Biz destek ve yararlı tartışmalar için dantelli ölçümleri ve E. Bamberg katkı J. Garcia-Celma, ben Smirnova ve R. Kaback teşekkür ederim.

1. SSM tabanlı Elektrofizyoloji için bir cihaz ayarlama Detayları da şematik çizimler ve küvetler fotoğraflarını içeren ve 1, 2 kurmak teknik yayınlar, iki verilmiştir. Farklı bir çözüm Döviz yapılandırmaları ve akış protokolleri aynı zamanda yöntemi kağıt 2 tartışılmıştır. Aşağıda bir kaç son gelişmeler ve video sunumu için doğrudan ilgili olan teknik ayrıntıları ekleyin. Valf kontrolü ve veri toplama Arayüz kutusu ticari bir USB dijital çıkış / analog giriş arabirimi (NI USB 6009 National Instruments) ve valf sürücüleri içerir. Bu çözelti akışını kontrol ve veri toplama için sorumludur. Vanalar normalde hızlı vanalar 18 kadar bir gerilim ile tahrik V. Videoda bir 12 V güç kaynağı kullanmak olabilir geçiş için, Ancak 12 ile tahrik V. vardır. &lt;/ P&gt; Vana sürücü devre kartı dört valf çalışabilir. Bu Biyofizik Max Planck Enstitüsü servis tarafından imal edilmiştir. Vanalar ön panelde anahtarı üzerinden bilgisayar veya el ile kontrol edilebilir. İkinci temizlik işlemleri ve yıkama için uygundur. Ölçüm sırasında, arayüz kutusu bir vana kontrolü ve veri toplama yazılımı (surfe 2 R yazılımı, IonGate Biosciences) kullanarak bilgisayar kontrollü olduğunu. 2. Hazırlıklar Bu bölümde bir SSM-tabanlı deney elektrofizyoloji hazırlanması için farklı protokoller bahsedilmiştir. 2.1 SSM oluşumu için Lipid çözüm yapma <ol><li> 25 ul oktadesilamin (Kloroform içerisinde 5 mg / ml) ve bir cam şişe içinde 375 ul Diphytanoylphosphatidylcholine (Kloroform içinde 20 mg / ml) karıştırın. </li><li> Bir döner buharlaştırıcı ve sürekli bir nitrojen gazı akışı kullanılarak, için kloroform buharlaşmasıyaklaşık 30 dakika. </li><li> N-dekan 500 ul ile çalkalayarak cam şişe duvarlarından lipid çıkarın. Nihai lipit konsantrasyonuna 1:60 (w / w) oktadesilamindir ile 15 mg / ml &#39;dir. </li><li> Cam saklama kabı çözüm aktarın. -20 ° C&#39;de lipid çözüm Mağaza </li></ol> Referans elektrotunun 2.2 Klorlama Referans elektrotlar aşınma nedeniyle düzenli aralıklarla klorlu gerekir. <ol><li> Klorlama işleminden önce ince zımpara kullanarak eski gümüşklorid tabakasının dayanağını çıkarın. </li><li> 1 M hidroklorik asit solüsyonu içine bir platin elektrot ile birlikte gümüş tel yerleştirin ve 0,5 mA, 15 dakika boyunca klorlama. Klorlama tamamladıktan sonra, gümüş tel homojen bir koyu gri rengini değiştirir. </li></ol> Poliakrilamid jel köprünün 2.3 hazırlanması <ol><li> 100 mM pH değerinde KPI = 7, 100 mM KCI, 6 ihtiva eden bir çözelti hazırlayın% Acrylamid. </li><li> % 0.3 APS (% 10 Stok) ekleyin ve% 0.6 TEMED ve kısa bir pipet ile çözüm karıştırın. </li><li> Hemen çözelti karıştırıldıktan sonra, boş jel köprü kabına karışım, 30 ul enjekte etmek için bir pipet kullanın. Bu enjeksiyon sırasında hava kabarcıklarını önlemek için önemlidir. </li><li> 20 dakikalık bir inkübasyon süresi sırasında jel polimerize olur. </li><li> Polimerizasyon sonrası jel köprü çözeltisi (100 mM KPI pH 7, 100 mM KCI) depolanır. Jel köprünün ömrünü uzatmak için, çözelti 4 ° C sıcaklıkta saklanır </li></ol> Ölçüm çözümler 2.4 hazırlanması Farklı bileşimin çözümler değiştirilmesi durumunda, SSM çözünenlerin kuvvetli etkileşime bağlı olarak, elektrik eserler oluşturulur. Bu nedenle, solüsyonların hazırlanması için önemli bir adımdır. Çözüm Döviz eserler en aza indirmek için çözüm hazırlık sürecinde aşağıdaki önlemleri alın. <ol><li> Olmayan aktive ve bir partiden çözümler aktive olun, pH ve iyonik kuvvet ayarlayın. </li><li> Yüksek tuz arka plan çözüm Döviz eserler azaltmaya yardımcı olur. </li><li> Iki cilt halinde toplu çözüm bölün. </li><li> Aktive çözeltisine aktive edici bileşik ekleyin. Mümkün olduğunca benzer ozmolarite ve her iki çözüm iyonik gücünü tutmak için olmayan aktifleştirici çözelti içinde bir telafi edici bileşiğin kullanımı. </li><li> Çözümleri 4 ° C&#39;de saklanır ise, sıcaklık hatta küçük farklılıklar eserler üretebilir çünkü tüm çözümler, bir ölçüm başlamadan önce oda sıcaklığına ulaşıldığında emin olun. </li></ol> 3. Bir SSM tabanlı Elektrofizyoloji Deney Burada bir SSM-tabanlı bir deney elektrofizyolojik için tipik bir protokol mevcut. 3.1 SSM Kurulum hazırlanması SSM Kurulum kullanımda değilken tüpleri% 30 etanol ile doldurulur/ Su çözeltisi bakteri büyümesini önlemek için. <ol><li> Küvet monte etmeden önce, borunun ikinci etanolü ortadan kaldırmak için saf su ile yıkama sistemi. Su kapları ile etanol kaplar değiştirin. Yüksek basınç (0.6 ila 1.0 bar) yaklaşık 20-30 ml su ile sistem temiz kullanma. </li><li> PH 7.6 ya da olmayan aktive çözüm bir 100 mM KPI tampon kullanarak temizleme işlemi tekrarlayın. </li><li> Hava kabarcıkları sıvı sistemde kalır emin olun. </li></ol> 3.2 küvet Montaj <ol><li> Referans elektrot bir o-ring takın </li><li> Saklama çözeltisinden jel köprüyü ve referans elektrotu, bağlayın. </li><li> Önceden doldurunuz olmayan aktive tamponu ile çıkış konektörü, bir o-ring takın ve referans elektrot montaj tamamlamak