אנו מודים למיי אן לים לקריאה ביקורתית של כתב היד ושאר חברי המעבדה שלנו לדיונים שלהם ברחבי במהלך עבודה זו. עבודה זו מומנה על ידי מלגות לביקור קצרות חברה מלכותית יאמאדה קרן מדע והאיחוד האירופי וgrr מארי קירי הבינלאומי נכנס למלגת KK, וBBSRC הפרויקט גרנט (BB/H002278/1) וקרן Wellcome ציוד גרנט (073228/Z/03/Z) לAH

<ol>
	<li>Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Drosophila+model+of+nerve+injury+reveals+an+essential+role+of+Nmnat+in+maintaining+axonal+integrity.">A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity.</a> Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J. Cell Biol. 191, 211-223 (2010).</li><li>Leyssen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+promotes+post-developmental+neurite+arborization+in+the+Drosophila+brain.">Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain.</a> EMBO J. 24, 2944-2955 (2005).</li><li>Kato, K., Awasaki, T., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+programmed+cell+death+induces+glial+cell+division+in+the+adult+Drosophila+brain.">Neuronal programmed cell death induces glial cell division in the adult Drosophila brain.</a> Development. 136, 51-59 (2009).</li><li>Ayaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila.">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J. Neurosci. 28, 6010-6021 (2008).</li><li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+bases+of+behavioral+plasticity:+establishing+and+modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+genetic+system.">Cellular bases of behavioral plasticity: establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila genetic system.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li><li>Gomez-Marin, A., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+sensation+during+orientation+behavior+in+the+Drosophila+larva:+more+sense+than+luck.">Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than luck.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 22, 208-215 (2012).</li><li>Schleyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavior-based+circuit+model+of+how+outcome+expectations+organize+learned+behavior+in+larval+Drosophila.">A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila.</a> Learn Mem. 18, 639-653 (2011).</li><li>Brown, H. L., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-285 (2006).</li><li>Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+regenerative+response+to+central+nervous+system+injury+is+enabled+by+pros-notch+and+pros-NFkappaB+feedback.">The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback.</a> PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila protocols. , (2000).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 15050-15055 (2001).</li><li>Verkhusha, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+mutant+of+red+fluorescent+protein+DsRed+for+double+labeling+and+developmental+timer+of+neural+fiber+bundle+formation.">An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation.</a> J. Biol. Chem. 276, 29621-29624 (2001).</li><li>Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+regenerative+response+to+central+nervous+system+injury+is+enabled+by+Pros-Notch+and+Pros-NFkB+feedback.">The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by Pros-Notch and Pros-NFkB feedback.</a> PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7, 27-41 (1998).</li><li>Forero, M. G., Kato, K., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+cell+counting+in+vivo+in+the+larval+nervous+system+of+Drosophila.">Automatic cell counting in vivo in the larval nervous system of Drosophila.</a> J. Microsc. 46, 202-212 (2012).</li><li>Forero, M. G., Pennack, J. A., Learte, A. R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeadEasy+caspase:+automatic+counting+of+apoptotic+cells+in+Drosophila.">DeadEasy caspase: automatic counting of apoptotic cells in Drosophila.</a> PLoS One. 4, e5441 (2009).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141, 536-548 (2010).</li><li>Nicolai, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+dendritic+marker+sheds+light+on+neuronal+connectivity+in+Drosophila.">Genetically encoded dendritic marker sheds light on neuronal connectivity in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20553-20558 (2010).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li></ol>

אין ניגוד האינטרסים הכריז.

