J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

ملاحظة: تم الموافقة على جميع الخطوات في هذا البروتوكول من قبل UT مركز أندرسون للسرطان. 1. توليد mTERT-ER أليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعرض الضربة القاضية في استهداف ناقلات تحتوي على ERT2-الائتلاف الحزبي (يجند ملزم المجال) المنبع وفي الإطار مع التسلسل الجيني mTERT (اكسون من 1 إلى إنترون 2) والسلمون المدخن - PGK - الجدد - السلمون المدخن جزء (الشكل 1A) في الماوس خلايا ES مع Electroporation لل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا ES في النيوميسين عن 6-10 أيام. اختيار الحيوانات المستنسخة مقاومة للالنيوميسين وتوسيع في 48 لوحات جيدة. استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام طقم التجارية والتأكد من الضربة القاضية في أليل لطخة الجنوبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن اثنين ES خطوط مع أكثر من 95٪ [كروتب الطبيعية إلى C57BL / 6 الكيسات الأريمية مع مجموعة المجهرية تحت مجهر مقلوب. زرع الكيسات الأريمية في رحم الأمهات البديلات 23. تتزاوج في chimaeras الذكور عالية الجودة (70-90٪) لC57BL / 6 الحديدالذكور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد التنميط الجيني لمتخالف الحيوانات mTERT-ERneo لطخة الجنوبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتزاوج ومتخالف الحيوانات mTERT-ERneo والحيوانات EIIa-لجنة المساواة العرقية لحذف كاسيت NeoR. تزاوج الحيوانات متخالف لC57BL / 6 الحيوانات لمدة ثلاث مرات على الأقل، وأخرى بين سلالة متخالف الحيوانات mTERT-ER لتوليد متماثلة الألائل. </li></ol> 2. جيل من LSL-mTERT أليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال الضربة القاضية في استهداف ناقلات تحتوي على LoxP - سدادة ثلاثية - الجدد - جزء LoxP والتسلسل الجينومي mTERT (بين اكسون 1 و 2 إنترون، الشكل 1B) في الماوس خلايا ES مع Electroporation لل23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا ES في النيوميسين عن 6-10 أيام. اختيار الحيوانات المستنسخة مقاومة للالنيوميسين وتوسيع في 48 لوحات جيدة. استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام طقم التجارية والتأكد من الضربة القاضية في أليل من جنوب لطخة 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Injeط م اثنين ES خطوط مع أكثر من 95٪ [كروتب الطبيعية إلى C57BL / 6 الكيسات الأريمية مع مجموعة المجهرية تحت مجهر مقلوب. زرع الكيسات الأريمية في رحم الأمهات البديلات 23. تتزاوج في chimaeras الذكور عالية الجودة (70-90٪) لC57BL / 6 إناث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد التنميط الجيني لمتخالف الحيوانات LSL-mTERT لطخة الجنوبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزاوج الحيوانات متخالف لC57BL / 6 الحيوانات لمدة ثلاث مرات على الأقل، وأخرى بين سلالة متخالف الحيوانات LSL-mTERT لتوليد متماثلة الألائل. </li></ol> 3. إعادة تنشيط التيلوميراز في mTERT-ER والفئران LSL-mTERT في فيفو لmTERT-ER <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم جميع الأدوات الجراحية قبل الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران مع غرفة الأيزوفلورين (4٪ لتحريض، 2٪ للحفاظ على) في 50٪ (ت / ت) الأوكسجين / 50٪ (ت / ت) خليط الغاز ثنائي النيتروجين وأول أكسيد. أو تخدير الفئران عن طريق خليط-الكيتامين زيلازين (100 مز / كغم من وزن الجسم + 10 ملغم / كغم من وزن الجسم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يتم التوصل التخدير العميق، وإزالة تخدير الحيوان من غرفة الاستقراء، والحفاظ على رؤوسهم داخل الأنبوب متصلا غرفة الأيزوفلورين (2٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قرصة منصات القدم من الفئران لضمان إفقاد إحساس الحيوان بعمق. وضع مرهم على كلتا العينين من أجل منع العينين من الجفاف. يمسح الجزء الخلفي من الفئران مع حل بوفيدون اليود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن بطيئة الافراج-4-OHT بيليه مع trochar الدقة (10 G) تحت جلد الظهر ودفع بيليه على طول الطريق إلى خط الوسط بين الكتفين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم شق الجرح مع مقطع مطبق ورصد الفئران للتعافي من التخدير. إزالة لقطات في وقت لاحق 10 يوما. الحرارة تكميلية ليست ضرورية لأن الانتهاء من إجراء في وقت قريب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي أن يكون الأمثل فترة العلاج مع 4-OHT بيليه وفقا للغرض من الدراسة. </li></ol> لLSL-mTERT &lt;رأ&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> تاموكسيفين (10 ملغ / مل، وحلت في زيت الذرة) يتم حقن داخل الصفاق يومين متتاليين (200 UL / 25 غ / يوم). </li></ol> 4. عزل الخلايا الجذعية العصبية وإعادة تنشيط التيلوميراز في المختبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصرح باستخدامها الفئران مع ثاني أكسيد الكربون وتتم إزالة العقول. اتبع بروتوكول المتاحة تجاريا العصبية عدة التفكك الأنسجة حسب الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ومسحوق مجفف بالتجميد في قارورة وصفت الحل 4 مع 1 مل من مستنبت الخلية لحلول 4. لا الدوامة. وينبغي بعد ذلك aliquoted هذا الحل وتخزينها في -20 ° C لاستخدامها لاحقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل حرارة الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل أنزيم ميكس 1: الحل 1 (50 ميكرولتر) والحل 2 (1،900 ميكرولتر). جعل أنزيم ميكس 2: الحل 3 (20 ميكرولتر) والحل 4 (10 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1،950 ميكرولتر انزيم مزيج 1 لمدة تصل إلى 400 ملغ الأنسجة ودوامة. وقبل حرارة الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة15 دقيقة قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخراج أدمغة فئران 1-يوم، والحفاظ على forebrains عن طريق إزالة بصيلات الشم والمخيخ. الحفاظ على أنسجة الدماغ الأمامي في 1 مل من البرد مستنبت منذ إزالة وتخزينها في 4 درجات مئوية. تأكد لمعالجة الأنسجة العصبية في حدود 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد وزن الأنسجة للتأكد من عدم تجاوز حد 400 ملغ لكل الهضم. وضع الدماغ على غطاء 35 مم طبق بتري، وسحق الدماغ باستخدام مشرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة طرف 1 مل، إضافة 1 مل من HBSS (ث / س كا / ملغ) وقطع ماصة مرة أخرى إلى أنبوب 15 مل. شطف مع HBSS (ث / س كا / ملغ). الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ونضح طاف بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1،950 ميكرولتر من مزيج انزيم قبل ساخنة 1 (حلول 1 و 2) في ما يصل الى 400 ملغ الأنسجة. احتضان في أنبوب 15 مل لمدة 15 دقيقة عند 37 ° C، والخلط التي كتبها قلب أو يهتز أنبوب كل 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 30 ميكرولتر مزيج انزيم 2 في عينة الأنسجة بإضافة 20 &amp; #956؛ ل من الحل 3 إلى 10 ميكرولتر من الحل 4. ثم تضيف إلى العينة. عكس بلطف لمزج. لا الدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الأنسجة ميكانيكيا باستخدام اسعة ذات الرؤوس، مصقول النار ماصة باستير قبل pipetting صعودا وهبوطا 10 مرات ببطء. تجنب تشكيل فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، قلب الأنبوب كل 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 4.11 وخطوة 4.12 إذا الأنسجة هي أكبر من 200 ملغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق تعليق خلية لمصفاة الخلية 70 ميكرومتر، وضعت على أنبوب 50 مل. تطبيق 10 مل من برنامج تلفزيوني من خلال مصفاة الخلية. تجاهل مصفاة الخلية وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية في 300 غ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نضح طاف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا resuspend مع المتوسطة الخلايا الجذعية إلى الحجم المطلوب لمزيد من التطبيقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتفعيل التيلوميراز في LSL-mTERT NSCs، وعلاج الخلايا مع 100 ميكرومتر 4-OHT لمدة يومين. لتفعيل التيلوميراز في mTERT-ER NSCs، والحفاظ على الخلايا في مستنبت مع 100 ميكرومتر 4-OHT. </li></ol> 5. التيلومير FISH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الكروموسومات الطورية من الخلايا المستزرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لFFPE (الفورمالين الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ) أقسام الأنسجة، deparaffinize في الزيلين وترطيب في سلسلة الإيثانول لمدة 5 دقائق كل (100٪، 90٪، 70٪، 50٪ من الإيثانول) وبرنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما بعد الإصلاح في الميثانول: حمض الخليك (3: 1) لمدة 1-2 ساعة. يذوى في سلسلة الايثانول الباردة لمدة 5 دقائق لكل منهما (70٪، 90٪، 100٪ من الإيثانول) والهواء الجاف. يغسل في برنامج تلفزيوني 1X عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفسد الكروموسومات في 4٪ فورمالدهايد عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. يذوى في سلسلة الإيثانول الباردة 5 دقائق كل (70٪، 90٪، 100٪ من الإيثانول) والهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 12-25 ميكرولتر من الخليط التهجين السلطة الوطنية الفلسطينية إلى كل شريحة. (التهجين مزيج: 70٪ الفورماميد، 0.06x SSC، 0.2٪ BSA، و 0.5 نانوغرام / ميكرولتر الحمض الريبي النووي النقال، 0.5 نانوغرام / ميكرولتر التيلومير أو السنترومير تحقيقات) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اغلاق الغطاء زلة مع الاسمنت والمطاط. محضرات الكروموسومات بعد بدل طبيعة وأقسام الأنسجة عند 80 درجة مئوية لمدة 4 مفي. هجن في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعة في غرفة رطبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل في درجة حرارة الغرفة مع غسل العازلة 2 × 15 دقيقة. (غسل عازلة: 70٪ الفورماميد، 0.06x SSC، ودرجة الحموضة 7.2). يغسل في درجة حرارة الغرفة 3 × 5 دقائق مع PBST. الشرائح مكافحة وصمة عار مع دابي أو مضان الحمراء بعيدة عن الفحص المجهري. </li></ol>