için jel köprü bağlayın. Hava kabarcığı jel köprü ve çıkış çözelti akış yolunun kavşağında olduğunu özel dikkat gösterin. </li><li> Cuve ana parçası Preassembleyaylı kontak pin (amplifikatör bağlantısı), giriş borusu (terminal vana bağlantı), o-ring (SSM için sızdırmazlık) ve vidaları ekleyerek tte. </li><li> Bir cımbız kullanarak, depolama çözümü (etanol içinde 10 mM octadecanethiol) ve sensör çipi çıkarın. </li><li> Bir pipet kullanarak, yakl kalan çözüm yıkayın. Saf etanol, 5 ml. </li><li> Azot gazı altında elektrot kurutun. </li><li> Giriş küvetin ana parçanın menfezi, böylece küvet taban kısmının üzerine doğru bir sensör çipi yerleştirin sensörün dairesel aktif alanına yönlendirilir. </li><li> Sensör çipin aktif alanın lipid çözeltinin 1 ul ekleyin. Altın tabakası tam lipid kapalı olduğundan emin olun. </li><li> Hemen lipid çözeltisi ilave edildikten sonra, önceden monte edilmiş bir ana bölümü ekleyerek küvet kapatın. </li><li> Faraday kafesi içine küvet monte etmeden önce, tüm yüzeyler tamamen kuru olduğundan emin olun. </li><li> Idareterminal valf için yaylı kontak pin ve giriş tüp amplifikatör ect. Daha sonra Faraday kafesi içindeki vida ile küvet düzeltmek. </li><li> Küvet en üstüne çıkış konektörü takın. Son olarak, çıkış konektörü ve referans elektrot için voltaj jeneratörüne çıkış borusuna bağlanabilir. </li><li> Hemen montaj sonra küvet 0,6 barda tamponu ile yıkama sistemi. Bu kendiliğinden SSM oluşumuna yol açar. </li></ol> 3.3 Ölçüm membran parametreleri SSM kalitesini kontrol etmek için, kapasite ve iletkenlik fonksiyon jeneratörü kullanılarak ölçülür. <ol><li> Fonksiyon jeneratörü kullanarak, iletkenlik ölçmek için 100 mV DC gerilim uygulanır. </li><li> Iletkenlik hesaplayın: Mevcut çürüme membran kondansatör şarj gösterir. Kapasitör sonra tam olarak ölçülen akım verimleri Ohm kanunu kullanarak membran iletkenlik tahsil edilir. Basitlik uğruna biz cu kullanınrrent 1 saniye voltaj sonra iletkenlik G = I / ABD hesaplamak için uygulanan </li><li> Genlik ve kapasite ölçmek için 0,5 Hz frekans zirve için 50 mV tepe bir üçgen AC gerilim uygulanmalıdır. </li><li> Kapasite hesaplayın: elde edilen kare dalga akım genliği kapasitör şarj akımları temsil eder. Kapasite C transfer yüküne eşittir Q = ΔU = 100 mV bölünmesiyle IΔt. (Ben üçgen gerilim fark mevcut olumlu eksi negatif eğim olduğu için ΔU iki kez 50 mV uygulanan gerilimdir.) </li><li> Art arda membran için yaklaşık her 10 dakikada bir elektriksel parametreler izleyin. Sabit değerler ulaşana kadar 30 ila 40 dk. 1-0,6 yaklaşık bar aralığında yüksek basınçta KPI tamponu ile arasında yıkayın. </li><li> SSM kalitesi tahmin: optimal koşulların 0,1-0,2 nS ve 2-3,5 nF aralığında bulunmaktadır. 1 nF altında 0.8 nS ve düşük kapasite üzerinde bir yüksek iletkenlik gösterirSSM doğru oluşmuş olmadığını. 4 nF üzerinde bir yüksek kapasite aktif bölge SSM tarafından tamamen kapalı olmadığını anlamına gelebilir. </li><li> Parametreleri uygun aralık içinde değilse, membran atılmalıdır ve başka SSM taze hazırlanmış bir elektrot çipi kullanılarak hazırlanmıştır. </li></ol> Çözüm Döviz eserler için 3.4 Denetimi Membran parametreleri kontrol edildikten sonra, ölçüm tamponlar çözüm alışverişi eserler için test edilmelidir. <ol><li> Sıvı sistemi için ilgili çözelti kapları yerleştirin. </li><li> Manuel vanalar kullanarak, akışkan sistem hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> Veri toplama yazılımı kullanmak, deneyde kullanmak istediğiniz akış protokolü seçti. </li><li> 0,6 bar basınç ayarlayın ve ölçüm başlar. </li><li> Ayrı mekanik kapak anahtarlama eserler, ideal bir eser akım ölçülmelidir ya da çok SMA olmalıdırbeklenen protein taşıma sinyalleri daha ller. Çözüm Döviz eserler gözlenmesi halinde, deney devam etmeden önce tampon kompozisyon ve / veya hazırlık işlemi optimize etmek için deneyin. </li></ol> 3.5 protein örnek ekleme Ortalama proteoliposomes ya da zar parçalarının -80 ° C&#39;de saklanır Bir ölçüm için yaklaşık 30 ul&#39;lik bir kısım gereklidir. <ol><li> Olmayan bir aktive edici çözeltisi ile SSM durulayın. </li><li> Buz üzerinde protein örnek çözülme. </li><li> Üç 10-saniye sonikasyon döngüleri buz üzerinde 10 sn soğutma aralıklarla dönüştürülebilir. Proteoliposomes banyo sonikatör kullanarak sonicated vardır. Membran parçaları için bir ipucu sonikatör (50W, 30 kHz, 1 mm sonotrode çapı, yoğunluğu% 20, çevrim 0.5) kullanılır. Son Sonication adımdan sonra buz geri örnek koymayın, ancak küvet içinde hemen enjekte. </li><li> Sökün çıkış referans elektrot asse ile birlikte konektörümontajları. </li><li> Bir pipet kullanarak, protein örnek 30 ul aspire ve delik prizine pipet monte edin. </li><li> Atık kaba olmayan aktive yolunda manuel vanasını açın ve küvet hacmi içine proteoliposomes enjekte. Sensör ile küvet hacmi içine hava enjekte dikkat edin. </li><li> Pipet çıkarmadan önce, daha fazla çözüm akışını önlemek için el vanasını kapatın. </li><li> Proteoliposomes 1 ile 2 saat bir inkübasyon süresi için SSM yapışır izin verin. Bu, gece boyunca inkübe etmek de