הקמנו פרוטוקול לדקירת פגיעה במערכת העצבים המרכזיים תסיסנית הזחל כדי לחקור את התגובות התאיות לניזקים, תיקון והתחדשות. VNCs זחל הם גזורים ונדקר, לאחר שהם צולמו עם מיקרוסקופיה זמן לשגות או קבועים לimmunostaining פלואורסצנטי לדמיין גליה ונוירונים, אפופטוזיס או חלוקת תא. ההתקדמות של הנגע לאורך זמן ניתן למדוד. שיטה זו מלווית בתוכנה שפותחה בכוונה לניתוח הכמותי וסטטיסטי של שינויי מספר תא על פגיעה, ובמהלך התיקון. אנחנו נדקרנו זחלי 96-AEL שעה (ואלה היו קבועים או אפשרו לפתח עוד יותר), שלב התפתחותי לפני המעבר לגולם ולאחר מכן לטוס למבוגרים. בגיל 96 שעות, VNCs גדול מספיק לדקירה, הם באמצע שלב instar השלישי, ולכן לא מבצע התגלמות עדיין; ומערכת העצבים היא כבר מלא פונקציונלית דומה לזה של המודעהult. זה עשוי להיות אפשרי לדקור מעט מאוחר יותר בזחלים והתזמון המדויק יש לבחור כדי להתאים לשאלת המחקר. עם זאת, בהתאם לשאלות המופנות, זה בדרך כלל יהיה צורך לתרבות את VNCs במשך זמן מה כדי לבחון את התגובות התאיות לפציעה. זמן מה לאחר 120 התחלות התגלמות AEL HR, תקופה שבה מערכת העצבים המרכזיים היא שופצה ולכן הוא נמנע טוב ביותר. לכן חלון הזמן לדקירת התרבות בתוספת בזחל הוא די מוגבל. שימוש זחלים עדיין יש יתרון טכני רב על שימוש במבוגרים: בעוד, בדומה למבוגרים, מערכת העצבים הוא כבר מתפקד במלואה, ניתוח התגובה לפציעתו קלה ומהיר יותר במידה ניכרת בזחלים. כאשר משווים את הגודל והמורפולוגיה של המוח וVNCs הגזורים ותרבית בצלחת לVNCs שנתחו בנקודה זהה כעבור זמן בלי culturing בצלחת, נראה כי ההתפתחות היא איטית יותר בתרבות מאשר בגוף חי. במובנים אחרים,הפיתוח ממשיך בדרך כלל בתרבות, יושרת רקמה נשמרה ותאי חיים מראים תגובות אפשריות. התרחבות פצע, תיקון neuropile וריבוי גליה להתבצע בתוך 22 שעתי הודעת דקירה-. זה מראה כי תגובות תאיות לניזקים תתקיימנה בתרבות, ויש סיכוי טוב ביותר לא צריך לשמור את explants ליותר מיום אחד. אם תרבות טווח ארוך יותר הייתה רצויה, הפרוטוקול עשוי לדרוש אופטימיזציה כגון באמצעות הוספת צלחת תרבות 5 נוספת. חשוב לזהות דגימות באיכות טובה מאלה המנוונים. אופטימיזציה של פרוטוקול זה לוקח קצת מיומנות ובהכרח התנוונות תתרחש בדגימות מסוימות. VNC יכול לרכוש מראה &#39;כרובית&#39; שמשקף את ההתמוטטות של שלמות רקמות (איור 5 ב). ניוון גם מוכר על ידי vacuolization של VNC באופן עצמאי מדקירה, שיכול להיות נוכח בדגימות שאינן שלמות, נדקרו-(איור 5 ג </strאונג&gt;). דגימות אלה חייבות להיות מושלכות. הניוון נגרם ככל הנראה על ידי נתיחה גסה, שיכול לקרוע את עצבים ואת שכבת המגן של גליה פני שטח. טיפול כך גדול יש לנקוט כדי לנתח בעדינות. גורמים המשפיעים אחרים כוללים התרבות הבינונית, אשר חייב להישמר נקי ועם אנטיביוטיקה, הקפדה על הכביסות ותזמונים כמפורט בפרוטוקול. לבסוף, אורכו של מחזיק המחט ומחט, הגודל והחדות של המחט הם חשובים מאוד. בעל המחט יכול לזהם את התרבות הבינונית ומחט קהה יכולה לגרום פגיעה גדולה שלא יכול לתקן את עצמו ויביא לניוון. חשוב באופן שגרתי כדי לשמור את המחט חדה. בפרוטוקול זה, לקח את היתרון של קו מלכודת חלבון של זבובים לדמיין neuropile במקביל להדמיה של תהליכי גליה באמצעות המערכת המסורתית GAL4-כטב&quot;מ. כלים אלו יכולים גם להיות משולבים עם מערכות ביטוי בינאריות אחרות כגון LeXA 19 ו 20 ש-מערכת, אשר אינם תלויים בGAL4. הדבר יאפשר הניתוח של אינטראקציות, למשל, בין אקסונים ותהליכי גליה, בתגובה לפציעה. על ידי שילוב אותו עוד יותר עם ​​כלים גנטיים אחרים כגון כתבים לדנדריטים 21 או זרם סידן 22, שיטה זו מספקת הזדמנות מצוינת לנתח את הביולוגיה של התא מאחורי תגובת פציעתם של תאי גליה, אקסונים ודנדריטים עצביים במערכת העצבים המרכזיים. לבסוף, שיטה זו יכולה להיות משולבת עם גנטיקה רגילה, מוטציות וביטוי יתר של גנים, כדי לבדוק את תפקוד גן בתגובה לפציעה והתחדשות. פרוטוקול זה הוביל בהצלחה לגילוי של רשת גנים שבבסיס תגובת גליה משובים לפגיעה במערכת עצבים מרכזיים 11. בהתחשב השימור האבולוציוני של תפקוד גן, נפרם האירועים הללו סלולריים ופונקציות גן בפרותי זבובים עשוי לספק תובנה משמעותיות להבנה של maCNS mmalian תגובה לפציעה והתחדשות.