<ol>
	<li>Bass, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+sequencing+of+colorectal+adenocarcinomas+identifies+a+recurrent+VTI1A-TCF7L2+fusion.">Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion.</a> Nat Genet. 43, 964-968 (2011).</li><li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers.">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li><li>Blasco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+shortening+and+tumor+formation+by+mouse+cells+lacking+telomerase+RNA.">Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA.</a> Cell. 91, 25-34 (1997).</li><li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+mouse+telomerase+in+highly+proliferative+organs.">Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs.</a> Nature. 392, 569-574 (1998).</li><li>Rossi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiencies+in+DNA+damage+repair+limit+the+function+of+haematopoietic+stem+cells+with+age.">Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age.</a> Nature. 447, 725-729 (2007).</li><li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+and+Atm+deficiency+compromises+organ+homeostasis+and+accelerates+ageing.">Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing.</a> Nature. 421, 643-648 (2003).</li><li>Rudolph, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity,+stress+response,+and+cancer+in+aging+telomerase-deficient+mice.">Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice.</a> Cell. 96, 701-712 (1999).</li><li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+impairs+DNA+repair+and+enhances+sensitivity+to+ionizing+radiation.">Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation.</a> Nat Genet. 26, 85-88 (2000).</li><li>Ferron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+shortening+and+chromosomal+instability+abrogates+proliferation+of+adult+but+not+embryonic+neural+stem+cells.">Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells.</a> Development. 131, 4059-4070 (2004).</li><li>Savage, S. A., Alter, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dyskeratosis+congenita.">Dyskeratosis congenita.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 23, 215-231 (2009).</li><li>Armanios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndromes+of+telomere+shortening.">Syndromes of telomere shortening.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 45-61 (2009).</li><li>Vulliamy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+component+of+telomerase+is+mutated+in+autosomal+dominant+dyskeratosis+congenita.">The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita.</a> Nature. 413, 432-435 (2001).</li><li>Harley, C. B., Harley, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase,+checkpoints+and+cancer.">Telomerase, checkpoints and cancer.</a> Cancer surveys. 29, 263-284 (1997).</li><li>Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-+and+ATM-dependent+apoptosis+induced+by+telomeres+lacking+TRF2.">p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2.</a> Science (New York, N.Y.). 283, 1321-1325 (1999).</li><li>Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF2+protects+human+telomeres+from+end-to-end+fusions.">TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions.</a> Cell. 92, 401-413 (1998).</li><li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+deficiency+rescues+the+adverse+effects+of+telomere+loss+and+cooperates+with+telomere+dysfunction+to+accelerate+carcinogenesis.">p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis.</a> Cell. 97, 527-538 (1999).</li><li>Artandi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+promotes+non-reciprocal+translocations+and+epithelial+cancers+in+mice.">Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice.</a> Nature. 406, 641-645 (2000).</li><li>Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+and+evolution+of+intestinal+carcinoma+in+mice+and+humans.">Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans.</a> Nat Genet. 28, 155-159 (2001).</li><li>Greenberg, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+dysfunctional+telomeres+impair+tumorigenesis+in+the+INK4a(delta2/3)+cancer-prone+mouse.">Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse.</a> Cell. 97, 515-525 (1999).</li><li>Jaskelioff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+reactivation+reverses+tissue+degeneration+in+aged+telomerase-deficient+mice.">Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice.</a> Nature. 469, 102-106 (2011).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitelomerase+therapy+provokes+ALT+and+mitochondrial+adaptive+mechanisms+in+cancer.">Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer.</a> Cell. 148, 651-663 (2012).</li><li>Ding, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+reactivation+following+telomere+dysfunction+yields+murine+prostate+tumors+with+bone+metastases.">Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases.</a> Cell. 148, 896-907 (2012).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هنا، ونحن التقرير الجيل اثنين محرض الأليلات التيلوميراز الفئران وكيفية تنشيط التيلوميراز في المجراة في المختبر. في خطوة حاسمة لإعادة تنشيط النشاط mTERT-ER هو الحفاظ على التركيز المستمر للتاموكسيفين، لذلك اخترنا لاستخدام 4-OHT الكريات الوقت الإفراج المصنعة من قبل البحوث المبتكرة الأمريكية. الكريات الحفاظ على الإفراج عن 4OHT على مستوى ثابت الدم حالة من 1 نانوغرام / مل لمدة تصل إلى 60 يوما. في دراسة سابقة، أظهرنا أن تفعيل النشاط التيلوميراز مع هذه الاستراتيجية كان قادرا على التخفيف من الظواهر التنكسية مثل استنفاد الخلايا الجذعية، وضعف الردود إصابة الأنسجة وفشل الجهاز في الأجهزة المتعددة التي تم الناجمة عن اختلال وظيفي التيلومير في G4 mTERT ER / ER الفئران 20. البعض من دراسة وظيفة التيلوميراز في الشيخوخة، وهذين الأليلات التيلوميراز محرض يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة السرطان. أخذت الدراسات السابقةالاستفادة من هذه الأليلات لاستكشاف دور الاستنزاف التيلومير والتيلوميراز تنشيط في تشكيل الجينوم والتي تؤثر بيولوجيا الخلايا T-سرطان الغدد الليمفاوية الغدة الصعترية 21 وسرطان البروستاتا 22. وأظهرت هذه الدراسات أن اثنين من اختلال وظيفي التيلومير في جيل أواخر G4 أجهزة الصراف الآلي - / - mTERT ER / ER وG4 PB-Cre4 PTEN L / L البروتين p53 L / L LSL-mTERT L يوفر / L الفئران آلية تأجيج اكتساب الأحداث مطفرة مبكرة ل بدء الورم، ولكن منع تطور الأورام الخبيثة بشكل كامل. عندما تم تنشيط التيلوميراز في سياق الناجم عن خلل وظيفي-التيلومير عدم الاستقرار الجيني، ونقاط التفتيش الحمض النووي من التلف وتفشي عدم الاستقرار الكروموسومات قمعت، والذي سمح للتطور الكامل للأورام الخبيثة مع الخصائص البيولوجية الجديدة مثل الانبثاث العظام سرطان البروستاتا 21 وتسلل دماغ التوتةج سرطان الغدد الليمفاوية 21. وقد لوحظت ظواهر مماثلة أيضا في أنواع السرطان الأخرى بما في ذلك سرطان القولون وسرطان البنكرياس (الاتصالات الشخصية مع الدكاترة. Haoqiang يينغ، آدم Boutin ورونالد DePinho). لأن البروتين TERT-ER يمكن ان يكون مثبت بسهولة بين داخل وخارج الدول اعتمادا على ما إذا تعامل الحيوانات مع تاموكسيفين أو مركبة، ونماذج ورم الناتجة عن mTERT-ER أليل يمكن استخدامها لاختبار العلاج المضاد للالتيلوميراز. في دراسة سابقة، والأورام ولدت في G4 أجهزة الصراف الآلي - / - أطلق سراح mTERT ER الحيوانات / ER من 4 OHT. على استنزاف التيلوميراز، تقلصت الأورام في نهاية المطاف بسبب إعادة التيلومير التي يسببها خلل نقاط التفتيش 21. ومع ذلك، فإن بعض الأورام المكتسبة المقاومة ردا على التيلوميراز الانقراض من خلال تفعيل لتطويل البديل من التيلوميرات (ALT) آلية. أظهر المزيد من توصيف هذه الأورام ALT + مقاومة أن ريا لها النسخ الشاذة من الجينات المسؤولة في علم الأحياء الميتوكوندريا والدفاع الأكسدة بما في ذلك منظم سيد الميتوكوندريا التوليف والاكسدة الدفاع PGC-1β. ضربة قاضية من PGC-1β أو SOD2 (منظم آخر للدفاع الأكسدة) يلغي بشكل كبير ALT + ورم خلايا بينما تبقي تبقى التيلوميراز + ورم خلايا سليمة نسبيا 21. القيد واحد من هذين الضربة القاضية في الأليلات هو أنها يمكن أن تحمل فقط تنشيط التيلوميراز على مستوى الذاتية لأنهم في موضع الأصلي للجين التيلوميراز. في معظم السرطانات البشرية، هى overexpressed التيلوميراز في الواقع على مستوى أعلى من ذلك بكثير. من أجل تعزيز مستوى التيلوميراز، وتعديل واحد يمكن أن نعتبر هو لإدراج بناء mTERT-ER مع المروج أقوى مثل PGK (فسفوغليسرات كيناز) المروج في Rosa26 مكان. وفي الختام، توفر هذين جديدة محرض الأليلات التيلوميراز الفئران جينيه لم يسبق له مثيلأدوات جيم لدراسة وظائف التيلوميراز في الشيخوخة وتوازن الأنسجة وكذلك تطور الورم، خصوصا في ظل خلفية من الحصول عليها قبل التيلومير التي يسببها خلل عدم الاستقرار الجيني. ويمكن أيضا أن أليل mTERT-ER أن تستخدم لدراسة العلاج المضاد للالتيلوميراز عن طريق عبور إلى أخرى نماذج الماوس عرضة للورم.