mümkündür. </li></ol> Bir SSM-tabanlı deney 3,6 Genel Prosedür <ol><li> 4 ° C&#39;de saklandığında, zaman içinde ölçüm tamponlar Isınma Tüm ölçüm tamponlar eserler önlemek için ölçüm başlamadan önce oda sıcaklığında olması gerekir. </li><li> Çözümler değiştirirken, ilk olmayan bir tüylenme doku ile çözüm kaplar içindeki tüpler temizleyin, sonra yeni şişe yerleştirin. </li><li> Ölçüm başlamadan önce, değişen işlem evrimleşmiş olabilir hava kabarcıkları, kaldırmak için el vanaları kullanın. </li><li> Sadece bir ölçüm başlamadan önce basıncını ayarlayın. Biz rutin özel valf ve boru yapılandırması, yaklaşık 1.0 ml / sn &#39;lik bir akış hızı sağlar 0.6 barlık bir basınç kullanımı. </li><li> İlk birkaç ölçümler birbiri ardına düz bir yapılabilir ve tepe akımı sabit kalır kadar reddedilmelidir. Solüsyonları pH farklılık varsa, en az 3 dakika arasında bir inkübasyon süresi ölçümlerine başlamadan önce proteoliposomes iç pH değerini ayarlamak için gereklidir. </li><li> Şimdi kurulum ölçüm için hazırdır. Gürültüyü azaltmak için en az 3 ölçüm yapılmış ve ortalaması alınmalıdır. </li></ol> 3.7 Kontrol Ölçümleri Ölçümler bir dizi sırasında bir sinyal özet protein yıkımı veya adsorpsiyon bir kaybı nedeniyle oluşabilir. Her SSM deney i olmalıdıryıkık bir denetim nclude. Bu aynı çözümleri ile tekrarlanan ölçümler yapılır. En az bir özet kontrolü aynı çözeltisi kullanılarak, tek bir ölçüm başında ve deney sonunda biri anlamına gelir. Biz deney en yüksek tepe genlik bekliyoruz koşullar altında yıkık kontrolü yapmak için tavsiye. Bu daha kolay sinyalin özet ölçmek için yapar. Sinyal özet iki özet kontrollerin zirve amplitüdleri arasında bir karşılaştırma ile tayin edilebilir. Elde edilen yüzde değeri hatlarıyla lineer bir zaman bağımlılığı varsayılarak ölçülen sinyallerin düzeltmek için kullanılabilir. 3.8 Artifact kontrolleri Mümkünse deney sonra ilgi inhibe protein, sonuçlarınızı doğrulamak için deneyin. Kalan sinyalleri muhtemelen çözüm Döviz eserler bulunmaktadır. Sinyallerin, daha sonra ölçülen eserler için düzeltilmesi gerekir. <ol><li> Saf 20-30 ml su ve% 30 etanol / 20-30 ml su ile yıkama sistemi. Sistem kullanımda değilken etanolik çözüm bakteri üremesi önler. </li><li> Bu temizleme işleminden sonra, sistemden basıncı serbest bırakmak ve tüm aletleri kapatın. </li><li> Faraday kafesi gelen küvet çıkarın ve bağlantısını kesmek. Küvet tüm parçaları bir banyo sonikatörü kullanılarak, gerekirse su ve saf etanol ile temizlenebilir. </li><li> Saf etanol ile bir cam beher sensör çipi yerleştirin. Banyo sonikatör kullanılarak 2-1 dakika boyunca sonikasyon beher. </li><li> Azot gazı altında sensör çipi kurutun. </li><li> 10 mM&#39;lik bir Octadecanthiol etanolik çözelti içinde ışıktan uzak sensör çipi saklayın. Yaklaşık 30 dakika arasında bir inkübasyon süresinden sonra sensör çipi yeniden kullanım için hazırdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+transport+by+ion+translocating+membrane+proteins+on+solid+supported+membranes.">Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 64, 384-391 (1993).</li><li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-based+electrophysiology.">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li><li>Garcia-Celma, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+activation+of+the+melibiose+permease+MelB+immobilized+on+a+solid-supported+membrane.">Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane.</a> Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).</li><li>Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+mechanism+and+pH+regulation+of+the+Na+/H++antiporter+NhaA+from+Escherichia+coli:+an+electrophysiological+study.">Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study.</a> J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).</li><li>Zhou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+translocation+during+cosubstrate+binding+in+the+Na+/proline+transporter+of+E.coli.">Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli.</a> J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).</li><li>Ganea, C., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transporters:+charge+translocation+and+mechanism.">Bacterial transporters: charge translocation and mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).</li><li>Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G215R+mutation+in+the+Cl-/H+-antiporter+ClC-7+found+in+ADO+II+osteopetrosis+does+not+abolish+function+but+causes+a+severe+trafficking+defect.">The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect.</a> PLoS ONE. 5, e12585 (2010).</li><li>Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+ion+channels+on+solid+supported+membranes.">Measuring ion channels on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 97, 388-396 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+LacY.">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+electrogenic+reactions+during+lactose/H++symport.">Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport.</a> Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

