يسمح هذا البروتوكول بتحديد وعزل الخلايا الجذعية السرطانية بطريقة قوية باستخدام التشبيك الوظيفي وتوصيف الفينوتيبيك. يمكن أن يكون عزل الخلايا الجذعية السرطانية من عينة الورم منصة لتوجيه التطبيق السريري لعلاجات محددة للأورام الفردية ، والتنبؤ بالمقاومة وما يترتب على ذلك من تكرار. لإعداد الثقافات تعليق غير الملتزم، أولا معطف حاويات ثقافة الخلية مع 50 ميكرولتر لكل سنتيمتر مربع من 15 ملليغرام لكل ملليلتر من البوليهيما، ووضع الحاويات في فرن تجفيف 37 درجة مئوية لمدة يومين على الأقل.
عندما تكون الحاويات جافة بالكامل ، اغسل في 80 إلى 90 في المئة من خلية السرطان التقاء ثقافة خط مع برنامج تلفزيوني ، وفصل الخلايا مع ملليلتر واحد إلى 2 من التربسين EDTA. بعد خمس دقائق في 37 درجة مئوية، اعتقال رد الفعل مع 2-4 ملليلتر من خلية جديدة ثقافة المتوسطة، وغسل الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي. إعادة تعليق بيليه في ثقافة جديدة المتوسطة للعد، وتمييع الخلايا في مجال جديد زراعة المتوسطة التي تحتوي على اثنين في المئة السليلوز الميثيل في 500 إلى 2000 الخلايا لكل سنتيمتر مربع في تركيز طبق الثقافة.
لضمان أحادية المجال، بذور كل خط خلية في كثافة منخفضة في بيئة خالية من المرسى. ثم بذور الخلايا على لوحات البوليهيما المغلفة لمدة خمسة أيام حضانة في 37 درجة مئوية وخمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون، مضيفا عشرة نانوغرام لكل ملليلتر من عامل النمو البشرة وعشرة نانوغرام لكل ملليلتر من عامل النمو الليفي الأساسية إلى متوسطة ثقافة الخلية كل يومين. بعد ثلاثة إلى اثني عشر يوما بعد الطلاء، يجب أن يلاحظ ثلاثي الأبعاد مستعمرات الخلايا على شكل الكرة عن طريق المجهر الخفيفة.
للحصول على السكان المتصّقين المشتقين، نقل المجالات إلى طبق ثقافي جديد في ظل ظروف الثقافة المناسبة لخط الخلايا السرطانية الأصلي. بعد يوم إلى يومين من الثقافة، ينبغي ملاحظة أحادية الخلية تنمو حول المجالات المرتبطة مع مورفولوجيا مماثلة لتلك التي من خط الخلية المنشأ. لتحديد قدرة تشكيل المجال من خط الخلية السرطانية من الفائدة، بعد الانتهاء من بروتوكول تشكيل الكرة، وجمع المجالات عن طريق الطرد المركزي.
بلطف resuspend الكرة بيليه في وسط جديد، واستخدام مقياس الهيموسيتات لحساب عدد من المجالات مع أكبر من 40 ميكرومتر القطر. ثم حساب نسبة النسبة المئوية للحصى التي تم الحصول عليها مقابل عدد الخلايا مطلية في البداية. لتحديد القدرة على التجديد الذاتي من خط الخلية من الفائدة، وجمع المجالات عن طريق الطرد المركزي وبلطف resuspend الكرة بيليه في تريبسين EDTA لمدة خمس دقائق الحضانة في 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، إضافة إنزيم وتنشيط المتوسطة إلى الأنبوب، وماصة الحل للحصول على تعليق خلية واحدة. باستخدام مقياس قياس الهيموزيت وطريقة الاستبعاد الأزرق trypan، عد الخلايا القابلة للحياة في التعليق وطبقة الخلايا في لوحات مغلفة polyHEMA لمقايسة تشكيل الكرة كما أظهرت للتو. بعد ثمانية أيام، استخدم مقياس الهيموسيتات لحساب عدد المجالات التي يزيد قطرها عن 40 ميكرومتر، وحساب النسبة المئوية للمجالات التي تم الحصول عليها مقابل عدد الخلايا المطلية في البداية.
لتقييم المنطقة التي تحتلها المجالات، ضع طبق الثقافة على خشبة مسرح مجهر مقلوب مجهز بوحدة اقتناء الصور وحدد تكبيرًا من 100X إلى 400X. الحصول على صور لا يقل عن عشرة حقول عشوائية لكل حالة، واستخدام برنامج تحليل الصور المناسبة لرسم المناطق من الاهتمام حول المجالات. ثم قم بقياس مساحة كل منطقة موضع اهتمام بالبكسل وحساب مساحة الإسقاط الكروية كمساحة متوسطة للبكسل المقاسة.
إن التوصيف الوظيفي للقدرة على تشكيل المجال، والتجديد الذاتي، ومنطقة الإسقاط في الخلايا الجذعية السرطانية يسمح بمقارنة نسبها البعيدة وأنسجتها الأصلية. يسمح بروتوكول تشكيل الكرة بالحصول على المستعمرات الكروية في تعليق من عدة خطوط خلايا بطانة الرحم وسرطان الثدي أو بعد الهضم الأنزيمي اللطيف للأنسجة من عينات الورم البشري. كل من بطانة الرحم وسرطان الثدي المجالات تؤدي إلى أحادية الخلية مع morphologies مماثلة لخط الخلية من أصل واحد إلى يومين بعد الطلاء.
في هذه التجارب التمثيلية، أظهرت الخلايا الإيجابية لسرطان الثدي من قبل المستقبلات الهرمونية MCF-7 قدرة أعلى لتشكيل المجال، والقدرة على التجديد الذاتي، ومنطقة الإسقاط من خلايا سرطان الثدي ثلاثية السلبية HCC1806. وإلى جانب تخصيب الخلايا الجذعية السرطانية عبر بروتوكول تشكيل المجال، نوصي بإجراء مزيد من التقييم لرقمها باستخدام أساليب تكميلية مثل عملية استئصال الخلايا المتدفقة. في هذا التحليل التمثيلي للمجالات التي تم الحصول عليها من خطوط الخلايا بطانة الرحم، تم تحديد أربع مجموعات من الخلايا التي تعبر عن علامات الخلايا الجذعية السرطانية في كل خط خلية عن طريق قياس التدفق الخلوي.
تقييم مجالات الورم من قبل تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأخرى يمكن أن تكون تأكيدية من الجذعية، ولدونة الخلايا الجذعية السرطانية وتسهيل تطوير العلاجات المستهدفة. تحليل لطخة الغربية بعد حصاد الكرة لطيف كشفت أيضا النمط الظاهري الخلايا الجذعية السرطانية للمجالات التي ولدت في المختبر. يساهم بروتوكول العزل هذا في فهمنا لأهمية الخلايا الجذعية السرطانية التي تترجم سريريًا إلى فهم الانتكاس والانبثاث ومقاومة العلاج.
