نشكر J. جارسيا لسيلما، أنا سميرنوفا وR. Kaback من أجل التبرع لقياسات المزركشة وE. بامبرج للحصول على الدعم ومناقشات مفيدة.

<ol>
	<li>Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+transport+by+ion+translocating+membrane+proteins+on+solid+supported+membranes.">Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 64, 384-391 (1993).</li><li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-based+electrophysiology.">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li><li>Garcia-Celma, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+activation+of+the+melibiose+permease+MelB+immobilized+on+a+solid-supported+membrane.">Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane.</a> Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).</li><li>Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+mechanism+and+pH+regulation+of+the+Na+/H++antiporter+NhaA+from+Escherichia+coli:+an+electrophysiological+study.">Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study.</a> J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).</li><li>Zhou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+translocation+during+cosubstrate+binding+in+the+Na+/proline+transporter+of+E.coli.">Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli.</a> J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).</li><li>Ganea, C., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transporters:+charge+translocation+and+mechanism.">Bacterial transporters: charge translocation and mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).</li><li>Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G215R+mutation+in+the+Cl-/H+-antiporter+ClC-7+found+in+ADO+II+osteopetrosis+does+not+abolish+function+but+causes+a+severe+trafficking+defect.">The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect.</a> PLoS ONE. 5, e12585 (2010).</li><li>Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+ion+channels+on+solid+supported+membranes.">Measuring ion channels on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 97, 388-396 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+LacY.">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+electrogenic+reactions+during+lactose/H++symport.">Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport.</a> Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

