نشكر جميع أعضاء مختبرنا لإجراء مناقشات مفيدة. نشكر جوانا Lisztwan وGewinner كريستينا لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل BB/I021248/1 منحة BBSRC ويلكوم ترست منحة 090090/Z/09/ZAH هو البحث يلكوم ترست الوظيفي زميل التنمية في معهد السرطان UCL.

1. استنساخ pcDNA6_TetR_IRES_blast <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما هو موضح في الشكل (3)، نفذ خلاصة جزئية للpcDNA6/TR بلازميد (V1025-20، إينفيتروجن) مع I تقييد الانزيمات وXba راس I لإزالة الجين TetR والمروج للمقاومة blasticidin (BlastR) الجينات. عزل ناقلات KB 4،6 جزء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة تذييل بعديد الأدينيلات تسلسل الجين من TetR، وإدخال من قبل PCR لI Xho الموقع فورا بعد كودون إيقاف من [كدنا] TetR مع المحافظة على موقع I Xba في 5&#39;end من [كدنا]. Subclone جزء مما أدى إلى تقييد pMigR1 17 استخدام الإنزيمات وXba I I Xho لتوليد pMigR1_TetR البلازميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضم ناقلات pMigR1_TetR مع I تقييد الانزيمات Xba وأنا راس لاطلاق سراح جزء TetR_IRES. عزل إدراج جزء KB 1.25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ligate قدره 4.6 كيلوبايت pcDNA6/TR و1،25 KB TetR_IRES شظايا. TRansform المنتج في ربط القولونية المختصة وتحديد المطلوب بناء pcDNA6_TetR_IRES_blast باستخدام معيار تقنيات البيولوجيا الجزيئية. </li></ol> 2. جيل من خطوط الخلايا ستابلي تعرب عن TetR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 1، 1x10 6 خلايا البذور بنسبة 10 سم، نسيج لوحة الثقافة المتوسطة باستخدام معيار النمو الخاص بك (على سبيل المثال DMEM تستكمل مع FCS 10٪). البذور لوحين، واحدة للترنسفكأيشن مع pcDNA6_TetR_IRES_blast، والآخر كعنصر تحكم سلبية على اختيار blasticidin. ضمان استخدام أقل إمكانية انتقال والمتوسطة النمو الموصى بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 2، لوحة واحدة مع بالنقل 2 ميكروغرام من pcDNA6_TetR_IRES_blast باستخدام باستخدام الدهن 6 (E2691، Promega) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. لا بالنقل لوحة ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم 3، إضافة معيار المتوسطة النمو تحتوي على 5 ميكروغرام / مل على كل من لوحات blasticidin. يرجى ملاحظة أن تركيز الاختيار الأمثل قد تختلف عن خط معين والخلايا قد نعيد يحدد مسبقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 4، تقسيم الخلايا في 5/1، 1/25، 1/50 و 1/100 باستخدام 10-سم لوحات ومستوى النمو المتوسط ​​تحتوي على 5 ملغ / مل blasticidin. تأكد بشكل صحيح لتسمية لوحات تحتوي على خلايا untransfected أو خلايا. إعداد صفيحتين في الخطوة التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق الخلايا اليومية، وضمان أن جميع الخلايا على لوحات untransfected لقوا حتفهم خلال الأسبوع الأول. تغيير وسائل الاعلام اختيار كل 2-3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1-2 أسابيع، وينبغي blasticidin مقاومة المستعمرات تبدأ في الظهور. حدد لوحات تحتوي على 5 حتي 50 المستعمرات لضمان أن يمكن التقاطها المستعمرات واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما وصلت إلى المستعمرات قطر حوالي 5 مم (أو أكبر)، عزل لا يقل عن 12 استنساخ باستخدام اسطوانات مستقلة الاستنساخ لاختيار المستعمرات واحد. نقل كل نسخة منفصلة في بئر من لوحة زراعة الأنسجة 24 أيضا. عندما متموجة، وتقسيم الخلايا من كل بئر واحد في بئر لوحة زراعة الأنسجة 6 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تواصل CL الثقافةمنها في وسائل الإعلام التحديد. عندما متموجة، تقسيم الخلايا من كل بئر في بئرين واحد من لوحة زراعة الأنسجة 6 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليتم اختبار كل استنساخ، تجميد بئر واحد من الخلايا والخلايا متموجة الحصاد في البئر الأخرى للاختبار اللاحقة التي immunoblotting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشف TetR بواسطة الغربية النشاف باستخدام الماوس وحيدة النسيلة المضادة للأجسام المضادة TET02 (MoBiTec شركة محدودة). تذكر أن تشمل المحللة من خط الخلية الأبوية كعنصر تحكم سلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد 3 استنساخ مع التعبير أعلى TetR وتوسيع كل ثقافة نسيلي. تجميد أرصدة كل استنساخ واعدة في أقرب وقت ممكن. وأخيرا، دراسة المعلمات البيولوجية الجزيئية والخلوية ذات الاهتمام بمقارنة خطوط الخلايا الأبوية مع الحيوانات المستنسخة، معربا عن TetR. حدد &#39;أفضل&#39; استنساخ مع التعبير أعلى TetR أن لا يعرض أي تغييرات في المعلمات البيولوجية الجزيئية