1. SSM-tabanlı elektrofizyoloji avantajları geleneksel yöntemlere göre SSM tabanlı elektrofizyoloji elektrofizyolojik araç değerli bir araç olarak kendini kanıtlamıştır. Bu kongre elektrofizyoloji, yani yama kelepçe ve gerilim kelepçe yöntemleri, uygulanamaz durumlarda özellikle yararlıdır: Apart birkaç nadir istisnalar dışında bakteriyel nakil nedeniyle bakterilerin küçük boyutu ve bu nedenle gerilim kelepçe veya yama kelepçe yöntemleri kullanılarak incelenmiştir edilemez Bu memeli hücrelerinde veya oositlerde ifade etmek zordur. Ama aynı zamanda fizyolojik ilgili memeli nakil incelenebilir. Bu durumda SSM tabanlı elektrofizyoloji hücre içi membranlardan ve nedeniyle sağlamlık ve otomasyon potansiyelinin ilaç keşfi tarama uygulamaları için taşıyıcılar için cazip. Şeffaf SSM-basedUsing geleneksel elektrofizyoloji, zaman çözülmesi karakterizasyonuorters zordur. Nakil cirosu düşük olduğu için bir &#39;dev yama&#39; ya da &#39;tam hücre&#39; yapılandırma gereklidir, bir çözüm değişim deneyde bir doğal düşük zaman çözünürlüğe sahip olan. Komplikasyon fotolitik yüzey sürümü kullanılarak aşılabilir. Bununla birlikte, yüzeyler arasında sadece sınırlı sayıda bu yaklaşım için uygundur. Burada SSM&#39;de hızlı çözüm Döviz keyfi maddeleri kullanarak yüksek zaman çözünürlüğü ile elektrofizyolojik çalışmalar yapmak için eşsiz bir fırsat sunuyor. 2. Sınırlamalar ve kritik adımlar Yama kelepçe ve voltaj-kıskaç teknikleri aksine, SSM-tabanlı elektrofizyoloji potansiyel bir uygulamak için kullanılamaz. Transporter karakterizasyonu bu nedenle membran potansiyeli güvenmeyin modları taşıma ile sınırlıdır. Genel olarak, SSM tabanlı elektrofizyoloji (Elektrojenik) taşıyıcı türüne ilişkin herhangi bir sınırlama vardır. Ama gerilim clbağlayıcı proteinler gibi hücre içi bileşenleri protein işlevleri için ise amfi veya yama kelepçe yöntemleri, avantajları olabilir. Çözüm Döviz büyük eser akımları oluşturursa Sınırlamalar, ortaya çıkabilir. Alt tabaka lipofilik bileşiklerin durumunda olduğu gibi, SSM ile güçlü bir etkileşim meydana gelir. Artefaktı kontroller ölçülen sinyallerin düzeltmek için kullanılabilir. Tüm ölçüm tampon Ayrıca yüksek tuz arka plan eserler azaltmak için kullanılabilir. Ancak durumlarda, insan yapımı büyüklüğü protein sinyali ile karşılaştırılabilir olduğu, bu obje ikinci protein ilişkili sinyal izole etmek için hemen hemen imkansızdır. Neyse ki, yüksek eserler bir optimize edilmiş bir çözüm karşılığında sıradışı. Bir SSM tabanlı elektrofizyoloji deney başarılı gerçekleşmesi için kritik olan birkaç adım vardır. Protein numunesinin hazırlanması en önemli bir parçasıdır. Proteoliposomes kullanıldığında, emin olun reconsAnayasasının süreci yeterli LPR bir temiz, tekrarlanabilir örnek verir ve taşıyıcı doğru şekilde aydınlatmaktadır. Antikorlar olup olmadığını LPR bir ELISA deneyle dondurma kırık elektron mikroskobu ve yönünü kontrol edilebilir. Sadece protein inkübe için en iyi parametreleri gösteren bir SSM kullanın. Protein enjeksiyonu bir başka önemli bir adımdır. Sonikasyon önemlidir ve hava kabarcıkları enjeksiyon sırasında kaçınılmalıdır. Hava kabarcıkları, sensör çip adsorbe protein örnek kaldırır, çünkü örnek inkübasyondan sonra ölçümler kendisi kritik bir öneme sahiptir. Bu nedenle her zaman çözüm değiştirdikten sonra hava kabarcıklarını çıkarmak. Yine de bir sinyal özet oluşabilir. Olası bir sinyal özet düzeltmek için, bu deney sırasında yıkık kontrolleri gerçekleştirmek için gereklidir. 3. İhtisas Sistemleri SSM-Kur, uygulamaya göre değiştirilebilir. Ayrıca tburada mevcut tamamen farklı, son derece uzmanlaşmış kurulumları vardır. PH degrade altında örneğin asimetrik koşullar altında protein sinyalleri ölçmek için olasılığı vardır. Üçüncü bir çözüm içinde ve proteoliposomes dışında asimetrik tampon kompozisyonlar kurmak, dinlenme çözüm, ortaya konulmak zorundadır ve bu bir çift değişim yapılandırma gerektirir. Burada olmayan aktive ve dinlenme çözümleri arasında geçiş ek bir üç yollu vana gereklidir. Biz terminal kapak eksik, ancak küvet farklı bir türü kullanılarak bir alternatif akım yolu geliştirilen sistemin zaman çözünürlüğü artırmak için. Burada aktive olan ve olmayan aktive çözüm kavşak SSM önünde 3 mm, küvet içinde yer almaktadır. Bu kurulum iyi hızlı ulaşım süreçlerinin kinetik analizi için uygundur. Bu 2 msn gibi düşük bir zaman çözünürlüğü mümkün olduğu gösterilebilir. Ticari fully otomatik sistemler ilaç tarama için daha yüksek verim amaçlayan mevcuttur. Bir hareketli birim çözümler toplar ve standart bir mikrotiter levha formatında 96-yuvalı plakalar içinde sensör yüzeye enjekte eder.

