نشكر مي آن ليم لقراءة نقدية للمخطوطة وغيرها من أعضاء مختبرنا لمناقشاتهم طوال هذا العمل. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم يامادا ورويال الزمالات جمعية زيارة قصيرة والاتحاد الأوروبي ماري كوري الدولية GRR زمالة الواردة إلى KK، وBBSRC منحة المشروع (BB/H002278/1) ويلكوم ترست معدات غرانت (073228/Z/03/Z) لAH

<ol>
	<li>Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Drosophila+model+of+nerve+injury+reveals+an+essential+role+of+Nmnat+in+maintaining+axonal+integrity.">A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity.</a> Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J. Cell Biol. 191, 211-223 (2010).</li><li>Leyssen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+promotes+post-developmental+neurite+arborization+in+the+Drosophila+brain.">Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain.</a> EMBO J. 24, 2944-2955 (2005).</li><li>Kato, K., Awasaki, T., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+programmed+cell+death+induces+glial+cell+division+in+the+adult+Drosophila+brain.">Neuronal programmed cell death induces glial cell division in the adult Drosophila brain.</a> Development. 136, 51-59 (2009).</li><li>Ayaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila.">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J. Neurosci. 28, 6010-6021 (2008).</li><li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+bases+of+behavioral+plasticity:+establishing+and+modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+genetic+system.">Cellular bases of behavioral plasticity: establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila genetic system.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li><li>Gomez-Marin, A., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+sensation+during+orientation+behavior+in+the+Drosophila+larva:+more+sense+than+luck.">Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than luck.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 22, 208-215 (2012).</li><li>Schleyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavior-based+circuit+model+of+how+outcome+expectations+organize+learned+behavior+in+larval+Drosophila.">A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila.</a> Learn Mem. 18, 639-653 (2011).</li><li>Brown, H. L., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-285 (2006).</li><li>Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+regenerative+response+to+central+nervous+system+injury+is+enabled+by+pros-notch+and+pros-NFkappaB+feedback.">The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback.</a> PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila protocols. , (2000).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 15050-15055 (2001).</li><li>Verkhusha, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+mutant+of+red+fluorescent+protein+DsRed+for+double+labeling+and+developmental+timer+of+neural+fiber+bundle+formation.">An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation.</a> J. Biol. Chem. 276, 29621-29624 (2001).</li><li>Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+regenerative+response+to+central+nervous+system+injury+is+enabled+by+Pros-Notch+and+Pros-NFkB+feedback.">The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by Pros-Notch and Pros-NFkB feedback.</a> PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7, 27-41 (1998).</li><li>Forero, M. G., Kato, K., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+cell+counting+in+vivo+in+the+larval+nervous+system+of+Drosophila.">Automatic cell counting in vivo in the larval nervous system of Drosophila.</a> J. Microsc. 46, 202-212 (2012).</li><li>Forero, M. G., Pennack, J. A., Learte, A. R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeadEasy+caspase:+automatic+counting+of+apoptotic+cells+in+Drosophila.">DeadEasy caspase: automatic counting of apoptotic cells in Drosophila.</a> PLoS One. 4, e5441 (2009).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141, 536-548 (2010).</li><li>Nicolai, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+dendritic+marker+sheds+light+on+neuronal+connectivity+in+Drosophila.">Genetically encoded dendritic marker sheds light on neuronal connectivity in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20553-20558 (2010).