التيلوميراز هو انزيم مسؤول عن الحفاظ على التيلوميرات. هذه هي متواليات المتكررة في نهايات الكروموسومات التي تحمي سلامتها. المكونات الأساسية من التيلوميراز عميم الإنزيم هي وحدة فرعية الناسخ العكسي الحفازة (TERT) وحدة فرعية RNA (TERC) التي هي بمثابة القالب لإضافة الكروموسومات يكرر 1،2. في حين قمعت بشكل عام في الخلايا الجسدية متباينة، التيلوميراز يسلك النشاط القوي ويلعب دورا هاما في الخلايا الجرثومية، والخلايا السرطانية والخلايا الجذعية. mTERC وmTERT الفئران خروج المغلوب توفر كبيرة في نظم نموذج الجسم الحي لدراسة وظائف التيلوميراز في كل من الخلايا الجذعية والسرطان. وmTERC وmTERT خروج المغلوب لم الفئران (G1) لا تظهر أي الظواهر واضحة بسبب الاحتياطي طويل من التيلوميرات في الفئران 3. ومع ذلك، intercrossing متسلسل mTERC وmTERT الفئران خروج المغلوب إلى أواخر جيل (G5-G6) نتج عنهتآكل التدريجي للالتيلوميرات، وفي نهاية المطاف أثار تدهور حاد في الأنسجة التكاثري للغاية 4. جيل الراحل (G5-G6) mTERC - / - الفئران يعانون من العقم بسبب ارتفاع معدلات موت الخلايا المبرمج في الخصية والجرثومية نضوب الخلية. G5-G6 mTERC - / - الفئران أيضا يحمل الظواهر التنكسية في الأنسجة التكاثري للغاية بما في ذلك نخاع العظام والأمعاء والجلد بسبب ارتفاع معدلات موت الخلايا المبرمج والمعيبة قدرة التجديد الذاتي في الأنسجة الجذعية / مقصورات خلية سلفية 4. الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع العظام من جيل أواخر mTERC - / - الفئران فقدان المعرض من إمكانات التكاثري، للخطر قدرة التجديد الذاتي، وتعزيز موت الخلايا المبرمج، وفي نهاية المطاف استنفاد الوظيفي 5،6. وبالمثل، لوحظت زيادة تدريجيا الهيئات أفكارك في أقبية المعوية في كل جيل من الأجيال المتعاقبة من G1-G6 mTERC - / - الفئران 7،8. تيكان تأثير ضار من التيلوميرات مختلة لا يبدو أن يقتصر على الأنسجة دوران عالية لأن كلا من انتشار الخلايا الجذعية العصبية الكبار في المختبر وتكوين الخلايا العصبية في الجسم الحي وضعف شديد في أواخر الجيل (G4-G5) mTERC - / - الفئران 9 . ويدعم دور التيلوميراز في الخلايا الجذعية مزيد من النتائج في النادر البشري عسر التقرن الخلقي اضطراب وراثي (DKC)، والتي في بعض وسائل يشبه الشيخوخة المبكرة 10،11. ويتسبب DKC بواسطة الطفرات في TERC، TERT، والجينات التي تكود dyskerin، والتيلوميراز فرعية الأساسية، وغيرها من البروتينات المرتبطة dyskerin 12. في المتوسط، التيلوميرات في المرضى الذين DKC هي أقصر من 99٪ من العمر كعينة ضابطة. ومن المقرر أن فقر الدم اللاتنسجي، والذي كان سببه الصيانة المعيبة من الخلايا الجذعية المكونة للدم الاعتلال الرئيسي لهذا المرض. جوانب أخرى للمرض مثل الطلاوة عن طريق الفم، ضمور الأظافر، retardati العقليةعلى، وضمور الخصيتين والمضاعفات الرئوية جميع أقترح ضعف وظائف الخلايا الجذعية والأنسجة الخلايا الاصلية 10، والنتائج في وثيقة الاتفاق مع تلك الموجودة في الجيل الراحل من الفئران التيلوميراز خروج المغلوب. المرضى DKC عرضة لمتلازمة خلل التنسج النقوي ويكون زيادة انتشار الأورام المخاطية الخبيثة. وهكذا، ونقص تيلوميراز في المرضى من البشر يلخص العيوب من وظائف الخلايا الجذعية والأورام الاستعداد التي لوحظت في أواخر الجيل الفئران التيلوميراز خروج المغلوب. التيلوميرات قصيرة والنشاط التيلوميراز عالية هي السمات المميزة لمرض السرطان. كما الخلايا الطبيعية أو ما قبل سرطان تقسم، نتائج النشاط التيلوميراز منخفضة أو غائبة في تآكل في نهاية المطاف التيلوميرات وتفعيل نقاط التفتيش الخلوية مماثلة لتلك الناجمة عن الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل فواصل (DSBs) 13. مثل DSBs الكلاسيكية، وقد تبين ضعف التيلومير للحث على البروتين p53 وما يرتبط بها من الاستجابات الخلوية، مثل الشيخوخة و / أو apoptosiق 14،15. على تعطيل طفرية من البروتين p53، وتتعزز الدراجات الخلية وبقاء الخلية في الخلايا مع ضعف التيلومير، الذي يوفر آلية mutator الموالية للسرطان التي تتميز نقل المواقع والتكبير الإقليمية والحذف 16،17. في الوقت نفسه، واصلت ضعف التيلومير وما يرتبط بها من عدم الاستقرار الكروموسومات المستشري (حتى في خلايا فارغة البروتين p53) تظهر لتقييد تطور خبيث الكامل لهذه السرطانات. على سبيل المثال، جيل أواخر G4-G5 mTERC - أظهرت الفئران انخفاضا كبيرا حدوث سرطان الغدد الليمفاوية مقارنة مع Ink4a / المنتدى الاقليمى الفئران لاغيا بسبب التيلومير الاستنزاف - / - Ink4a / المنتدى الاقليمى - /. وفي دراسة أخرى، والآفات ورميغدي أكثر تقدما في G4 mTERT - / - APC دقيقة الفئران قمعت بشكل كبير بالمقارنة مع الفئران APC دقيقة بسبب اعتقال نموا كبيرا وموت الخلايا المبرمج 18،19. الالملاحظة أن التيلومير خلل الناجم عن عدم الاستقرار الجيني يمنع تطور الورم يطالب تكهنات بأن تفعيل التيلوميراز قد تمكن تطور خبيث في جزء من قمع عدم الاستقرار الجيني إلى مستوى متوافق مع بقاء الخلية السرطانية و / أو تحييد تعتمد على البروتين p53 أو آليات تفتيش مستقلة من. من أجل دراسة ما إذا كانت التيلوميراز تنشيط يمكن أن تتوقف أو حتى عكس الشيخوخة للخلايا الجذعية، وعما إذا كان التيلوميراز تنشيط يمكن أن تعزز تكون الأورام على خلفية عدم الاستقرار الجيني، فإننا ولدت اثنين محرض الأليلات التيلوميراز الفئران. أول واحد هو 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible ثالثي مستقبلات الاستروجين (mTERT-ER) الانصهار الضربة القاضية في أليل. في غياب 4-OHT والفئران متماثلة اللواقح بالنسبة mTERT-ER (المعين mTERT ER / ER) هي النشاط التيلوميراز ناقصة والمحافظة على نفس الظواهر الوراثية الخلوية والخلوية كما mTERT التقليدية أو مTERC نموذج خروج المغلوب. على 4 OHT العلاج، يمكن استعادة TERT-ER نشاط البروتين إلى مستويات مماثلة لالبروتين TERT الأصلي 20، 21، وأليل الثاني هو رواية TERT محرض الضربة القاضية في أليل تحتوي على intronic LoxP-سدادة-LoxP كاسيت (LSL- mTERT)؛ على استئصال LSL لجنة المساواة العرقية بوساطة، وإعادة اعرب mTERT تحت آليات الرقابة التعبير الذاتية 22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Leica AM6000 Micromanipulation Kit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMI6000 B inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>21810031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>Veterinary Anesthesia Systems</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1005796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine-xylazine mixture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K113-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxfien</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT pellet</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>Custermized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Trochar (10 Gauge)</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>MP-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wound clip applier</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clip</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A-433S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>22-032-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>F84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA telomere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F1001-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA centromere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F3003-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1325-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5636-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber cement</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing murine inducible telomerase alleles in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer

الناجم عن اختلال وظيفي التيلومير فقدان النزاهة الجينوم ولها إشارات الحمض النووي من التلف المرتبطة والاستجابات عند نقاط التفتيش هي السائقين الراسخة التي تسبب تدهور الأنسجة أثناء الشيخوخة. السرطان، مع معدلات الإصابة تزداد بشكل كبير مع التقدم في العمر، يتميز أطوال التيلومير قصيرة والنشاط التيلوميراز عالية. لدراسة أدوار ضعف التيلومير والتيلوميراز تنشيط في الشيخوخة والسرطان، ويبين بروتوكول كيفية توليد اثنين التيلوميراز محرض الفئران الضربة القاضية في الأليلات 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible ثالثي مستقبلات الاستروجين (mTERT-ER) والسلمون المدخن -Stopper-السلمون المدخن TERT (LSL-mTERT). يصف بروتوكول الإجراءات للحث على ضعف التيلومير وتنشيط النشاط التيلوميراز في mTERT-ER وLSL-mTERT الفئران في الجسم الحي. وتشير البيانات إلى أن تمثيلية تنشيط النشاط التيلوميراز يمكن أن يخفف من الظواهر التنكسية الأنسجة الناجمة عن اختلال وظيفي التيلومير. في ORDإيه لتحديد تأثير التيلوميراز تنشيط على تكون الأورام، ولدت لنا البروستاتا الورم نموذج G4 PB-Cre4 PTEN L / L البروتين p53 L / L LSL-mTERT L / L والتوتة تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية نموذج G4 أجهزة الصراف الآلي - / - mTERT ER / ER . وتشير البيانات إلى أن تمثيلية تنشيط التيلوميراز في ظل عدم الاستقرار الجيني الناجم عن اختلال وظيفي التيلومير يمكن أن يعزز إلى حد كبير تكون الأورام. يصف البروتوكول أيضا الإجراءات المستخدمة لعزل الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) من mTERT-ER وLSL-mTERT الفئران وتنشيط النشاط التيلوميراز في NSCs في المختبر. وتشير البيانات إلى أن تمثيلية تنشيط التيلوميراز يمكن أن تعزز قدرة التجديد الذاتي وتكوين الخلايا العصبية في المختبر. وأخيرا، يصف بروتوكول الإجراءات لأداء التيلومير FISH (الإسفار في الموقع التهجين) على كلا FFPE الماوس (الفورمالين الثابتة وParafزعنفة جزءا لا يتجزأ) أنسجة المخ والكروموسومات الطورية من الخلايا المستزرعة.