התחדשות בחיות מגלה כי תאים לחוש כאשר צמיחת האורגניזם הוא הורה ושלם, וכיצד מבני שלמות האורגניזם מושג ומתוחזק. הבנת היכולות המסתוריות של תאים היא עניין רב בביולוגיה. קידום התחדשות הוא אחד מהיעדים המרכזיים לרפואת מדעי המוח. בבני אדם, מערכת העצבים המרכזית הפגועה (מערכת עצבים מרכזיים) אינה מתחדשת. מכרסמים של פגיעה בחוט שדרה משמשים להבין כיצד תאים מגיבים לפציעה. עם זאת, שיקולים אתיים, עלויות גבוהות ומחזור החיים של בעלי החיים האיטי להגביל התקדמות. זבוב פרות דרוזופילה היא אורגניזם מודל שימוש נרחב בביולוגיה התפתחותית ומדעי המוח. תודה לכלים רבים עצמה הגנטיים ומחזור חיים קצר, דרוזופילה הובילה חוזרת ונשנתה לגילוי פונקציות גנים ורשתות גנים עם רלוונטיות להבנה של בני אדם ומחלות. יש ראיות רבות לקון אבולוציוניתservation של תפקוד גן מזבובים ובני האדם. בשנים האחרונות, כמה פרדיגמות בגין ניזקי מערכת עצבים הוקמו בדרוזופילה. חלק מורכב של פגיעה בעצבים היקפיים שרצים לאורך הכנף או axotomy של עצבים היקפיים, כולל 1 חושי והמוטוריים אקסונים 2. עם זאת, במערכת העצבים ההיקפית ומרכזית שונות במובנים רבים, וזה ידוע שבעלי חיים רבים במערכת העצבים ההיקפית יכולה להתחדש ואילו מערכת העצבים המרכזיים לא יכולה. לכן, כדי להבין את התחדשות מערכת עצבים מרכזיים, פגיעה ישירה למערכת העצבים המרכזיים הוא יותר מתאים. פציעת דקירה במחט כבר מיושם בהצלחה במוח הבוגר תסיסנית לחקור תגובה לפציעת 3,4. שימוש בגישה אחרת, Ayaz et al. האקסונים במערכת עצבים מרכזיים כרותים במוחות בוגרי תרבית עם Piezo הכח microdissector, ונתחו התחדשותם במשך 4 ימים 5. היתרון של אלה u הסט מאוחר יותר הניסיונינ.ב. הוא שהם מתמקדים במוח, שהוא ללא ספק עניין רב. החסרון הוא שהמוח הוא הרבה יותר מורכב מVNC, שעוסק אך ורק עם מנוע ובקרה חושית. עובד על המוח המבוגר הוא גם זמן רב יותר. הזחל מוכן לניסויים ב4 ימים, בעוד שזה לוקח בערך 10 ימים לeclosion המבוגר, ולאחר מכן 5 ימים נוספים להבשלה שלהם. המוח המבוגר הוא גם קשה יותר לטיפול, משום שהוא מגולם בציפורן עבה, שקשה להסיר. VNC יש אטרקציה הנוספת של להיות פונקציונלי שווה חוליות עמוד השדרה. זחל תסיסנית נעשה שימוש נרחב כאורגניזם מודל למדעי המוח 6-9. למרות שרשמית הוא הזחל בשלב התפתחותי, זה יכול להיות גם נחשב חיה מתפקדת במלואה. הזחל יש חושים, תנועה מרובים כולל olfaction, טעם וnociception, ולמידה וזיכרון. לפיכך, הזחל VNC wכנבחר כמודל האידיאלי לפגיעה במערכת עצבים מרכזיים. VNCs זחל וגלמים ניתן גזור ותרבית בצלחת, עדיין שמור על יושרה סלולרית לתקופה של עד 24 שעות 10. זה הציע כי פגיעה יכולה להיות מיושמת על VNC, שאז יכול להיות מוקלט בזמן לשגות במשך פרק זמן זה, או בתרבית וקבועה בכל נקודת זמן רצוי בתוך תקופה זו. כאן, אנו מציגים פרדיגמה ניסויית לפגיעה במערכת עצבים מרכזיים באמצעות רימות דרוזופילה VNC. VNC היא גזורה ראשונה מהזחל, ופציעת דקירה מיושמת באופן ידני עם מחט טונגסטן. VNC מניח בcoverslip זכוכית תחתונה, וצולם בליזר זמן לשגות מיקרוסקופיית confocal. לחלופין, את יכול להיות מתורבת VNCs לתקופה רצויה של זמן, ואת ההשפעות הסלולר של פציעה ניתן לנתח בדגימות קבועות באמצעות immunostaining ומיקרוסקופיה confocal. אזור הפצע ניתן למדוד, וניתוח כמותי של תא נוmber (שגשוג תאים ומות תאים) יכול להתבצע בתוכנה שפותחה בכוונה. מדגמים גדולים ניתן לטפל בקלות, וכתוצאה מכך תוצאות תוקף סטטיסטי. שיטות אלו היו משולבות בהצלחה עם הגנטיקה החזקה של דרוזופילה לגלות רשת גנים שבבסיס תגובת משובי גלייה לפציעת מערכת עצבים מרכזיים 11.