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وضعنا بروتوكولا للطعن إصابة في الجهاز العصبي المركزي اليرقات ذبابة الفاكهة للتحقيق في الاستجابات الخلوية لإصلاح والإصابات والتجدد. وتشريح VNCs اليرقات وطعن، وبعد ذلك يتم تصوير أنها مع مرور الزمن المجهري أو المحدد لمضان المناعية لتصور الدبقية والخلايا العصبية، الخلايا أو انقسام الخلايا. ويمكن قياس تطور الآفة مع مرور الوقت. ويرافق هذه الطريقة من قبل البرمجيات المتقدمة عمدا عن التحليل الكمي والإحصائي للتغييرات على عدد الخلايا والإصابة أثناء الإصلاح. نحن طعن لمدة 96 ساعة AEL اليرقات (وكانت ثابتة إما هذه أو السماح لمواصلة تطوير)، وهي مرحلة التطوير قبل الانتقال إلى خادرة ثم ذبابة الكبار. في 96 ساعة، VNCs هي كبيرة بما يكفي لطعنه، بل هي في منتصف مرحلة الطور الثالث، وبالتالي لا يخضع التشرنق حتى الآن، والجهاز العصبي هو بالفعل مماثلة تماما لتلك التي وظيفية الإعلانULT. قد يكون من الممكن في وقت لاحق قليلا طعن في اليرقات ويجب اختيار توقيت دقيق لتتناسب مع سؤال البحث. ومع ذلك، اعتمادا على الأسئلة الموجهة، سيكون من الضروري عموما ثقافة VNCs لبعض الوقت للاطلاع على الاستجابات الخلوية للإصابة. بعض الوقت بعد 120 ساعة يبدأ التشرنق AEL، وهي فترة عندما CNS هو تشكيلها، وبالتالي الأفضل تجنبها. وبالتالي يقتصر بدلا نافذة الوقت لطعنه الثقافة زائد في اليرقة. باستخدام اليرقات لا يزال لديه ميزة كبيرة على استخدام التقنية البالغين: في حين، على غرار الكبار، والجهاز العصبي هو بالفعل تعمل بكامل طاقتها، وتحليل استجابة لإصابات وأسهل بكثير وأسرع في اليرقات. عند مقارنة حجم ومورفولوجية العقول وVNCs تشريح ومثقف في طبق لVNCs التي تشريح في وقت لاحق نقطة أي ما يعادل زراعة بدون في طبق، يبدو أن التنمية هي أبطأ في الثقافة مما كانت عليه في الجسم الحي. في جوانب أخرى،التنمية يحمل على عادة في الثقافة، والحفاظ عليها وسلامة الأنسجة والخلايا وتظهر على قيد الحياة ردود متعددة. توسيع الجرح، وإصلاح neuropile وانتشار الدبقية تجري في غضون 22 ساعة بعد طعن. هذا يدل على أن الاستجابات الخلوية لإصابة تحدث في الثقافة، وهناك على الأرجح لا حاجة للحفاظ على إإكسبلنتس لفترة أطول من يوم واحد. إذا كان المطلوب الثقافة على المدى الطويل، قد تتطلب التحسين بروتوكول مزيد من مثل استخدام لوحة إدراج ثقافة 5. من المهم تحديد عينات نوعية جيدة من تلك التدهور. تحسين هذا البروتوكول يحتاج إلى بعض المهارة وانحطاط لا محالة سوف تحدث في بعض العينات. يمكن للحصول على VNC &quot;القنبيط&quot; المظهر الذي يعكس انهيار سلامة الأنسجة (الشكل 5B). ومن المسلم به أيضا من قبل تنكس تشكل الفجوات من VNC بشكل مستقل عن الطعن، والتي يمكن أن تكون موجودة في العينات غير سليمة طعن، (الشكل 5C </strاونج&gt;). يجب أن يتم تجاهل هذه العينات. وعلى الأرجح سبب انحطاط من تشريح الخام، والتي يمكن أن تمزق الأعصاب وطبقة واقية من الخلايا الدبقية السطح. يجب توخي الحذر الشديد وبالتالي لتشريح بلطف. العوامل المؤثرة الأخرى تشمل ثقافة المتوسط، التي يجب أن تبقى نظيفة ومع المضادات الحيوية، والتقيد الصارم ليغسل وتوقيتات كما هو مبين في البروتوكول. وأخيرا، وطول الإبرة وحامل الإبرة، وحجم الحدة من الإبرة مهمة جدا. يمكن للحامل إبرة تلوث المتوسط ​​الثقافة وإبرة حادة يمكن أن تسبب الإصابة الكبيرة التي لا يمكن إصلاح نفسه، وسوف يؤدي إلى انحطاط. من المهم بشكل روتيني للحفاظ على الإبرة الحادة. في هذا البروتوكول، ونحن قد استفادت من البروتين خط فخ الذباب لتصور neuropile بالتوازي مع التصور عمليات الدبقية باستخدام التقليدية GAL4-UAS النظام. ويمكن أيضا أن هذه الأدوات جنبا إلى جنب مع غيرها من نظم التعبير الثنائية مثل لوxa موقع 19 و Q-نظام 20، والتي هي مستقلة عن GAL4. وهذا من شأنه تحليل التفاعلات بين محاور عصبية على سبيل المثال والعمليات الدبقية، ردا على الاصابة. من خلال الجمع بين أدوات أخرى مع وراثية أخرى مثل لصحفيين التشعبات 21 أو تدفق الكالسيوم 22، هذا الأسلوب يوفر فرصة كبيرة لتحليل بيولوجيا الخلية وراء استجابة إصابة الخلايا الدبقية، محاور عصبية العصبية والتشعبات في الجهاز العصبي المركزي. وأخيرا، يمكن الجمع بين هذه الطريقة القياسية مع علم الوراثة، والطفرات والإفراط في التعبير عن الجينات، لاختبار وظيفة الجين في الردود على الإصابة والتجدد. وقد أدى هذا البروتوكول بنجاح إلى اكتشاف شبكة الجينات الكامنة وراء استجابة التجدد الدبقية لإصابة الجهاز العصبي المركزي 11. نظرا لحفظ الجينات التطورية وظيفة، كشف هذه الأحداث الخلوية وظائف الجينات في الذباب الفاكهة من المرجح أن تقدم أفكارا مهمة في فهم أماهCNS mmalian ردا على الإصابات والتجدد.