Burada Elektrojenik membran proteinlerin karakterizasyonu için sağlam bir destek zar (SSM) dayalı yeni bir elektrofizyolojik yaklaşım göstermektedir. Katı destek, bir cam slayt, sensör çipi üzerinde ince bir altın tabakası oluşur. Hidrofilik altın yüzey, bir alcanethiol reaktif tiyol grubuna bağlamak için kullanılır. Daha sonra, selfassembly bir fosfatidilkolinin monolyer en SSM oluşumunu tamamlar. Zar proteinlerinin Elektrojenik tepkisini ölçmek için, proteoliposomes veya zar parçaları SSM (Şekil 1) ile absorbe edilir. Membran ve SSM içeren protein daha sonra bir kapasitif olarak birleştirilmiş zar sistemi oluşturur. Bu nedenle, protein ihtiva eden membran şarj translokasyon SSM ile kapasitif kuplaj ile tespit edilebilir. Bu yöntem yalnızca geçici akımlar verir. Akım tepe sabit taşıma aktivitesini temsil eder. Zamana bağlı taşıyıcı currents devre analizi ile yeniden olabilir. Sensör çipi bir küvet sistemi (Şekil 2) içine monte edilir. Küvet 17 ul silindirik bir küvet hacmi (o-ring ile net ses monte). Bir yaylı kontak pin amplifikatör için temas oluşturur. Bir çıkış konektörü ana kısmının üstüne vidalanır ve referans elektrot, klorlanmış bir gümüş tel taşır. Küvet bir Faraday kafesi olarak monte edilir. Bu, hızlı bir çözelti değişimi (Şekil 3) karşılık olarak membran proteini taşınma aktivitesi sağlamak için kullanıldığı, bir sıvı yolu, bağlanır. Tek bir çözüm değişimi protokolü iki çözüm, bir aktive edici olmayan ve bir aktive edici bir çözüm, gereklidir. Akış bir arayüz kutusu üzerinde bir bilgisayar veya el anahtarları üzerinde bir vana kontrol yazılımı kullanarak basınçlı hava ile kontrol edilir.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waterbath Sonicator</td>
 <td>Bandelin</td>
 <td>RK 52 H</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tip Sonicator</td>
 <td>Hielscher Ultrasonics GmbH</td>
 <td>UP50H</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-way valve</td>
 <td>NResearch, West Caldwell, USA</td>
 <td>NR225T011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Terminal valve</td>
 <td>NResearch, West Caldwell, USA</td>
 <td>NR225T031</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manometer</td>
 <td>Greisinger electronics</td>
 <td>GDH 14 AN</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Faraday cage</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvette</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml solution containers</td>
 <td>Kartell</td>
 <td>1623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>O-rings</td>
 <td>Seal Science Inc.</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oscilloscope</td>
 <td>Tektronix</td>
 <td>TDS 1002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reference electrode</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Function generator</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tubings</td>
 <td>SAINT-GOBAIN Performance Plastics</td>
 <td>AAC00006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sensor chip</td>
 <td>Fraunhofer Institut f&uuml;r Schicht und Oberfl&auml;chentechnik</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Interface box</td>
 <td>Max Planck Institute of Biophysics</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Keithley</td>
 <td>427</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual cog</td>
 <td>Vygon GmbH</td>
 <td>876</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>USB analog-to-digital converter</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr> 
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Regeants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2&#x2011;Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine</td>
 <td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
 <td>850356</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A3574</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium persulfate</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A3678 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-(+)-Glucose </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>G8270 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>43819</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol absolut</td>
 <td>VWR AnalaR NORMAPUR</td>
 <td>603-002-00-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Natural E. coli lipids polar extract</td>
 <td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
 <td>100600</td>
 <td>for LacY reconstitution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Decane</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D901 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Octadecanethiol</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>O1858 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Octadecylamine</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>74750</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P3786 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P9791 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetramethylethylenediamine</td>
 <td>BIO RAD</td>
 <td>1610801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;-Lactose monohydrate</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L8783 </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