استراتيجيات لتوليد الفئران mTERT-ER وLSL-mTERT الضربة القاضية في الأليلات وصفت في الشكل 1A و 1B. على وجه التحديد، وLoxP - سدادة ثلاثية - الجدد - تم إدراج جزء LoxP بين اكسون 1 و 2 من اكسون mTERT موضع لتوليد LSL-mTERT أليل. لتوليد mTERT-ER أليل، تم إدراج مجال ERT2-الائتلاف الحزبي في الإطار مع الجين mTERT إلى N-محطة من اكسون 1. لقد أظهرنا أنه عندما تم تنشيط التيلوميراز عابر في الفئران ضعف التيلومير من خلال معاملتهم مع الكريات 4-OHT لمدة 4 أسابيع، يمكن التخفيف من حدتها النمط الظاهري التنكسية في أجهزة متعددة مثل الدماغ (الشكل 2A) والخصيتين (الشكل 2B). من أجل تحديد أثر التيلوميراز تنشيط على الخلايا المستزرعة في المختبر، ونحن عزل الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) من جيل أواخر G4 LSL-mTERT وG4 mTERTالفئران -ER. أظهرنا أنه عندما تم تنشيط التيلوميراز في التيلومير NSCs مختلة، والقدرة على التجديد الذاتي من NSCs تم زيادة كبيرة (الشكل 3A)، وتكوين الخلايا العصبية في المختبر وأيضا تعزز إلى حد كبير (الشكل 3B). من أجل تحديد أثر التيلوميراز تنشيط على تكون الأورام في سياق ضعف التيلومير، ولدت لنا PB-Cre4 PTEN L / L البروتين p53 L / L LSL-mTERT L / L (نموذج ورم البروستاتا) وأجهزة الصراف الآلي - / - mTERT ER / ER (التوتة تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية نموذج) الأفواج جيل في وقت متأخر. عندما تم تنشيط التيلوميراز عن طريق العلاج تاموكسيفين في هذه الفئران مع الحقن (الشكل 4A) أو الكريات 4-OHT لمدة 8 أسابيع (الشكل 4B)، تم تعزيز تكون الأورام بشكل كبير في كل من البروستاتا نموذج الورم (الشكل 4A) والتوتة نموذج سرطان الغدد الليمفاوية T-خلية ( <stron<html> ز&gt; الشكل 4B). وأخيرا، أبلغنا البروتوكولات على أداء التيلومير FISH على أنسجة المخ FFPE الماوس (الشكل 5) والكروموسومات الطورية (الشكل 5، أقحم). <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> الشكل (1): (A) mTERT-ER الضربة القاضية في الاستراتيجية. TV، واستهداف ناقلات. WT، النوع البري أليل. KI، الضربة القاضية في أليل. LA، الذراع الأيسر. RA، الذراع الأيمن. E1، اكسون 1؛ E2، اكسون 2. الجدد، PGK المروج يحركها الجين المقاوم بالنيوميسين. ER أو تعديل مستقبلات هرمون الاستروجين (ERT2) يجند مجال ملزمة. DT، dyphteria الجين السم. (B) LSL-mTERT استراتيجية الضربة القاضية في. TV، واستهداف ناقلات. WT، النوع البري أليل. KI، الضربة القاضية في أليل. LA، الذراع الأيسر. RA، الذراع الأيمن. E1، اكسون 1؛ E2، اكسون 2. الجدد، PGK المروج يحركها الجين المقاوم بالنيوميسين. سدادة، ثلاث متواليات توقف النسخي المتكررة. DT، dyphteria الجين السم. الطبقة = &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> الشكل 2: البيانات التمثيلية لاظهار التيلوميراز تنشيط إلى التقليل من الظواهر التنكسية أجهزة صور الممثل من العقول (يسار). والخصيتين (يمين) من G0 وG4 mTERT-ER الفئران التي عولجت بالدواء الوهمي أو 4 OHT لمدة 4 أسابيع. الحانات النطاق تشير 50 ​​ميكرومتر. إعادة طبع بإذن من 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> الرقم 3: البيانات التمثيلية لاظهار التيلوميراز تنشيط يعزز تجديد الذات وتكوين الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية العصبية في المختبر (A) صور الممثل من الخلايا الجذعية العصبيةق معزولة عن G4 LSL-mTERT (اللوحة العليا) وG4 mTERT-ER (اللوحة السفلى) نموا في المتوسط ​​الخلايا الجذعية تعامل مع السيارة أو 4 OHT. (B) صور الممثل من الخلايا العصبية في المختبر (Tuj1 +) من الخلايا الجذعية العصبية معزولة عن G4 mTERT-ER مثقف في التمايز المتوسطة (مع 1٪ FBS) تعامل مع السيارة أو 4 OHT. الحانات النطاق تشير إلى 100 ميكرون. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> الرقم 4: البيانات التمثيلية لإظهار التيلوميراز تنشيط يعزز تكون الأورام على خلفية عدم الاستقرار الجيني (A) صور الممثل للأورام البروستاتا تشريح من G0 PB-Cre4 PTEN L / L البروتين p53 L / L LSL-mTERT +/-، G4 PB- Cre4 PTEN L / L البروتين p53 L / L LSL-mTERT- / -، وG4 PB-Cre4 PTEN L / L البروتين p53 L / L LSL-mTERT L / L تعامل مع تاموكسيفين. إعادة طباعة بإذن من 22. (B) صور الممثل الغدة الصعترية الأورام اللمفاوية T-خلية تشريح من G0 أجهزة الصراف الآلي - / - mTERT + / ER، G4 أجهزة الصراف الآلي - / - mTERT ER / ER تعامل مع السيارة، وG4 أجهزة الصراف الآلي - / - mTERT ER / ER تعامل مع 4- OHT لمدة 8 أسابيع. الحانات النطاق تشير إلى 1 سم. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> الشكل 5: صور الممثل من الكروموسومات وFISH القسيم المركزي على FFPE الماوس أنسجة المخ والطورية (الشكل). الأحمر يشير DNA والأخضر يشير التيلومير تلطيخ، ويشير السماوي مntromere تلطيخ. الحانات النطاق تشير 1 مم.