التجديد في الحيوانات تكشف أن خلايا الإحساس عند الكائن الحي وأمرت النمو الكامل، وكيف الهيكلية سلامة الكائن الحي ويتم تحقيق والمحافظة عليها. فهم هذه القدرات غامضة من الخلايا هي ذات أهمية كبيرة في علم الأحياء. تعزيز التجدد هو واحد من الأهداف الرئيسية لعلم الأعصاب الطبية. في البشر، وتلف الجهاز العصبي المركزي (CNS) لا تجديد. وتستخدم نماذج القوارض من إصابة الحبل الشوكي لفهم كيفية استجابة الخلايا للإصابة. ومع ذلك، الشواغل الأخلاقية، والتكاليف العالية ودورة حياة هذه الحيوانات البطيئة للتقيد التقدم. وذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة هو كائن النموذج المستخدم على نطاق واسع في البيولوجيا التطورية وعلم الأعصاب. بفضل أدواته الوراثية قوية ودورة حياة قصيرة، وأدى ذبابة الفاكهة متكرر لاكتشاف وظائف الجينات والجينات ذات الأهمية الشبكات لفهم البشر والمرض. هناك أدلة وفيرة من يخدع التطوريةservation وظيفة الجين من الذباب للإنسان. خلال السنوات الأخيرة، تم إنشاء العديد من النماذج لإصابة الجهاز العصبي في ذبابة الفاكهة. بعض تتكون من إتلاف الأعصاب الطرفية التي تعمل على طول الجناح أو axotomy من الأعصاب الطرفية، بما في ذلك 1 الحسية والحركية محاور عصبية 2. ومع ذلك، فإن أنظمة الطرفية والجهاز العصبي المركزي تختلف في كثير من النواحي، وكما هو معروف جيدا أن العديد من الحيوانات في النظام العصبي الطرفي يمكن تجديد في حين أن CNS لا يمكن. وبالتالي، لفهم CNS التجديد، والإصابة المباشرة للCNS هو أكثر ملاءمة. وقد طعن الإصابة بإبرة تطبيقها بنجاح إلى الدماغ الكبار ذبابة الفاكهة للتحقيق في استجابة لإصابة 3،4. باستخدام نهج آخر، وتحليلها عياض وآخرون. CNS قطعت محاور عصبية في أدمغة البالغين مثقف مع السلطة microdissector بيزو، والتجديد لهم لمدة 4 أيام 5. وميزة هذه المجموعة التجريبية ش في وقت لاحقملاحظة هو أنها تركز على الدماغ، والتي هي بلا شك ذات أهمية كبيرة. العيب هو أن الدماغ هو أكثر بكثير تعقيدا من VNC، الذي يتعامل فقط مع المحرك والسيطرة الحسية. العمل على الدماغ الكبار هو أيضا أكثر مضيعة للوقت. اليرقة مستعدة لاجراء تجارب في 4 أيام، في حين يستغرق حوالي 10 يوما لeclosion الكبار، ومن ثم 5 أيام إضافية للنضوج الخاصة بهم. الدماغ الكبار هو أيضا أكثر صعوبة في التعامل معها، لأن ذلك يتم تغليف في إهاب سميكة، والتي من الصعب إزالتها. وVNC لديه الجذب مزيد من كونه وظيفيا إلى الحبل الشوكي الفقاريات. ويستخدم على نطاق واسع يرقة ذبابة الفاكهة كما كائن نموذج لعلم الأعصاب 6-9. بالمعنى الدقيق للكلمة على الرغم من اليرقة في مرحلة النمو، فإنه يمكن أيضا أن تعتبر الحيوانات تعمل بكامل طاقتها. اليرقة لديها الحركة والحواس متعددة بما في ذلك الذوق، الشم وحس الألم، والتعلم والذاكرة. وهكذا، فإن اليرقات VNC ثكما اختارت النموذج المثالي للإصابة الجهاز العصبي المركزي. ويمكن تشريح VNCs اليرقات والعذارى ومثقف في الطبق، لا يزال الإبقاء على سلامة الخلوية لمدة تصل إلى 24 ساعة 10. واقترح هذا ويمكن تطبيق ذلك إصابة VNC، والتي يمكن بعد ذلك سجلت في مرور الزمن لأكثر من هذه الفترة من الزمن، أو مستنبت وثابتة في أي لحظة الوقت المطلوب خلال هذه الفترة. هنا، نقدم لنموذج تجريبي لإصابة الجهاز العصبي المركزي باستخدام اليرقات ذبابة الفاكهة VNC. يتم تشريح أولا VNC من يرقة، ويتم تطبيق إصابة طعن يدويا باستخدام إبرة التنغستن. ثم يتم وضع VNC على ساترة الزجاج القاع، وصورت مع مرور الزمن ليزر متحد البؤر المجهر. وبدلا من ذلك، يمكن