1. مزايا الكهربية المستندة إلى SSM بالمقارنة مع الطرق التقليدية وقد ثبت الكهربية المستندة إلى SSM نفسها كأداة قيمة من مربع الأدوات الكهربية. انها مفيدة بشكل خاص في الحالات التي لا يمكن فيها تطبيق اتفاقية الكهربية، وهي المشبك التصحيح وطرق المشبك الجهد، و: وبصرف النظر عن بعض الاستثناءات النادرة نقل البكتيرية لا يمكن التحقيق باستخدام المشبك الجهد أو أساليب المشبك التصحيح بسبب صغر حجم البكتيريا، ولأن أنها صعبة للتعبير في خلايا الثدييات أو البويضات. ولكن أيضا من الناحية الفسيولوجية نقل الثدييات ذات الصلة يمكن التحقيق. في هذه الحالة الكهربية المستندة إلى SSM جذابة للنقل من أغشية الخلايا وللتطبيقات الفحص في اكتشاف المخدرات بسبب متانة وقدرته على التشغيل الآلي. SSM-basedUsing التقليدية الكهربية، والوقت توصيف حل من TRANSPorters يمثل تحديا. منذ دوران ناقلات منخفضة A &#39;التصحيح العملاقة&#39; أو مطلوب التكوين &#39;خلية كاملة &quot;، والتي يكون لها القرار وقت منخفضة بطبيعتها في تجربة تبادل الحلول. ويمكن التغلب على المضاعفات باستخدام الإفراج الركيزة التحلل الضوئي. ومع ذلك، هي مناسبة فقط لعدد محدود من ركائز لهذا النهج. هنا تبادل حل سريع في SSM يوفر فرصة فريدة لإجراء دراسات الكهربية مع قرار الأوان باستخدام ركائز التعسفي. 2. القيود والخطوات الحاسمة وعلى النقيض من المشبك التصحيح وتقنيات المشبك الجهد، لا يمكن الكهربية المستندة إلى SSM استخدامها لتطبيق المحتملة. ولذلك يقتصر توصيف نقل لنقل وسائط التي لا تعتمد على غشاء المحتملة. بشكل عام، الكهربية المستندة إلى SSM لا يوجد لديه قيود تتعلق بنوع الناقل (كهربي). ولكن CL الجهديمكن أن أساليب المشبك أمبير أو التصحيح لديها مزايا، إذا كانت هناك حاجة مكونات داخل الخلايا مثل البروتينات ملزمة حصول على وظائف البروتين. يمكن أن تنشأ القيود، إذا تبادل حل يخلق تيارات قطعة أثرية كبيرة. يحدث هذا عندما يتفاعل بقوة مع الركيزة SSM مثل في حالة مركبات محبة للدهون. ضوابط قطعة أثرية يمكن استخدامها لتصحيح الإشارات المقاسة. خلفية عالية من الملح علاوة على ذلك في جميع مخازن قياس يمكن استخدامها للحد من القطع الأثرية. ولكن في حالات، حيث حجم قطعة أثرية مشابه لإشارة البروتين، فإنه يكاد يكون من المستحيل عزل إشارة ذات صلة البروتين من القطع الأثرية. لحسن الحظ، والتحف عالية غير عادية في تبادل حل الأمثل. هناك بعض الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق النجاح في تجربة الكهربية المستندة إلى SSM. إعداد نموذج البروتين هو الجزء الأكثر أهمية. إذا تم استخدام proteoliposomes، تأكد من أن reconsعملية titution غلة نظيفة، عينة استنساخه من LPR كافية ونقل هو المنحى في الطريق الصحيح. وLPR يمكن فحصها من قبل تجميد كسر المجهر الإلكتروني والتوجه تجربة ELISA إذا كانت الأجسام المضادة المتاحة. لا تستخدم سوى SSM مما يدل على المعلمات الأمثل لاحتضان العينة البروتين. حقن هذا البروتين هو خطوة حاسمة أخرى. صوتنة ضروري وينبغي تجنب فقاعات الهواء أثناء الحقن. بعد مرور فترة الحضانة عينة القياسات نفسها هي الحاسمة، لأن فقاعات الهواء سيزيل عينة بروتين كثف من رقاقة الاستشعار. لذلك دائما إزالة فقاعات الهواء بعد تغيير الحلول. ومع ذلك يمكن أن يحدث المتهدمة إشارة. لتصحيح ممكن المتهدمة إشارة، فإنه من الضروري لإنجاز الضوابط المتهدمة أثناء التجربة. 3. الأنظمة المتخصصة يمكن تعديل الإعداد SSM وفقا لتطبيقه. وعلاوة على ذلك رهنا مختلفة تماما الاجهزة درجة عالية من التخصص المتاحة،. هناك إمكانية لقياس إشارات البروتين في ظل ظروف غير متكافئة، على سبيل المثال في إطار التدرج درجة الحموضة. لإنشاء التراكيب العازلة غير المتكافئة داخل وخارج proteoliposomes حل ثالثا، الحل يستريح، لابد من عرضه وهذا يتطلب تكوين Exchange مزدوجة. هنا لا بد من وضع صمام ثلاثي إضافية التبديل بين حلول غير تفعيل ويستريح. لزيادة دقة الوقت للنظام وضعنا مسارا تدفق البديلة تفتقر إلى صمام محطة، ولكن باستخدام نوع مختلف من كفيت. هنا يقع على تقاطع تفعيل وحل غير تفعيل داخل كفيت، 3 ملم أمام SSM. هذا الإعداد هو مناسبة تماما لتحليل الحركية من عمليات النقل السريعة. ويمكن أن يتبين من ذلك أن القرار وقت منخفضة تصل إلى 2 ميللي ثانية هو ممكن. و التجاريةمع ully تتوفر النظم الآلية تهدف إلى إنتاجية أعلى بكثير لفحص المخدرات. وحدة منقولة بجمع الحلول ويحقن لهم على سطح جهاز الاستشعار في لوحات 96 بئر في شكل وحة microtiter القياسية.

