هذا الجدول.

Watch this Scientific Journal Video about Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro at JoVE.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا التقرير هي آراء أصحابها ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها.

إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية<em&gt; في المختبر</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

establishing-liquid-covered-culture-polarized-human-airway-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

22.3K Views.  Centers for Disease Control and Prevention (CDC). النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا التقرير هي آراء أصحابها ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها.

Video: Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

على<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة عدم تجانس التمايز بلعم الإنسان والاستقطاب

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

الثقافات المشيمة وساقطي الجهاز الإنسان لدراسة العدوى في واجهة الأم والجنين

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

تطوير اللعابية الأجسام المضادة المناعية المتعددة لقياس التعرض البشري للمسببات البيئية

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان<em&gt; رابطة الدول المستقلة</em&gt; -prenyltransferase في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and migration. One critical limitation of such assays, however, is their homogenous assortment of cellular types. Repair is a complex process which demands the interaction of several cell types. Therefore, to study a culture devoid of cellular subtypes, is a concern that must be overcome if we are to understand the repair process. The gastric organoid model may alleviate this issue whereby the heterogeneous collection of cell types closely reflects that of the gastric epithelium or other native tissues in vivo. Demonstrated here is a novel, in vitro scratch-wound assay derived from human or mouse 3-dimensional organoids which can then be transferred to a gastric epithelial monolayer as either intact organoids or as a single cell suspension of dissociated organoids. The goal of the protocol is to establish organoid-derived gastric epithelial monolayers that can be used in a novel scratch-wound assay system to study gastric regeneration.

Here we describe a protocol for establishing and culturing human- and mouse-derived 3-dimensional (3D) gastric organoids, and the method for the transfer of 3D organoids to a 2-dimensional monolayer. The use of the gastric epithelial monolayer as a novel scratch-wound assay for regeneration studies is also described.

الفأر والإنسان-المستمدة من الثقافة أساسي أحادي الطبقة الظهارية المعدة لدراسة تجديد

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

مونولاييرس كولونويد البشرية لدراسة التفاعلات بين العوامل الممرضة، كومينسالس، وظهاره الأمعاء المضيف

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...