والخلوية في المصالح. </li></ol> 3. الاختبار التجريبي للpTER وPT-ريكس المتجهات DEST30 عبر عنجي shRNA أو cDNAs، على التوالي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد pTER البلازميد مع تدرج shRNA كما هو موضح 12. بناء PT-ريكس DEST30 ناقلات (12301-016، إينفيتروجن) يحتوي على [كدنا] من الاهتمام باستخدام التكنولوجيا عبارة (إينفيتروجن). في حالة التعبير [كدنا]، وإضافة علامة إلى [كدنا] في وقت لاحق تسهيل الكشف عن البروتين المعبر عنه خارجيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عابر بالنقل الخلية الهدف الوالدين تمشيا مع البلازميدات أو DEST30 pTER حزب العمال ريكس-(إما معربا عن shRNAs أو cDNAs من الفائدة) باستخدام كاشف ترنسفكأيشن في الاختيار. لاختبار التعبير البلازميدات shRNA، لا يمكن أن يتحقق ضمان الكفاءة ترنسفكأيشن عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقاس الخلايا الحصاد وعملية immunoblotting باستخدام الأجسام المضادة المناسبة، متوقعا الكشف عن نضوب أو الجينات overexpression من اهتمامك. </li></ol> 4. جيل من خطوط الخلايا مستقرة مع محرض-التتراسيكلين (تيت-on) أو التعبير عن shRNAs cDNAs طريق pTER أو PT-ريكس المتجهات DEST30 </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 1، البذور 1x10 6 خلايا من &#39;أفضل&#39; استنساخ-TetR معربا عن نسبة 10 سم، باستخدام لوحة متوسطة النمو القياسية الخاصة بك تستكمل مع مصل التتراسيكلين خالية مصدق (على سبيل المثال FBS من إينفيتروجن؛ 16000-014). البذور لوحة واحدة لترنسفكأيشن مع pTER (أو PT-ريكس DEST30)، ولوح واحد والمراقبة السلبية لاختيار مزدوج. تأكد من استخدام مرور أقل ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 2، لوحة واحدة مع بالنقل 2 ميكروغرام من pTER (أو PT-ريكس DEST30) باستخدام باستخدام الدهن 6. لا بالنقل لوحة ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم 3، إضافة معيار المتوسطة النمو تحتوي على 5 ميكروغرام / مل و 500 blasticidin ميكروغرام / مل zeocin (أو 1 ملغ / مل G418). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 4، تقسيم الخلايا في 5/1، 1/25، 1/50 و 1/100 باستخدام 10-سم لوحات ومستوى النمو المتوسط ​​تحتوي على 5 ميكروغرام / مل وblasticidin ميكروغرام / 500 مل zeocin (أو 1 ملغ / مل G418). إعداد صفيحتين في الخطوة التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من الخلايا اليومية، والتأكد من أنه في غضون الأسبوع الأول كل الخلايا على لوحات untransfected لقوا حتفهم.تغيير المتوسطة النمو القياسية التي تحتوي على blasticidin وzeocin (أو G418) كل 3-4 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 2-3 أسابيع، blasticidin / zeocin (أو blasticidin/G418) ينبغي ضعف المقاومة للمستعمرات تبدأ في الظهور. حدد لوحات تحتوي على 5 حتي 50 مستعمرات لاختيار المستعمرات واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما وصلت إلى المستعمرات قطر حوالي 5 مم (أو أكبر)، استخدم اسطوانات استنساخ لاختيار المستعمرات واحد. عزل الحيوانات المستنسخة لا يقل عن 24 فرد. نقل كل نسخة منفصلة في بئر من لوحة زراعة الأنسجة 24 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ الثقافة في المتوسط ​​تحتوي على تركيزات الصيانة من blasticidin (5 ميكروغرام / مل) وzeocin (250 ميكروغرام / مل) [أو G418 (0.5 ملغ / مل)]. عندما متموجة، وتقسيم الخلايا من كل بئر واحد في بئر لوحة زراعة الأنسجة 6 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليتم اختبار كل استنساخ، تقسيم واحد متموجة بشكل جيد من لوحة 6 جيدا إلى ثلاثة آبار واحدة من لوحة 6 أيضا. عندما متموجة، وتجميد الخلايا من بئر واحد. استخدام ما تبقى من بئرين لاختبار تتراسايكلينالبريد محرض التعبير. إضافة التتراسيكلين عند تركيز من 1 ميكروغرام / مل واحد أيضا، مع ترك التتراسيكلين البئر الثانية مجانا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 إلى 96 ساعة من الحضانة مع الخلايا التتراسيكلين الحصاد، وعملية immunoblotting باستخدام الأجسام المضادة المناسبة. ويوصى أقصر الأوقات الحضانة التتراسيكلين عند فحص للتحريض التعبير [كدنا]، في حين يعد العلاج التتراسيكلين سوف يكون من الضروري تحديد shRNA بوساطة نضوب البروتينات الذاتية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد اثنين على الاقل من الحيوانات المستنسخة مع نضوب المطلوب / overexpression وتوسيع كل ثقافة. تجميد أرصدة كل استنساخ واعدة في أقرب وقت ممكن. عندما تزايد تيت على استنساخ للتجارب دائما التأكد من استخدام وسائل الإعلام تستكمل مع التتراسيكلين خالية المصل والمضادات الحيوية بتركيزات اختيار منها الصيانة. </li></ol>