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> הכתמת בלוק </td><td> מיקרוסקופ ברונל </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מלקחי מס &#39;5 </td><td> כלי מדע פיין למשל </td><td> למשל 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> מחט טונגסטן: קוטר מוט, 0.5 מ&quot;מ; גודל טיפ, מיקרומטר 1; אורך, 2 אינץ </td><td> מכשיר כירורגי Roboz </td><td> RS-6065 </td><td></td></tr><tr><td> בעל מחט </td><td> מכשיר כירורגי Roboz </td><td> RS-6060 </td><td></td></tr><tr><td> Arkansans אבנים: ערכת תיקון לדומונט מלקחיים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 29000-00 </td><td></td></tr><tr><td> 35 מ&quot;מ צלחת פטרי עם בסיס זכוכית מ&quot;מ 27 </td><td> Iwaki </td><td> 3930-035 </td><td></td></tr><tr><td> יקה מיקרוסקופ ההפוך SP2-AOBS confocal עם קאמרי סביבה </td><td> ליקה </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> מגיב </td></tr><tr><td> חומה וסאנג M3 חרקים בינוניים (ecdysone חינם) </td><td> סיגמא </td><td> S3652-500 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין וסטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט נאגר מלוח (PBS) </td><td> ראה 12 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> סיגמא </td><td> F7524 </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-מסן </td><td> סיגמא </td><td> P1399-25mg </td><td></td></tr><tr><td> פורמלדהיד, 10%, מתנול חופשי, טהור Ultra </td><td> Polysciences </td><td> 04018-1 </td><td></tד&gt; </tr><tr><td> נוגדני synthetase אנטי גלוטמין עכבר </td><td> Millipore </td><td> MAB302 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדנים נגד ארנב GFP </td><td> טכנולוגיות חיים </td><td> A11122 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדני עכבר נגד ריפו </td><td> מחקר מבוסס היברידומה בנק </td><td> 8D12 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדני Rat אנטי ELAV </td><td> מחקר מבוסס היברידומה בנק </td><td> 7E8A10 </td><td></td></tr><tr><td> ארנב 3 נוגדני caspase נגד פעילים </td><td> Abcam </td><td> ab13847 </td><td></td></tr><tr><td> סרום עיזים רגיל </td><td> מעבדות וקטור </td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> נגד ארנב Alexa פלואוריד 488 </td><td> טכנולוגיות חיים </td><td> A11034 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכבר Alexa פלואוריד 647 </td><tד&gt; חי טכנולוגיות </td><td> A21236 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכברוש Alexa פלואוריד 647 </td><td> טכנולוגיות חיים </td><td> A21247 </td><td></td></tr></tbody></table>

an injury paradigm to investigate central nervous system repair in drosophila