نحن هنا لشرح نهج الكهربية جديدة تقوم على غشاء الصلبة المدعومة (SSM) لتوصيف البروتينات الغشاء كهربي. يتكون دعم قوي من طبقة رقيقة من الذهب على شريحة زجاجية، ورقاقة الاستشعار. يتم استخدام سطح ماء الذهب لربط مجموعة ثيول من كاشف alcanethiol. بعد ذلك، selfassembly من monolyer فسفاتيديل اكتمال تشكيل SSM. لقياس ردود فعل كهربي من بروتينات الغشاء، وكثف proteoliposomes أو شظايا الغشاء إلى SSM (الشكل 1). البروتين تحتوي على غشاء وSSM ثم تشكيل نظام غشاء جانب capacitively. ولذلك، إزفاء المسؤول في البروتين تحتوي على غشاء يمكن الكشف عنها بواسطة اقتران بالسعة عن طريق SSM. هذه الطريقة تعطي فقط تيارات عابرة. يمثل الحالي ذروة نشاط النقل ثابتة. الساعة تعتمد مكعب نقلrrents يمكن بناؤها بواسطة تحليل الدوائر. هي التي شنت على رقاقة الاستشعار في نظام كفيت (الشكل 2). كفيت لديها حجم كفيت اسطواني من 17 ميكرولتر (الحجم الصافي مع O-حلقة شنت). A دبوس الاتصال الربيع يخلق الاتصال إلى مكبر للصوت. هو مشدود موصل منفذ إلى الجزء العلوي من الجزء الرئيسي ويحمل الإلكترود المرجعي، سلك الفضة المكلورة. هي التي شنت كفيت في قفص فاراداي. توصيله إلى مسار السائل، والذي يستخدم للحث على نشاط النقل من البروتين غشاء ردا على تبادل حل سريع (الشكل 3). في حل واحد تبادل بروتوكول حلين، يطلب من واحد غير تفعيل وتنشيط حل واحد،. يتم التحكم في تدفق بواسطة الهواء المضغوط باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة صمام على الكمبيوتر أو التبديل دليل على واجهة مربع.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waterbath Sonicator</td>
 <td>Bandelin</td>
 <td>RK 52 H</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tip Sonicator</td>
 <td>Hielscher Ultrasonics GmbH</td>
 <td>UP50H</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-way valve</td>
 <td>NResearch, West Caldwell, USA</td>
 <td>NR225T011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Terminal valve</td>
 <td>NResearch, West Caldwell, USA</td>
 <td>NR225T031</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manometer</td>
 <td>Greisinger electronics</td>
 <td>GDH 14 AN</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Faraday cage</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvette</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml solution containers</td>
 <td>Kartell</td>
 <td>1623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>O-rings</td>
 <td>Seal Science Inc.</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oscilloscope</td>
 <td>Tektronix</td>
 <td>TDS 1002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reference electrode</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Function generator</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tubings</td>
 <td>SAINT-GOBAIN Performance Plastics</td>
 <td>AAC00006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sensor chip</td>
 <td>Fraunhofer Institut f&uuml;r Schicht und Oberfl&auml;chentechnik</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Interface box</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Keithley</td>
 <td>427</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual cog</td>
 <td>Vygon GmbH</td>
 <td>876</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>USB analog-to-digital converter</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr> 
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Regeants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2&#x2011;Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine</td>
 <td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
 <td>850356</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A3574</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium persulfate</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A3678 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-(+)-Glucose </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>G8270 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>43819</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol absolut</td>
 <td>VWR AnalaR NORMAPUR</td>
 <td>603-002-00-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Natural E. coli lipids polar extract</td>
 <td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
 <td>100600</td>
 <td>for LacY reconstitution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Decane</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D901 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Octadecanethiol</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>O1858 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Octadecylamine</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>74750</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P3786 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P9791 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetramethylethylenediamine</td>
 <td>BIO RAD</td>
 <td>1610801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;-Lactose monohydrate</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L8783 </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

introduction to solid supported membrane based electrophysiology

وتستند هذه الطريقة الكهربية التي نعرضها على غشاء بدعم الصلبة (SSM) تتألف من طبقة octadecanethiol chemisorbed على الذهب المطلي رقاقة الاستشعار وأحادي الطبقة فسفاتيديل على القمة. هي التي شنت هذه الجمعية في نظام كفيت يحتوي على الإلكترود المرجعي، سلك الفضة المكلورة. بعد امتصاص شظايا غشاء أو proteoliposomes يحتوي على بروتين غشاء من الفائدة، يتم استخدام تبادل حل سريع للحث على نشاط النقل من البروتين الغشاء. في حل واحد تبادل بروتوكول حلين، وهناك حاجة واحدة غير تفعيل وتنشيط حل واحد،. يتم التحكم في تدفق بواسطة الهواء المضغوط ونظام صمام والأنابيب داخل قفص فاراداي. يتم الحصول على حركية ونشاط النقل كهربي عبر اقتران بالسعة بين SSM وproteoliposomes أو شظايا غشاء. الأسلوب، وبالتالي، ينتج transien فقطر التيارات. يمثل الحالي ذروة نشاط النقل ثابتة. التيارات الوقت نقل تعتمد يمكن بناؤها بواسطة تحليل الدوائر. يناسب هذا الأسلوب وخاصة بالنسبة للنقل بدائية النواة أو نقل حقيقية النواة من أغشية الخلايا، والتي لا يمكن التحقيق من قبل المشبك التصحيح أو أساليب المشبك الجهد.