للمثقف VNCs لفترة من الوقت المطلوب، ويمكن تحليل آثار الإصابة الخلوية في العينات الثابتة باستخدام المجهر متحد البؤر والمناعية. ويمكن قياس منطقة الجرح، والتحليل الكمي من خلية نويمكن أن يتم mber (تكاثر الخلايا وموت الخلايا) خارجا مع البرمجيات المتقدمة عمدا. ويمكن التعامل مع أحجام عينة كبيرة بسهولة، مما أدى إلى نتائج التحقق من صحة إحصائيا. وقد تم الجمع بين هذه الأساليب بنجاح مع علم الوراثة قوية من ذبابة الفاكهة لاكتشاف الجينات التي تقوم عليها شبكة الاستجابة الدبقية التجدد إلى إصابة الجهاز العصبي المركزي 11.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> معدات </td></tr><tr><td> كتلة تلطيخ </td><td> مجهر برونيل </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ملقط رقم 5 </td><td> على سبيل المثال أدوات العلوم الجميلة </td><td> على سبيل المثال 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> إبرة التنغستن: قطر قضيب، 0.5 مم؛ حجم الحافة، 1 ميكرومتر، ومدة، 2 بوصة </td><td> Roboz الأدوات الجراحية </td><td> RS-6065 </td><td></td></tr><tr><td> إبرة حامل </td><td> Roboz الأدوات الجراحية </td><td> RS-6060 </td><td></td></tr><tr><td> Arkansans الحجارة: كيت إصلاح لالملقط دومون </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 29000-00 </td><td></td></tr><tr><td> طبق بتري 35 مم 27 مم مع قاعدة الزجاج </td><td> إيواكي </td><td> 3930-035 </td><td></td></tr><tr><td> لايكا المجهر متحد البؤر SP2-AOBS مقلوب مع غرفة البيئة </td><td> لايكا </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> كاشف </td></tr><tr><td> درع والمتوسطة سانغ M3 الحشرات (إكديسون مجانا) </td><td> سيجما </td><td> S3652-500 مل </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين والستربتوميسين </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) </td><td> انظر 12 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> سيجما </td><td> F7524 </td><td></td></tr><tr><td> بولي-L-lysin </td><td> سيجما </td><td> P1399-25mg </td><td></td></tr><tr><td> الفورمالديهايد، و 10٪، والميثانول الحرة، النقاء </td><td> Polysciences </td><td> 04018-1 </td><td></tد&gt; </tr><tr><td> الأجسام المضادة لمكافحة الماوس مخلقة الجلوتامين </td><td> ميليبور </td><td> MAB302 </td><td></td></tr><tr><td> أرنب المضادة للأضداد GFP </td><td> الحياة تكنولوجيات </td><td> A11122 </td><td></td></tr><tr><td> الماوس المضادة للأضداد REPO </td><td> الدراسات التنموية ورم هجين الضفة </td><td> 8D12 </td><td></td></tr><tr><td> الفئران مكافحة ELAV الأجسام المضادة </td><td> الدراسات التنموية ورم هجين الضفة </td><td> 7E8A10 </td><td></td></tr><tr><td> أرنب المضادة للأضداد بالموقع كاسباس 3 </td><td> Abcam </td><td> ab13847 </td><td></td></tr><tr><td> مصل الماعز العادي </td><td> ناقلات المختبرات </td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> المضادة للأرنب اليكسا فلور 488 </td><td> الحياة تكنولوجيات </td><td> A11034 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الماوس اليكسا فلور 647 </td><tد&gt; الحياة تكنولوجيز </td><td> A21236 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الفئران اليكسا فلور 647 </td><td> الحياة تكنولوجيات </td><td> A21247 </td><td></td></tr></tbody></table>