<ol>
	<li>Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+the+repressor+gene+of+the+TN10+tetracycline+resistance+determinant.">Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant.</a> Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).</li><li>Gossen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+activation+by+tetracyclines+in+mammalian+cells.">Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells.</a> Science. 268, 1766-1769 (1995).</li><li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li><li>McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+using+micro-RNA+designed+hairpins.">Gene silencing using micro-RNA designed hairpins.</a> RNA. 8, 842-850 (2002).</li><li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3'+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells.">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li><li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+hairpin+RNAs+(shRNAs)+induce+sequence-specific+silencing+in+mammalian+cells.">Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells.</a> Genes Dev. 16, 948-958 (2002).</li><li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells.">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li><li>Sui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells.">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li><li>Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+by+expression+of+short-interfering+RNAs+and+hairpin+RNAs+in+mammalian+cells.">RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+gene+expression+using+a+stably+integrated,+inducible+small-interfering-RNA+vector.">Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector.</a> EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).</li><li>Hergovich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MST1+and+hMOB1+tumor+suppressors+control+human+centrosome+duplication+by+regulating+NDR+kinase+phosphorylation.">The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation.</a> Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).</li><li>Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome-associated+NDR+kinase+regulates+centrosome+duplication.">Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication.</a> Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).</li><li>Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NDR/LATS+interactions+with+the+human+MOB+family+reveal+a+negative+role+for+human+MOB2+in+the+regulation+of+human+NDR+kinases.">Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases.</a> Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).</li><li>Vichalkovski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDR+kinase+is+activated+by+RASSF1A/MST1+in+response+to+Fas+receptor+stimulation+and+promotes+apoptosis.">NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis.</a> Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).</li><li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr/abl-transduced+bone+marrow.">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نعتقد أن على أنظمة تيت يسهل إلى حد كبير في تحليل وظائف الجينات، ولا سيما في نظم الخلايا التي يصعب التلاعب و / أو عندما يكون الجين التلاعب أمر ضروري لبقاء الخلية. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على التحكم في التعبير الجيني من قبل أنظمة تيت على محددة للغاية يتيح الفرصة لدراس...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> الجنين المصل البقري (FBS) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 16000-044 </td><td> اختبار تيت خالية </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> Invivogen </td><td> النمل BL-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invivogen </td><td> النمل والزنك-5 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> PAA المختبرات </td><td> P31-011 </td><td> 100 ملغ / مل في وسائل الإعلام </td></tr><tr><td> مكافحة TET02 </td><td> MoBiTec شركة محدودة </td><td> TET02 </td><td> استخدام في 1/1000 إلى 2000/1 لWB </td></tr><tr><td> pcDNA6/TR </td><td> إينفيتروجن </td><td> V1025-20 </td><td></td></tr><tr><td> PT-ريكس DEST30 </td><td> إينفيتروجن </td><td> 12301-016 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> التتراسيكلين </td><td> سيجما </td><td> 87128 </td><td> 2 ملغ / مل في الإيثانول </td></tr><tr><td> الدوكسيسيكلين </td><td> سيجما </td><td> D9891 </td><td> 2 ملغ / مل في الماء </td></tr><tr><td> استنساخ الاسطوانات </td><td> Bellco زجاج شركة </td><td> 2090-00808 </td><td> إعادة صالحة للاستخدام </td></tr></tbody></table>