حتى الآن، تم استخدام الكهربية المستندة إلى SSM لتوصيف أكثر من 20 الناقلون، معظمهم من أصول بدائية النواة، على سبيل المثال ميلب 3، NhaA 4 و 5 PutP (تلخيصها في 6). ولكن أيضا نقل حقيقية النواة من أغشية الخلايا، على سبيل المثال ClC7 7 وكذلك القنوات الأيونية، على سبيل المثال تم التحقيق مستقبلات أستيل النيكوتينيك 8. هنا نقدم كمثال على قياسات السكر / H + cotransporter لاسي من الإشريكية القولونية باستخدام proteoliposomes مع الجانب الأيمن لا يقل عن 85٪ من التوجه لاسي في LPR من 5 9، 10. ونحن نركز على الخطوات الرئيسية المؤدية إلى الحد الأدنى من نموذج الحركية من هذا البروتين النقل. 1. توصيف الكهربية من لاسي wildtype الخطوة الأولى هي توصيف العام للرد فعل كهربي عن طريق قياس قيم درجة الحموضة مختلفة ( <strong<html> &gt; الشكل 4)، وتركيزات الركيزة (الشكل 5) وركائز. للتحقق من صحة هذه التقنية، واستنسخت K M والقيم PK بالنظر في الأدب. اعتماد الرقم الهيدروجيني للاسي يظهر اثنين من ردود الفعل كهربي مختلفة. الزيادات الحالية إلى جانب capacitively بين درجة الحموضة ودرجة الحموضة 8.5 5، ولكن أيضا إلى تغيير شكله. تحت ظروف قلوية ويلاحظ نقل حالة مستقرة، في حين أن الرقم الهيدروجيني الحمضية القيم فقط يبقى رد فعل كهربي السريع. لتمييز الإشارات حالة مستقرة من ردود فعل كهربي سريع استخدمنا تحليل الدوائر لإعادة بناء التيارات نقل (الشكل 6). في درجة الحموضة 7 يصبح إشارة الطور ثنائي الطور. هذا يشير ايضا الى ان هناك نوعان من ردود الفعل كهربي مختلفة. يقدر من تهمة نقل (يتجزأ من الإشارات)، وردود الفعل لهما حوالي 6٪ و 94٪ من electrogenicity الإجمالية للدورة النقل. ove_step &quot;&gt; 2. التنازل عن ردود فعل كهربي لتعيين اثنين من ردود فعل كهربي إلى خطوات معينة في دورة رد فعل من لاسي، تم قياس متغير لاسي E325A (الشكل 7). هذا البديل لا يظهر الا تبادل اللاكتوز ولكن منقوصة لجميع وسائل النقل النشط، وذلك بسبب تثبيط إطلاق بروتون. إشارة من E325A اسي يمثل عابر سريع وثابت لجميع قيم الرقم الهيدروجيني قياس. الشكل والسعة للإشارة مشابه لإشارة من wildtype لاسي في ظل الظروف الحمضية. وبالإضافة إلى ذلك نلاحظ مرحلة سلبية صغيرة بعد انخفاض الذروة الحالية، والذي هو سمة لتيارات عابرة السريع في نظم قياس جانب capacitively. لأن اللاكتوز ملزمة والإفراج ليس كهربي، وسريع عابر يجب ربط مع الانتقال بتكوين جزئي كهربي بعد اللاكتوز ملزمة. ومن المعروف أن الخطوة الافراج بروتون هو معدل limitiنانوغرام للدوران لاسي في الانحدار وضع اللاكتوز تركيز النقل مدفوعة. في هذه الحالة نحن نتوقع زيادة في معدل النقل مع درجة الحموضة القلوية، لأنه يفضل إطلاق بروتون. هذا هو الحال بالنسبة لنقل حالة مستقرة ترتبط إشارة من wildtype المزركشة. وعلاوة على ذلك يمكن أن تظهر من قبل قياس درجة الحموضة التدرج الا ان درجة الحموضة الداخلية يؤثر على نقل حالة مستقرة من لاسي (غير منشورة). ولذلك يمكن تعيين رد فعل كهربي كبير إلى الخطوة الافراج البروتون. 3. قياسات لتحليل الحركية بعد التعرف على ردود فعل كهربي داخل وخارج أسعار النقل تم تحديد باستخدام الإعداد SSM مع قرار الأوان من حوالي 4.5 ميللي ثانية. هذا ممكن فقط في ظل ظروف، عندما يهيمن رد فعل واحد إشارة. في هذه الحالة يمكن أن تستمد الثوابت معدل من التيارات عابرة تحت النظر في القرار وقت من الإشارات باستخدام تكرارية المربعات الصغرى دي<html> خوارزمية الإلتواء (الشكل 8). الثوابت معدل العزم وكذلك الحد الأدنى من نموذج الحركية المقترح (الشكل 9) واستخدمت أخيرا لمحاكاة حركية نقل. منحنيات محاكاة إنتاج البيانات SSM وهو ما يثبت بالإضافة إلى ذلك النموذج الحركية. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1.jpg" alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1highres.jpg"/> الشكل 1. الامتزاز هندسة proteoliposomes على SSM. ويتكون SSM على رقاقة الاستشعار، والذهب منظم المغلفة شريحة زجاجية. لقياس ردود فعل كهربي من بروتينات الغشاء، وكثف proteoliposomes أو شظايا الغشاء إلى SSM. الأغشية اثنين من تشكيل نظام يقترن capacitively. هذا هو السبب في الكشف عن تيارات عابرة فقط. tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. وSSM كفيت يحمل رقاقة الاستشعار والإلكترود المرجعي. محصورة رقاقة الاستشعار بين قاعدة كفيت ورئيس كفيت. يتم عزل القطب المرجع من مسار تدفق بواسطة مادة هلامية جسر الملح بولكرلميد. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3.jpg" alt="الشكل (3)" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3highres.jpg"/> الشكل (3). المسار السوائل والدائرة الكهربائية من إعداد SSM. في البروتوكول تبادل حل واحد ومطلوب واحد فقط غير المفعل (NA) وتفعيل واحد (A) حل. يتم التحكم في تدفق من قبل اثنين من الصمامات 2 في اتجاه (V1) وصمام محطة واحدة (V2). رموز تبديل صمام محطة بين الحلول غير تفعيل وتنشيط وتوجيه واحدة من الحلول لكفيت والحل الآخر إلى حاوية النفايات (W). يتم توصيل رقاقة الاستشعار (SSM) إلى مكبر للصوت (I / U)،<html> في حين يتم توصيل القطب المرجعي (أجكل) إلى وظيفة مولد (F) في الدائرة الكهربائية الخارجية. ويستخدم جهاز الكمبيوتر (PC) ومربع واجهة للتشغيل صمام والحصول على البيانات. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4.jpg" alt="الشكل 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4highres.jpg"/> الشكل 4. تيارات عابرة يقاس مع proteoliposomes لاسي من النوع البري بعد 100 ملي اللاكتوز يقفز تركيز على قيم درجة الحموضة مختلفة. الحل غير تفعيل الواردة الجلوكوز 100 ملم بينما يحتوي الحل تفعيل 100 ملي اللاكتوز. تم إعداد جميع الحلول في 100 ملي العازلة الفوسفات البوتاسيوم في درجة الحموضة المشار إليه مع 1 ملي DTT. للحصول على تفاصيل من شروط القياس في هذا والأرقام التالية يرجى الرجوع إلى 9 و 10. <html> ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg &quot;/&gt; الشكل 5. بلغ متوسط ​​التيارات الذروة تطبيع قياس مع proteoliposomes لاسي من النوع البري بعد يقفز تركيز اللاكتوز بتركيزات مختلفة وقيم درجة الحموضة. ويتم الحصول على القيم K M من نوبات القطعي. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6.jpg" alt="الشكل (6)" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6highres.jpg"/> الشكل (6). إعادة الإعمار من التيارات نقل. التيارات عابر (A) استخدامها لإعادة بناء التيارات نقل (B) تم قياس مع proteoliposomes لاسي من النوع البري بعد 100 ملي اللاكتوز يقفز تركيز في درجة الحموضة 8.5 (تتبع الأزرق) ودرجة الحموضة 5.2 (التتبع الحمراء). في الرقم الهيدروجيني لوحظ 8.5 دوران مستمر بينما عند pH 5.2 حدوث رد فعل كهربي سريع. ويلاحظ هذا بشكل واضح في التيار أعيد بناؤها (B). files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg &quot;بديل =&quot; الشكل 7 &quot;FO: محتوى العرض =&quot; 4IN &quot;FO: SRC =&quot; / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg &quot;/&gt; الرقم 7. الحالية عابرة يقاس مع E325A proteoliposomes لاسي بعد ملي اللاكتوز الانتقال تركيز 100 في درجة الحموضة 5.2. هذا البديل لاسي هو تحول دون في خطوة الافراج بروتون من دورة النقل وبالتالي النقل التي تعاني من نقص. المكون السلبية الصغيرة احظ هو سمة للتيارات عابرة السريع في نظم قياس جانب capacitively ويسببه تصريف السعة غشاء بعد رد فعل كهربي سريع. يتم تحديد وقت لها π0 مستمرة من جانب السعة والمواصلة للنظام (الشكل 1). <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8.jpg" alt="الرقم 8" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8highres.jpg"/> الرقم 8. تيارات عابرة يقاس مع proteoliposomes لاسي من النوع البري بعد عملية الشراءويلاحظ R مختلفة يقفز تركيز اللاكتوز في درجة الحموضة 5.2. في ظل هذه الظروف لا نقل حالة مستقرة، ولكن انتقال متعلق بتكوين كهربي على اللاكتوز ملزمة. يظهر خط متقطع وظيفة النقل التي تمثل القرار وقت للنظام. وأقحم يظهر عزم وإيقاف ثوابت معدل من الملاحظ kobs ثابت معدل مع نوبة القطعي للبيانات. تم تحديد ثابت المعدل المرصود من التيارات عابرة مع تكرارية المربعات الصغرى deconvolution خوارزمية 10. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9.jpg" alt="الرقم 9" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9highres.jpg"/> الشكل 9. يمكن التعرف على نموذج الحركية للدورة رد فعل من لاسي. خطوتين كهربي وتتميز القياسات SSM. رد فعل كهربي بقوة يمثلون ~ 94٪ من إجمالي النزوح تهمة في رد فعللوحظ دورة إلا عند قيم الرقم الهيدروجيني محايدة والقاعدية. يمكن أن تسند إلى خطوة الإفراج البروتون (السهم الأزرق). ويلاحظ وجود خطوة كهربي ضعيف في درجة الحموضة الحمضية عندما يتم تحول دون دوران مستمر من النوع البري لاسي. نحن تعيين هذا رد فعل على عملية انتقال بتكوين جزئي كهربي على اللاكتوز ملزم، وهو ما يمثل 6٪ من إجمالي النزوح تهمة في دورة التفاعل.