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer at JoVE.com

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

استخدام الفئران محرض التيلوميراز الأليلات في الدراسات التي أجريت على الأنسجة تنكس / التجديد والسرطان

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

utilizing-murine-inducible-telomerase-alleles-studies-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K Views.  UT MD Anderson Cancer Center. Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer. 

Video: Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

وهناك طريقة لعزل جزيرة الفئران تحت المحفظة وزراعة الكلى

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

نموذج مثلي من سرطان المثانة الفئران

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, a member of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important role in the negative regulation of cell-mediated immune responses through its interaction with its receptor, programmed death-1 (PD-1) 1,2. Overexpression of B7-H1 by tumor cells has been noted in a number of human cancers, including melanoma, glioblastoma, and carcinomas of the lung, breast, colon, ovary, and renal cells, and has been shown to impair anti-tumor T-cell immunity3-8.
Recently, B7-H1 expression by pancreatic adenocarcinoma tissues has been identified as a potential prognostic marker9,10. Additionally, blockade of B7-H1 in a mouse model of pancreatic cancer has been shown to produce an anti-tumor response11. These data suggest the importance of B7-H1 as a potential therapeutic target. Anti-B7-H1 blockade antibodies are therefore being tested in clinical trials for multiple human solid tumors including melanoma and cancers of lung, colon, kidney, stomach and pancreas12.
In order to eventually be able to identify the patients who will benefit from B7-H1 targeting therapies, it is critical to investigate the correlation between expression and localization of B7-H1 and patient response to treatment with B7-H1 blockade antibodies. Examining the expression of B7-H1 in human pancreatic adenocarcinoma tissues through immunohistochemistry will give a better understanding of how this co-inhibitory signaling molecule contributes to the suppression of antitumor immunity in the tumor's microenvironment. The anti-B7-H1 monoclonal antibody (clone 5H1) developed by Chen and coworkers has been shown to produce reliable staining results in cryosections of multiple types of human neoplastic tissues4,8, but staining on paraffin-embedded slides had been a challenge until recently13-18. We have developed the B7-H1 staining protocol for paraffin-embedded slides of pancreatic adenocarcinoma tissues. The B7-H1 staining protocol described here produces consistent membranous and cytoplasmic staining of B7-H1 with little background.

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1 (PD-L1) and its binding to PD-1 provide a major tumor-induced immunosuppressive signal in the tumor&#x2019;s microenvironment. An immunohistochemical staining technique to characterize the expression and localization of B7-H1 in pancreatic adenocarcinoma is described here.

تلوين المناعى من H1-B7 (PD-L1) على البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج الشرائح غدية البنكرياس

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

وما قبل السريرية الفئران نموذج من الانبثاث الكبدي

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الخمول نموذج من الاستروجين تراعي سرطان الثدي في نخاع العظام: أداة للدراسات الآلية الجزيئية والجيل الفرضية

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus SLE in C57BL/6 Mice

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

ومحرض نموذج bm12 من الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) في C57BL / 6 الفئران

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

ما قبل السريرية مثلي فأري موديل سرطان البروستاتا البشرية

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause severe problems, such as abdominal cramping, bloody diarrhea, and weight loss, in affected individuals. Unfortunately, there is no cure yet, and treatments only aim to alleviate symptoms. Current treatments include anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that may cause severe side effects. This warrants the search for alternative treatment options, such as nutritional supplements, that do not cause side effects. Before their application in clinical studies, such compounds must be rigorously tested for effectiveness and security in animal models. A reliable experimental model is the dextran sulfate sodium (DSS) colitis model in mice, which reproduces many of the clinical signs of ulcerative colitis in humans. We recently applied this model to test the beneficial effects of a nutritional supplement containing vitamins C and E, L-arginine, and &#969;3-polyunsaturated fatty acids (PUFA). We analyzed various disease parameters and found that this supplement was able to ameliorate edema formation, tissue damage, leukocyte infiltration, oxidative stress, and the production of pro-inflammatory cytokines, leading to an overall improvement in the disease activity index. In this article, we explain in detail the correct application of nutritional supplements using the DSS colitis model in C57Bl/6 mice, as well as how disease parameters such as histology, oxidative stress, and inflammation are assessed. Analyzing the beneficial effects of different diet supplements may then eventually open new avenues for the development of alternative treatment strategies that alleviate IBD symptoms and/or that prolong the phases of remission without causing severe side effects.

Current treatments of inflammatory bowel diseases (IBD) aim at alleviating disease symptoms but may cause severe side effects. Thus, alternative strategies are being investigated in animal colitis models. Here, we explain how the beneficial effects of diet supplements on clinical IBD signs are analyzed in such a colitis model.

تحليل مفيد آثار المكملات الغذائية على وظائف الأمعاء طلائي الحاجز أثناء التجريبية التهاب القولون

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority of the practical and technical details are commonly omitted in published manuscripts which, therefore, makes it challenging to reproduce the models, particularly when it involves surgical techniques. Bioluminescence technology allows for the evaluation of small amounts of cancer cells even when a tumor is not palpable. Utilizing luciferase-expressing cancer cells, we establish a breast cancer orthotopic inoculation technique with a high tumorigenesis rate. Lung metastasis is assessed utilizing an ex vivo technique. We, then, establish a mastectomy model with a low local recurrence rate to assess the metastatic tumor burden. Herein, we describe, in detail, the surgical techniques of orthotopic implantation and mastectomy for breast cancer with a high tumorigenesis rate and low local recurrence rates, respectively, to improve breast cancer model efficiency.

We introduce a murine orthotopic breast cancer model and radical mastectomy model with bioluminescence technology to quantify the tumor burden to mimic human breast cancer progression.

توليد نموذج سرطان الثدي المنتشر مورين أورثوتوبيك والقيام باستئصال الثدي الجذري مورين

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

وضع العلامات المناعية للفخاخ خارج الخلية البشرية ومورين العدلات في الأنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...