an injury paradigm to investigate central nervous system repair in drosophila

وقد تم وضع المنهج التجريبي للتحقيق في الاستجابات الخلوية لنظام العصبي المركزي (CNS) إصابة ذبابة الفاكهة باستخدام الفاكهة ذبابة. إصلاح وتجديد الفهم في الحيوانات هو السؤال الرئيسي في علم الأحياء. الجهاز العصبي المركزي التالفة الإنسان لا تجديد، وفهم كيفية تعزيز التجدد هو واحد من الأهداف الرئيسية لعلم الأعصاب الطبية. ويمكن استخدام مجموعة الأدوات القوية الوراثي للذبابة الفاكهة لمعالجة مشكلة تجديد الجهاز العصبي المركزي. يتم تطبيق آفة في العصب الحبل البطني CNS (VNC، أي ما يعادل الحبل الشوكي الفقاريات) يدويا باستخدام إبرة التنغستن. يمكن بعد ذلك يتم تصويره في VNC مرور الزمن باستخدام الليزر المجهري متحد البؤر المسح الضوئي لمدة تصل إلى 24 ساعة لمتابعة تطور الآفة مع مرور الوقت. وبدلا من ذلك، يمكن تربيتها عليه، ثم إصلاح وملطخة باستخدام المناعي لتصور الخلايا العصبية والخلايا الدبقية مع المجهري متحد البؤر. استخدام علامات المناسبة، تشايمكن nges في شكل الخلية والخلية الدولة نتيجة الإصابة يمكن تصور. مع يماغيج وضعت عمدا المكونات الإضافية، يمكن أن يتم التحليل الكمي والإحصائي إلى قياس التغيرات في حجم الجرح مع مرور الوقت وآثار إصابة في تكاثر الخلايا وموت الخلايا. تسمح هذه الطرق تحليل عينات كبيرة الحجم. ويمكن الجمع بينها وبين علم الوراثة قوية من ذبابة الفاكهة للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء CNS التجديد والإصلاح.