generation of stable human cell lines with tetracycline-inducible (tet-on) shrna or cdna expression

A نهج الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية الثديية هو التلاعب في التعبير عن الجينات ذات الأهمية في خطوط الخلايا المحددة، وذلك بهدف الكشف عن واحد أو عدة من وظيفة الجين (ق) باستخدام overexpression عابر / مستقر أو ضربة قاضية من الجين من الفائدة. للأسف، لإجراء تحقيقات الخلية البيولوجية المختلفة هذا النهج غير مناسب عندما تلاعب بنتيجة التعبير الجيني في النمو العيوب / تكاثر الخلايا غير المرغوب فيها أو تمايز الخلايا. ولذلك، تكيفت الباحثون بروتين التتراسيكلين كاظمة (TetR)، المأخوذ من E. القولونية المقاومة التتراسيكلين OPERON 1، لتوليد نظم تنظيمية فعالة جدا وضيقة للتعبير عن cDNAs في خلايا الثدييات 2،3. وباختصار، تم تعديل TetR لبدء إما كتلة (1) من النسخ عن طريق الربط إلى تيت-المشغل (TO) في منطقة المروج إضافة إلى التتراسيكلين (وهو ما يسمى تيت حالا النظام) أو ربط (2) إلى TO في رانه غياب التتراسيكلين (وهو ما يسمى تيت على نظام) (الشكل 1). نظرا للإزعاج أن النظام تيت لمرة ويتطلب استمرار وجود التتراسيكلين (التي لديها نصف عمر حوالي 24 ساعة في الخلية الأنسجة ثقافة المتوسط) وتيت على نظام تم على نطاق واسع أكثر الأمثل، مما أدى إلى تطوير ضيق جدا ونظم فعالة لمكافحة ناقلات التعبير كما هو مستخدم هنا [كدنا]. بعد وقت قصير من إنشاء تدخل الحمض النووي الريبي (رني) لضربة قاضية الجينات في خلايا الثدييات 4، معربا ناقلات قصيرة دبوس الشعر الرناوات (shRNAs) وصفت تلك الوظيفة مشابهة جدا لsiRNAs 5-11. ومع ذلك، هذه النهج ضربة قاضية shRNA بوساطة لها نفس القيد عن استراتيجيات خروج المغلوب التقليدية، منذ استنفاد مستقرة ليس ممكنا عندما الجينات الأهداف ضرورية لبقاء الخلوية. للتغلب على هذا القيد، فان دي Wetering وآخرون 12 تعديل التعبير shRNA ناقلات pSUPER 5 </suع&gt; عن طريق إدراج TO في منطقة المروج، والذي مكنهم من توليد خطوط الخلايا مستقرة مع التتراسيكلين-محرض استنزاف الجينات المستهدفة اهتمامهم. هنا، نحن تصف طريقة لتوليد بكفاءة مستقرة الإنسان تيت على خطوط الخلايا التي تدفع إما موثوق overexpression محرض أو استنزاف الجين في المصالح. باستخدام هذه الطريقة، ونحن قد ولدت بنجاح تيت على خطوط الخلايا التي سهلت كثيرا من تحليل سلسلة MST / hMOB / NDR في الجسيم المركزي 13،14 15،16 إشارة وموت الخلايا المبرمج. في هذا التقرير، ونحن لدينا وصف ناقلات الاختيار، بالإضافة إلى وصف خطوتين متتاليتين التلاعب والتي هي ضرورية لتوليد بكفاءة الإنسان تيت على خطوط الخلايا (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، إلى جانب وضع الخطوط العريضة لبروتوكول لتوليد تيت الإنسان على خطوط الخلايا، سوف نناقش الجوانب الحاسمة بشأن الإجراءات الفنية وتوصيف تيت على الخلايا.