introduction to solid supported membrane based electrophysiology

Biz mevcut elektrofizyolojik yöntem altın kaplamalı sensör çipi ve üstüne bir fosfatidilkolinin tek tabaka üzerinde kimyasal olarak bir octadecanethiol tabakası oluşan sağlam bir desteklenen membran (SSM) dayanmaktadır. Bu meclis referans elektrot, bir klorlu gümüş tel içeren bir küvet sisteme monte edilir. Membran fragmanları ya da ilgi membran proteini içeren proteoliposomes adsorpsiyonu sonra, hızlı bir çözüm değişimi membran proteini taşıma etkinliği indüklemek için kullanılır. Tek bir çözüm değişimi protokolü iki çözüm, bir aktive edici olmayan ve bir aktive edici bir çözüm, ihtiyaç vardır. Akış, bir Faraday kafesi içinde basınçlı hava ve bir valf ve boru sistemi ile kontrol edilir. Elektrojenik taşımacılık faaliyetinin kinetik SSM ve proteoliposomes veya membran parçaları arasında kapasitif bağlantı yoluyla elde edilir. Bir yöntem olup, bu nedenle, sadece transien verimlerit akımları. Akım tepe sabit taşıma aktivitesini temsil eder. Zamana bağlı taşıyıcı akımları devre analizi ile yeniden olabilir. Bu yöntem özellikle yama kelepçe veya gerilim kelepçe yöntemlerle incelenmiştir edilemez hücre içi zarlar, gelen prokaryotik taşıyıcılar veya ökaryot taşıyıcılar için uygundur.