هنا نعرض كيفية تنفيذ إصابة طعن إلى VNC اليرقات ذبابة الفاكهة وتحليل الاستجابات الخلوية للإصابة باستخدام الوقت الفاصل بين والمناعية مبائر المجهري مضان. لمرور الزمن البيانات، والآفة تصور كمنطقة GFP سلبية داخل neuropile العينات التي تحمل علامة G9 محور عصبي (الشكل 2). بعد فترة وجيزة طعن، GFP سلبية الصغيرة المناطق التي تبدو وكأنها ثقوب أو فجوات، تبدأ في الظهور (الشكل 2A). مثل GFP سلبية المناطق تكبير عموما إلى حوالي 6-8 ساعة بعد طعن (الشكل 2A). في وقت لاحق، والمناطق GFP سلبية تقليص وحتى قد تختفي (الشكل 2B). بنسبة 22 ساعة بعد طعن، المنطقة التي تحتلها الجرح هو أصغر حجما من المساحة القصوى كان من 6 إلى 8 ساعات بعد طعن (أرقام 2A، B). وبالمثل، فإن منطقة DsRed سلبية في عمليات الدبقية يزيد في البداية أيضا، ولكن shrinKS بنسبة 22 ساعة بعد طعن. ومن المثير للاهتمام، وغالبا ما DsRed إيجابية عمليات الدبقية ملء الثقوب GFP سلبية في neuropile قبل اختفائهم (الشكل 2C). يمكن استخدام المناعية في العينات الثابتة، وعمليات الدبقية بخير واستجابتها للإصابة يمكن تصور مع دقة أفضل من مع مرور الزمن الصور. ويمكن أن يتم ذلك، على سبيل المثال، باستخدام برنامج تشغيل repoGAL4 الدبقية للحث على التعبير عن مراسل غشاء المربوطة (على سبيل المثال، UAS mCD8GFP) في الذباب لتصور جميع الخلايا الدبقية (باستثناء الخلايا الدبقية خط الوسط). ويمكن أيضا أن يدمج مع علامات الدبقية الأخرى، مثل GS2 المضادة، التي تصف neuropile المرتبطة الخلايا الدبقية (أرقام 3A، B). هنا نعرض أنه على الرغم من طعن الحبل البطني العصب من الجانب الظهري، والطعن في نتائج الإصابة دنت بطنيا (3A الشكل، النصال). طعن يبدو أنه يؤثر على أكثر بشدة neuropile وneuropile المرتبطة-TH الخلايا الدبقيةسطح القشرة والخلايا الدبقية (الشكل 3B). تظهر عمليات غير منظمة الدبقية في neuropile، في حين أنها لا تزال تحافظ على حياتها مثل شبكة منظمة في القشرة. النتائج إصابة في GS2 إيجابية الحطام الخلوية، والتي تختلف عن الخلايا الطبيعية وشظايا الحطام هي أصغر بكثير وليس متصلا جسم الخلية. هذا يكشف الأضرار التي لحقت neuropile المرتبطة الخلايا الدبقية (الشكل 3B). كما لوحظ تدهور neuropile المرتبطة الخلايا الدبقية بواسطة المجهر الإلكتروني 15. ويلاحظ مكافحة المشقوق-كاسباس موت الخلايا المبرمج في تلطيخ + 3 neuropile المرتبطة الخلايا الدبقية 15، تبين أنها تخضع موت الخلايا المبرمج على طعن الاصابة. وظهر أيضا Neuropile الخلايا المرتبطة الدبقية العصبية في phagocytose الحطام 15، وGS2 + إشارة قد تكشف أيضا الإحاطة من الخلايا العصبية أفكارك من خلال عمليات الدبقية. ويلاحظ أيضا المشقوق-كاسباس + أفكارك الخلايا في القشرة، على الأقل البعض منها تتوافق مع Elav + الخلايا العصبية ( <strاونج&gt; الشكل 3C). باستخدام عينات الثابتة والمناعية تمكن أيضا من تحليل الكمي لاستجابات الخلايا للإصابة، مثل الآثار في الانتشار وموت الخلايا المبرمج. لهذا، قمنا بتطوير عمدا 2 يماغيج المكونات الإضافية، DeadEasy اليرقة كاسباس وDeadEasy الدبقية، لحساب تلقائيا عدد من الخلايا الدبقية والخلايا أفكارك، على التوالي. وقد تم التصديق عليها للعمل على VNCs اليرقات ودقيقة للغاية. باستخدام هذه، فمن الممكن أن نلاحظ زيادة في عدد REPO إيجابية الخلايا الدبقية الناجمة عن الإصابة طعن، بنسبة 22 ساعة (الشكل 4A) 15. هناك أيضا زيادة في عدد المضادة للالمشقوق-كاسباس-3 خلايا أفكارك بنسبة 6 ساعة 15 (الشكل 4B) بعد طعنه. هذه الزيادة في انتشار الدبقية والخلايا استجابة لإصابة في الجهاز العصبي المركزي ذبابة الفاكهة تذكر الاستجابة إصابة في الجهاز العصبي المركزي الفقاريات. A جانبا حاسما في هذا بروtocol هو نوعية تشريح VNC. من الصعب أن أقول في وقت تشريح ما إذا كان قد تضررت أم لا VNCs في هذه العملية. من المهم أن تولي عناية خاصة لأداء تشريح لطيف. ومع ذلك، لا محالة عينات نوعية سيئة أن تنتج، وأنه من الضروري أن يتم تحديد هذه في مراحل لاحقة والتخلص منها. في أيدينا، VNC تنكس يبدو أن لا علاقة لها الإصابة، ولكن بدلا من ذلك تسبب تشريح الخام. لاحظ أننا لم حاسما في حجم الجرح الإصابة، ونقوم بتحليل جميع العينات التي ليست جرح المتدهورة. عندما VNCs الحفاظ على سلامتها، والسطح VNC يميل الى نظرة على نحو سلس وبراقة، ويلاحظ أي ثقوب في neuropile (الشكل 5A). ويمكن التعرف على تدهور بنسبة 24 VNCs ساعة تشريح ما بعد من سطح خشن من المناطق البطنية والجانبية VNC (الشكل 5B). يمكن تدهور neuropile لا علاقة لها أيضا أن تحدث الإصابة طعن، ويتم التعرف على أنها ح neuropileoles في إشارة خلفية العينات immunostained. يجب أن يتم تجاهل هذه العلامات مع عينات من الضمور (الشكل 5C). في أيدينا، فإن معدل النجاح للتشريح والإصابة في السيطرة سليمة وطعن (YW) الذباب على حد سواء نحو 70٪. سوف تختلف هذه النسبة مع مهارة الشخص الذي يقوم التجارب، ومع النمط الوراثي. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig1.jpg" /> الشكل 1. الرسم التخطيطي لتنظيم اليرقات وطعن الاصابة. (A) في يوم 0، يسمح الذباب لتضع بيضها في طبق بتري عصير العنب لمدة 3 ساعة. في يوم 1، وتحاك يرقات العمر الأول (L1) وتجمع وتوضع في قارورة تحتوي على الخميرة الغذائية القياسية، حيث يتم الاحتفاظ بها لمدة 3 أيام. في يوم 4، يتم جمع اليرقات من قارورة الغذاء، وتستخدم للطعن التجارب. (B) عرض الجانبي للنظام العصبي المركزي اليرقات.وطعن منطقة البطن من الحبل البطني العصب بإبرة من الجانب الظهري. الأمامي إلى اليسار، والخلفي إلى اليمين. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig2.jpg" /> الشكل 2. الوقت الفاصل بين تطور الآفة VNC. متحد البؤر المجهري على VNCs حية مع محاور عصبية GFP-صفت وصفت-DsRed الخلايا الدبقية. النمط الجيني: UASDsRed / +؛ G9 / +؛ repoGAL4 / + (A) ومن المسلم به الآفة بسبب عدم وجود مضان على neuropile محور عصبي. بعد طعن، GFP سلبية تظهر الثقوب، وزيادة بعد ذلك في الحجم والعدد. التوقعات من 5 أقسام البصرية من كل نقطة بعد طعن الوقت المحتسب بدل الضائع. (B) ومحور عصبي ينكمش الآفة neuropile من 9 ساعة بعد طعن. هذه الصور هي أقسام البصرية واحدة من نقاط زمنية مختلفة بعد طعن الاصابة. لتحديد المواقف ما يعادلها في كل عينة، وعدد من شريحة نفس عصاموقد تم اختيار الفصل نقطة في الوقت كومة من الوقت الفاصل بين البيانات. وبمقارنة أنماط تصور مع G9 وrepoGAL4&gt; UASmCD8GFP في المنطقة لم تتأثر طعن، التحقق من شرائح بأنها من مواقع يعادل في محور Z. الخطوط المتقطعة في (A، B) إلى حافة الجرح. (C) تضخم عالية الجروح من neuropile. امتلأت GFP سلبية الثقوب مع DsRed إيجابية عمليات الدبقية، واختفى بعد ذلك (النصال). مشاهدة الأفقي. حتى الأمامية. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig3.jpg" /> الشكل 3. الخلوية توصيف الآفة VNC. VNCs تحمل مراسل غشاء GFP المربوطة لجميع الخلايا الدبقية (باستثناء خط الوسط الدبقية) ملطخة GFP المضادة للطائرات والمضادة GS2، وneuropile المرتبطة علامة الخلية الدبقية. النمط الجيني: + / +؛ UASmCD8GFP / +؛ repoGAL4 / + (A) وطعن VNCs من الدرSAL الجانب، ولكن هذا يؤدي إلى دنت بطنيا (النصال). مشاهدة السهمي من أقسام البصرية واحد، حتى اليسار الظهرية الأمامية و. (A، B) طعن إصابة الخلايا الدبقية يؤثر أشد neuropile المرتبطة من الخلايا الدبقية سطح القشرة و. النتائج إصابة في GS2 إيجابية الحطام الخلوية (رؤوس الأسهم في B). (B) عرض أفقي واحد من المقاطع البصرية، حتى الأمامية. رؤوس سهام تشير إلى GS2 + الحطام الخلية. (C) Colocalisation من علامة أفكارك مكافحة المشقوق-كاسباس-3 وعلامة العصبية المضادة للElav تبين أن الإصابة عند بعض الخلايا الميتة في القشرة هي الخلايا العصبية. NP، neuropile؛ CX، القشرة. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig4.jpg" /> الشكل 4. التلقائي عد الخلايا الدبقية والخلايا أفكارك باستخدام DeadEasy. (A) مثال من استخدام &quot;الخلايا الدبقية اليرقات DeadEasy &#39;لحساب REPO إيجابيةالدبقية الخلايا. بقي من الزمن: نصفين VNC بطني ملطخة مكافحة REPO الأجسام المضادة؛ الأوسط: خرج من الخلايا الدبقية اليرقات تظهر الخلايا DeadEasy التي حددها في المكونات، والحق: الدمج. الأرقام على اليمين هي عدد REPO إيجابية تحسب الخلايا تلقائيا في كومة كاملة من أقسام مبائر البصرية في حوالي 30 ثانية. يزيد عدد الخلايا الدبقية في VNCs طعن. (B) مثال على استخدام &#39;يرقة كاسباس DeadEasy&#39;. ترك: توقعات المادتين 5 مبائر البصرية ملطخة الأجسام المضادة 3 ألغام مضادة للالمشقوق-كاسباس؛ الأوسط: خرج تظهر الخلايا التي حددتها في المكونات، والحق: الدمج. الأرقام على اليمين هي عدد كاسباس إيجابية تحسب الخلايا تلقائيا في كومة كاملة من أقسام مبائر البصرية في حوالي 30 ثانية. عدد الخلايا أفكارك يزيد في طعن VNC. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig5.jpg" /> الشكل 5. أمثلة على degeneratأيون. (A) A VNC صحية. لا توجد علامات انحطاط. (B) وجانب من الصدر هو التحول (النصال) في عينة طعن. النجمة تشير إلى موقع الآفة. (C) ثقوب في neuropile الصدري (رأس السهم الأبيض) والقشرة (رأس السهم البرتقالي) في VNC غير طعن. يجب أن يتم تجاهل العينات التالفة تشكل الفجوات مع neuropile واسعة النطاق. هنا كانت ملطخة VNCs مع علامة المرتبطة neuropile الدبقية مكافحة الأبنوس. مشاهدة أفقية، حتى الأمامية.