يتم عرض مثال لتوصيف الأولي للRPE-1 خطوط الخلايا معربا عن ثابت TetR في الشكل 4. علما أن جميع الحيوانات المستنسخة RPE-1 تعبر عن مستويات متفاوتة من TetR (قارن ممرات 2 و 5)، في حين أن خط الخلية الأبوية (التي هي بمثابة المراقبة السلبية) لا يعبر عن البروتين TetR الخارجية (الش...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression at JoVE.com

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

وهناك طريقة سريعة وبسيطة لتوليد خطوط الخلايا البشرية مع محرض و overexpression [كدنا] أو عكسها shRNA بوساطة ضرب أسفل من الجينات في المصالح. هذه الطريقة تمكن الباحثين من خطوط الخلايا موثوق للغاية والتلاعب بتكاثر التي يصعب تغيير بالطرق التقليدية ترنسفكأيشن عابرة أو ضربة قاضية استراتيجيات / خروج المغلوب.

جيل من خطوط الخلايا البشرية مستقرة مع shRNA (تيت-on) التتراسيكلين أو محرض التعبير [كدنا]

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

generation-stable-human-cell-lines-with-tetracycline-inducible-tet-on

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

35.1K Views.  UCL Cancer Institute. وهناك طريقة سريعة وبسيطة لتوليد خطوط الخلايا البشرية مع محرض و overexpression [كدنا] أو عكسها shRNA بوساطة ضرب أسفل من الجينات في المصالح. هذه الطريقة تمكن الباحثين من خطوط الخلايا موثوق للغاية والتلاعب بتكاثر التي يصعب تغيير بالطرق التقليدية ترنسفكأيشن عابرة أو ضربة قا?...

Video: Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts of cell culture, and tend to acquire karyotypic abnormalities with high population doublings.  Proper passaging is essential for maintaining a healthy, undifferentiated, karyotypically normal HuES human embryonic stem cell culture.  First, an expanding culture is washed in PBS to remove residual media and cell debris, then cells are overlaid with a minimal volume of warm 0.05% Trypsin-EDTA.  Trypsin is left on the cells for up to five minutes, then cells are gently dislodged with a 2mL serological pipette.  The cell suspension is collected and mixed with a large volume of HuES media, then cells are collected by gentle centrifugation.  The inactivated trypsin media mixture is removed, and cells resuspended in pre-warmed HuES media.  An appropriate split ratio is calculated (generally 1:10 to 1:20), and cells re-plated onto a 1-2 day old plate containing a monolayer of irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells.  The newly seeded HuES culture plate is left undisturbed for 48 hrs, then media is changed every day thereafter.  It is important not to trpsinize down to a single cell suspension, as this increases the risk of introducing karyotypic abnormalities.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin. Brought to you by JoVE.