Watch this Scientific Journal Video about Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology at JoVE.com

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

هنا نقدم طريقة الكهربية يعتمد على الأغشية الصلبة معتمدة مع التركيز على تطبيقاتها لتوصيف نقل غشاء كهربي.

مقدمة إلى صلب غشاء المعتمدة واستنادا الكهربية

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

introduction-to-solid-supported-membrane-based-electrophysiology

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K Views.  Max Planck Institute of Biophysics. هنا نقدم طريقة الكهربية يعتمد على الأغشية الصلبة معتمدة مع التركيز على تطبيقاتها لتوصيف نقل غشاء كهربي.

Video: Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

تطبيق على microfluidics لالكهربية

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

دراسة النشوء الأحيائي الأغشية مع الفحص الجيني مراسل Luciferase المستندة

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

الحبل الشوكي الكهربية

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

مقدمة لمختبر دودة : من الديدان إلى التثقيف الطفرات

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

اللوحة الصلبة المستندة إلى تقييد الغذائية في انواع معينة ايليجانس</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

في دراسة لالإلتقام وإعادة غشاء البلازما من البروتينات القائم على خلية L-الجلوتاثيون حماية فحوصات

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

تروية دقيقة التقنية المعنية بالتحقيق في تنظيم Microvessel النفاذية في الفئران مساريق

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

الدولة الأرض استنفاد القرار فائقة التصوير في خلايا الثدييات

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

تطبيق القياس الكهربية لدراسة نشاط الناقلين محايدة الكهربائية

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...