Watch this Scientific Journal Video about An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila at JoVE.com

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

ويوصف نموذج باستخدام اليرقات إصابة الحبل العصبي البطني ذبابة الفاكهة للتحقيق المركزية تجديد الجهاز العصبي والإصلاح. طعن تليها الليزر المجهر متحد البؤر في الوقت الفاصل بين العينات والثابتة، بالإضافة إلى التحليل الكمي مع البرمجيات المتقدمة هادف وعلم الوراثة، وتستخدم للتحقيق في الآليات الجزيئية للتجديد وإصلاح CNS.

والنموذج الإصابات المعنية بالتحقيق في وسط الجهاز العصبي في إصلاح<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

an-injury-paradigm-to-investigate-central-nervous-system-repair

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

13.2K Views.  University of Birmingham. ويوصف نموذج باستخدام اليرقات إصابة الحبل العصبي البطني ذبابة الفاكهة للتحقيق المركزية تجديد الجهاز العصبي والإصلاح. طعن تليها الليزر المجهر متحد البؤر في الوقت الفاصل بين العينات والثابتة، بالإضافة إلى التحليل الكمي مع البرمجيات المتقدمة هادف وعلم الوراثة، ?...

Video: An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

التصور الجهاز العصبي الجنينية في جبل لالجامع ذبابة الفاكهة الأجنة

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

انتاج ناقلات Lentiviral للخلايا Transducing من الجهاز العصبي المركزي

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

وضع العلامات واحدة من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

مباشرة داخل البطين تسليم المخدرات الى القوارض الجهاز العصبي المركزي

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

في الجسم الحي الاستجواب من النظام العصبي المركزي Translatome بواسطة Polyribosome تجزئة

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

المقاصة البصري للنظام العصبي المركزي الماوس عن طريق وضوح السلبي

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

مستوحاة تشريحيا ثلاثي الأبعاد الأنسجة الدقيقة المهندسة الشبكات العصبية لإعادة الإعمار الجهاز العصبي، والتحوير، والنمذجة

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Quantifying Acute Changes in Renal Sympathetic Nerve Activity in Response to Central Nervous System Manipulations in Anesthetized Rats

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are limited resources directing scientists in the techniques for measuring and analyzing these variables. This protocol describes the methods for measuring RSNA and mean arterial pressure in anesthetized rats. The protocol also includes the approaches for accessing the brain during RSNA recordings for central nervous system (CNS) manipulations. The RSNA recording technique is compatible with pharmacologic, optogenetic, or electrical stimulation of the CNS. The approach is useful when an investigator will measure short-term (min to h) autonomic responses in non-survival experiments to correlate anatomically with CNS nuclei. The approach is not intended to be used to obtain chronic (survival) recordings of RSNA in rats. Discharges in RSNA, averaged rectified RSNA, and mean arterial pressure can be quantified and analyzed further using parametric statistical tests. Methods for obtaining venous access, recording mean arterial pressure telemetrically, and brain fixation for future histological analysis are also described in the article.

Methods for measuring sympathetic and cardiovascular responses to central nervous system (CNS) manipulations are important for advancing neuroscience. This protocol was developed to assist scientists with measuring and quantifying acute changes in renal sympathetic nerve activity (RSNA) in anesthetized rats (non-survival).

قياس التغيرات الحادة في نشاط العصب متعاطفة الكلوي ردا على الجهاز العصبي المركزي التلاعب في الفئران تخديره

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are ...