الأشكال الركض الجذعية الجنينية البشرية خلية خطوط مع التربسين

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

جيل من الخلايا البشرية باء تنشيط CD40

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

عزل الحمض النووي الريبي من الجنينية التجميعي واسماك الزرد [كدنا] لتحليل الجينات

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for laboratory personnel. Pantropic lentiviruses, such as the commonly used VSV-G pseudotype, are a valuable tool for studying gene function because they can transduce many cell types, including non-dividing cells. However, researchers may wish to avoid production and centrifugation of pantropic viruses encoding oncogenes due to higher biosafety level handling requirements and safety issues. Several potent oncogenes, including c-Myc and SV40 large T antigen, are known to enhance production of induced pluripotent stem cells (iPSC). All other known iPSC-inducing genetic changes (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, and p53 loss of function) also have links to cancer, making them of relatively high safety concern as well. 
While these cancer-related viruses are useful in studying cellular reprogramming and pluripotency, they must be used safely. To address these biosafety issues, we demonstrate a method for transduction of human cells with ecotropic lentivirus, with additional emphasis on reduced cost and convenient handling. We have produced ecotropic lentivirus with sufficiently high titer to transduce greater than 90% of receptor-expressing human cells exposed to the virus, validating the efficacy of this approach. 
Lentivirus is often concentrated by ultracentrifugation; however, this process takes several hours and can produce aerosols infectious to human biomedical researchers. As an alternative, viral particles can be more safely sedimented onto cells by complexation with chondroitin sulfate and polybrene (CS/PB). This technique increases the functional viral titer up to 3-fold in cells stably expressing murine retrovirus receptor, with negligible added time and cost. Transduction of human dermal fibroblasts (HDFs) is maximally enhanced using CS/PB concentrations approximately 4-fold lower than the optimal value previously reported for cancer cell lines, suggesting that polymer concentration should be titrated for the target cell type of interest. We therefore describe the use of methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) to assay for polymer toxicity in a new cell type. We observe equivalent viability of HDFs after viral transduction using either polymer complexation or the standard dose of polybrene (PB, 6 &mu;g/ml), indicating minimal acute toxicity.
In this protocol, we describe the use of ecotropic lentivirus for overexpression of oncogenes in human cells, reducing biosafety risks and increasing the transduction rate. We also demonstrate the use of polymer complexation to enhance transduction while avoiding aerosol-forming centrifugation of viral particles.

Lentiviruses are a valuable research tool for exploring gene function; however, researchers may wish to avoid production of pantropic lentivirus encoding known or suspected oncogenes. As an alternative, we present a safer protocol for use of ecotropic lentivirus on human cells modified to express the ecotropic receptor mSlc7a1.

تنبيغ من خلايا الإنسان مع البوليمر المعقد Ecotropic الفيروسة البطيئة للسلامة الأحيائية المحسن

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for ...

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various pathways1,2. However, conditional knockdown of gene expression is required in cases when constitutive knockdown is not tolerated by cells for a long period of time3-5. Here we describe a protocol for preparation of cell lines allowing conditional knockdown of subunits of the ACF chromatin remodeling factor. These cell lines facilitate the determination of the contribution of ACF to induction of cell death by the adenovirus E4orf4 protein6. Sequences encoding short hairpin RNAs for the Acf1 and SNF2h subunits of the ACF chromatin remodeling factor were cloned next to a doxycycline-inducible promoter in a plasmid also containing a gene for the neomycin resistance gene. Neomycin-resistant cell clones were selected in the presence of G418 and isolated. The resulting cell lines were induced by doxycycline treatment, and once Acf1 or SNF2h expression levels were reduced, the cells were transfected with a plasmid encoding E4orf4 or an empty vector. To confirm the specific effect of the shRNA constructs, Acf1 or SNF2h protein levels were restored to WT levels by cotransfection with a plasmid expressing Acf1 or SNF2h which were rendered resistant to the shRNA by introduction of silent mutations. The ability of E4orf4 to induce cell death in the various samples was determined by a DAPI assay, in which the frequency of appearance of nuclei with apoptotic morphologies in the transfected cell population was measured7-9.
The protocol described here can be utilized for determination of the functional contribution of various proteins to induction of cell death by their protein partners in cases when constitutive knockdown may be cell lethal.

Contribution of the ACF chromatin remodeling factor to E4orf4-induced cell death was measured. The protocol includes selection of cell clones in which doxycycline treatment induces conditional knockdown of the ACF subunits Acf1 and SNF2h, and use of the DAPI assay to measure E4orf4-induced cell death in the inducible cell lines.