Şimdiye kadar, SSM-tabanlı elektrofizyoloji çoğunlukla prokaryotik kökenli 20&#39;den fazla taşıyıcılar, örneğin MELB 3, 4 ve NhaA PutP 5 (6 özetlenmektedir) karakterize etmek için kullanıldı. Ama aynı zamanda hücre içi zarlar ökaryotik taşıyıcılar, örneğin ClC7 7 hem de iyon kanalları, nikotinik asetilkolin reseptörü 8 araştırılmıştır örn. Burada 5 9 bir LPR, 10 Lacy odaklı dışarı en az% 85 sağ tarafı ile proteoliposomes kullanarak Escherichia coli Lacy şeker / H + kotransportuna bir örnek ölçümleri olarak sunuyoruz. Bu taşıyıcı protein asgari bir kinetik model giden ana adımları odaklanın. 1. Wild tip Lacy Elektrofizyolojik karakterizasyonu İlk adım, farklı pH değerinde ölçülmesi ile Elektrojenik Reaksiyon genel bir karakterizasyonu ( <strong<html> &gt; Şekil 4), substrat konsantrasyonları (Şekil 5) ve alt tabakalar. Teknik doğrulamak için, literatürde verilen K M ve pKa değerleri yeniden üretildi. Lacy arasında pH bağımlılığı iki farklı Elektrojenik reaksiyon gösterir. PH 5 ila pH 8.5 arasında, aynı zamanda, kapasitif birleştiğinde akımı arttıkça şekil değiştirir. Asidik pH değerinin, sadece hızlı bir reaksiyon Elektrojenik kalır değerleri ise alkalin koşullar altında, kararlı durum taşıma görülmektedir. Biz taşıyıcı akımları (Şekil 6) yeniden oluşturmak için devre analizi kullanılan hızlı Elektrojenik reaksiyonlardan kararlı durum sinyalleri ayırt etmek. PH 7 &#39;de tek fazlı sinyali iki fazlı olur. Bu aynı zamanda iki farklı Elektrojenik tepkiler olduğunu gösterir. Transfer yük (sinyallerinin integrali) tahmin edilen, iki reaksiyon yaklaşık% 6 ve taşıma döngüsünün toplam electrogenicity% 94 vardır. Elektrojenik reaksiyonların ove_step &quot;&gt; 2. Atama Lacy bir reaksiyon döngüsünde belirli adımlar için iki Elektrojenik reaksiyonları atamak için, E325A dantelli varyant (Şekil 7) ölçüldü. Bu varyant sadece laktoz Döviz gösterir ama çünkü proton sürümü inhibisyonunun, tüm aktif taşıma modları için eksiktir. Lacy E325A bir sinyal hızlı geçici temsil eder ve tüm ölçülen pH değerleri için sabittir. Sinyalin şekli ve büyüklüğü, asidik koşullar altında Lacy vahşi tip bir sinyal benzer. Ayrıca biz kapasitif birleştiğinde sistemlerinde ölçülen hızlı geçici akımlar için karakteristik olan azalan tepe akımı, sonra küçük bir negatif faz gözlemlemek. Laktoz bağlayıcı ve serbest Elektrojenik olmadığı için, hızlı geçici laktoz bağlayıcı ardından bir Elektrojenik yapısal geçiş ile ilişkili olmalıdır. Bu proton bırakma adım hızı limiti olduğu bilinmektedirlaktoz konsantrasyonu farkı motorlu taşıma modunda Lacy ciro için ng. Proton serbest tercih edilir, çünkü bu durumda biz, alkali pH ile taşıma hızı bir artış bekliyoruz. Bu, kararlı durum nakil Lacy vahşi tip sinyal korelasyon için geçerlidir. Üstelik sadece iç pH dantelli en kararlı durum taşıma (yayınlanmamış) etkilediğini pH degrade ölçümü ile gösterilebilir. Bu nedenle büyük Elektrojenik reaksiyon proton serbest adıma atanabilir. 3. Kinetik analizi için ölçüm Taşıma oranları ve kapalı Elektrojenik reaksiyonların belirlenmesi sonra yaklaşık 4.5 msn, yüksek zaman çözünürlüğü ile SSM Kurulum kullanılarak belirlenmiştir. Bir reaksiyon sinyal hakim Bu, koşullar altında mümkündür. Bu durumda hız sabitleri, tekrarlanan bir en küçük kareler de kullanılarak sinyallerin zaman çözünürlüğü göz önünde bulundurularak, geçici akımlar türetilebilir<html> evrişim algoritması (Şekil 8). Belirlenen hız sabitleri hem de önerilen minimum kinetik model (Şekil 9) nihayet taşıyıcı kinetik simülasyonu için kullanılmıştır. Simüle eğrileri ek olarak kinetik model kanıtlıyor SSM verileri yeniden. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1.jpg" alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1highres.jpg"/> Şekil 1. SSM hakkında proteoliposomes adsorpsiyonu geometrisi. SSM bir sensör çipi, yapısal bir altın kaplı cam slayt oluşur. Membran proteinlerinin Elektrojenik reaksiyonları ölçmek için, proteoliposomes veya membran parçaları SSM için emilirler. Iki geo-zar, bir kapasitif akuple sistemi oluşturur. Sadece geçici akımlar tespit edilir nedeni budur. tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. SSM küvet sensör çipi ve referans elektrot taşır. Sensör çipi küvet taban ve küvet kafası arasında sıkışmış. Referans elektrot, bir poliakrilamid jel tuz köprüsü tarafından akış yolu izole edilir. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3.jpg" alt="Şekil 3," fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3highres.jpg"/> Şekil 3,. SSM Kur sıvı Yolu ve Elektrik Devre. Tek bir çözüm değişim protokolü sadece olmayan bir aktive (NA) ve bir aktive (A) çözümü gereklidir. Akışı iki 2 yollu vana (V1) ve bir uç kapak (V2) tarafından kontrol edilir. Olmayan aktive ve aktive çözümleri arasında Terminal vana anahtarları, küvet ve bir atık kabı (W) için başka bir çözüm için çözümlerden birini yönetiyor. Sensör çipi (SSM), yükseltici (I / U) bağlanmıştır<html> referans elektrot (AgCl) harici elektrik devresindeki fonksiyon jeneratörü (F) bağlıyken. Bir bilgisayar (PC) ve bir arayüz kutusu kapak operasyonu ve veri toplama için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4.jpg" alt="Şekil 4," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4highres.jpg"/> Şekil 4. Aktive edici çözelti 100 mM laktoz içerirken, farklı pH değerlerinde, 100 mM laktoz konsantrasyonunda atlar sonra yabani tip Lacy proteoliposomes ile ölçülmüştür geçici akımlar. Olmayan aktifleştirici çözelti 100 mM glukoz içermektedir. Bütün çözeltiler, 1 mM DTT, belirtilen pH&#39;da 100 mM potasyum fosfat tamponu içinde hazırlanmıştır. Bu ölçüm koşulları ile ilgili ayrıntılı bilgileri ve aşağıdaki rakamlar 9 ve 10 bakınız. <html> ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 5,. Ortalama Normalize Tepe akımları farklı konsantrasyonlarda ve pH değerlerinde laktoz konsantrasyonunda atlar sonra yabani tip Lacy proteoliposomes ile ölçüldü. K M değerleri hiperbolik uyan elde edilir. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6.jpg" alt="Şekil 6," fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6highres.jpg"/> 6 Şekil. Taşıyıcı akımların İmar. Geçici akımlar (A) taşıyıcı akımları (B) yeniden oluşturmak için kullanılan pH 8.5 (mavi iz) ve pH 5.2 (kırmızı iz) de 100 mM laktoz konsantrasyonu atlar sonra vahşi tip Lacy proteoliposomes ile ölçüldü. PH 5.2 de hızlı bir Elektrojenik tepkime meydana pH 8.5 sürekli cirosu görülmektedir. Bu, açık bir şekilde yeniden akımı (B) &#39;de görülmektedir. files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 7 &quot;fo: içerik-width =&quot; 4in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 7. Geçici akım pH 5.2 100 mM laktoz konsantrasyonu atlamadan sonra E325A Lacy proteoliposomes ile ölçüldü. Bu Lacy varyant taşıma döngüsünün proton serbest adımda inhibe ve bu nedenle ulaşım eksikliği olduğunu. Gözlenen küçük negatif bileşeni kapasitif olarak bağlı sistemler ölçülür hızlı geçici akımlar için karakteristik olan ve hızlı bir reaksiyon Elektrojenik sonra membran kapasitans deşarj neden olur. Bu zaman sabiti π0 sistemi (Şekil 1) kapasitans ve iletkenlikleri tarafından belirlenir. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8.jpg" alt="Şekil 8," fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8highres.jpg"/> Şekil 8. Vahşi tip Lacy proteoliposomes ile ölçülen geçici akımlar aftepH 5.2 de r farklı laktoz konsantrasyonu atlar. Bu koşullar altında herhangi bir kararlı durum ulaşım görülen, ancak laktoz üzerine bir Elektrojenik yapısal geçiş bağlama edilir. Kesikli bir çizgi, sistemin zaman çözünürlüğü temsil transfer fonksiyonunu gösterir. Ilave verilere bir hiperbolik oturuş gözlenen oranı sabit Kobs gelen hız sabitleri ve kapalı belirlenmesi gösterir. Gözlemlenen hız sabiti, tekrarlanan bir en küçük kareler ters evrişim algoritması 10 ile geçici akımlar tespit edildi. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9.jpg" alt="Şekil 9," fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9highres.jpg"/> 9 Şekil. Lacy. İki Elektrojenik adımların reaksiyon döngüsü için bir kinetik model tespit ve SSM ölçümleri ile karakterize edilebilir. Tepki olarak toplam yük deplasman ~% 94 temsil eden güçlü Elektrojenik tepkidöngüsü sadece nötr ve temel pH değerlerinde görülmektedir. Bu proton serbest adım (mavi ok) atanabilir. Yabani tip Lacy devamlı bir devir inhibe edildiğinde bir zayıf Elektrojenik aşamasında asidik pH&#39;ta görülmektedir. Biz reaksiyon döngüsünde toplam yük deplasman 6% temsil laktoz bağlama, üzerine bir Elektrojenik yapısal geçiş için bu tepki atanmış.

Watch this Scientific Journal Video about Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology at JoVE.com

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

Burada Elektrojenik membran nakil karakterizasyonu için uygulamaları odaklı sağlam desteklenen membranlar dayalı bir elektrofizyolojik yöntem mevcut.

Elektrofizyoloji Tabanlı Katı Desteklenen Membran Giriş

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

introduction-to-solid-supported-membrane-based-electrophysiology

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Biophysics. Burada Elektrojenik membran nakil karakterizasyonu için uygulamaları odaklı sağlam desteklenen membranlar dayalı bir elektrofizyolojik yöntem mevcut.

Video: Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

Elektrofizyoloji için Mikroakiskan uygulama

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Biyoloji

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Omurilik Elektrofizyoloji

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

Solucan Lab An Introduction to: Kültürleme Worms Mutagenez

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Katı Plaka tabanlı Diyet Kısıtlama Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Şekilde, mikro Tekniği Sıçan mezenter mikrodamar geçirgenliği Yönetmelik Araştırma

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

Elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...