שיטה ניסיונית פותחה כדי לחקור את התגובות התאיות למערכת עצבים מרכזיות (CNS) באמצעות פגיעת זבוב פרות דרוזופילה. תיקון הבנה והתחדשות בבעלי חיים הוא שאלת מפתח בביולוגיה. מערכת העצבים מרכזיים האדם שנפגעה אינה מתחדשת, וההבנה כיצד לקדם ההתחדשות היא האחת מטרות העיקריות של רפואת מדעי המוח. ערכת כלים הגנטית הרבה העצמה של דרוזופילה ניתן להשתמש כדי להתמודד עם הבעיה של התחדשות מערכת עצבים מרכזיים. נגע לצינור עצבי גחון CNS (VNC, שווה ערך לחוט שדרת חוליות) מיושם באופן ידני עם מחט טונגסטן. VNC לאחר מכן ניתן יהיה צולם בזמן לשגות באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת ליזר של עד 24 שעות לעקוב אחר התפתחותו של הנגע לאורך זמן. לחלופין, הוא יכול להיות מתורבת, אז קובע ונצבע באמצעות immunofluorescence לדמיין נוירון ותאי גליה עם מיקרוסקופיה confocal. שימוש בסמנים מתאימים, צ&#39;הnges במורפולוגיה של תא ותא המדינה כתוצאה מפציעה יכולה להיות חזותי. עם ImageJ ובכוונה פתח תוספות, ניתוחים כמותיים וסטטיסטיים יכולים להתבצע כדי למדוד שינויים בגודל פצע לאורך זמן ואת ההשפעות של פגיעה בתרבות של תאים ומוות של תאים. שיטות אלו מאפשרות ניתוח של מדגמים גדולים. הם יכולים להיות משולבים עם הגנטיקה החזקה של דרוזופילה לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התחדשות ותיקון מערכת עצבים מרכזיים.

כאן אנו מראים כיצד לבצע את פציעת דקירת תסיסנית זחל VNC ולנתח את התגובות התאיות לפגיעה באמצעות זמן לשגות וimmunostaining מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. לנתוני זמן לשגות, הנגע מיוצג כאזור GFP שלילי בתוך neuropile דגימות הנושאות את סמן axonal G9 (איור 2). זמן קצר לאחר דקירת GFP שליליים, קטן אזורים, שנראה כמו חורים או vacuoles, מתחיל להופיע (איור 2 א). תחומים כגון GFP שליליים בדרך כלל להגדיל עד כ 6-8 שעות לאחר הדקירה (איור 2 א). כתוצאה מכך, אזורי GFP השליליים יתכווצו ואולי אפילו ייעלמו (איור 2 ב &#39;). ב 22 שעות לאחר הדקירה, השטח שנכבש על ידי הפצע הוא בדרך כלל קטן יותר מהשטח המרבי היה ב6-8 שעות לאחר הדקירה (איורים 2 א, ב). בדומה לאזור DsRed השלילי בתהליכי גליה תחילה מגביר מדי, אבל shrinks ב 22 שעות לאחר הדקירה. מעניין, לעתים תהליכי גליה DsRed חיוביים למלא את חורי GFP-השליליים בneuropile לפני היעלמותם (האיור 2C). שימוש בדגימות immunostaining קבועים, תהליכי גליה עדינים ותגובתם לפציעה יכול להיות דמיין עם רזולוציה טובה יותר מאשר בתמונות זמן לשגות. ניתן לעשות זאת, למשל, באמצעות מנהל ההתקן של גליה repoGAL4 לגרום לביטוי של כתב קשור קרום (למשל כטב&quot;מ-mCD8GFP) בזבובים כדי לחזות את כל תאי גליה (למעט גליה קו האמצע). זה יכול גם להיות משולב עם סמני גליה אחרים, כגון אנטי GS2, שמתייג תאי גליה neuropile הקשורים (3A מספרים, ב &#39;). כאן אנו מראים כי למרות שצינור עצבי הגחון הוא נדקר מהצד הגבה, דקירת תוצאות פציעה בשקע ventrally (3A דמות, ראשי חץ). דקירה כנראה משפיעה על תאי גלייה ה neuropile וneuropile הקשורים בצורה חמורה יותרמשטח ותאים בקליפת מוח גליה (איור 3 ב &#39;). תהליכי גליה נראים לא מאורגנים בneuropile, בעוד שהם עדיין לשמור על הרשת שלהם כמו ארגון בקליפת המוח. תוצאות פגיעה בפסולת GS2 חיובית סלולרית, והוא שונה מתאים נורמלים כמו שברי פסולת הן הרבה יותר קטנות ולא מחוברות לגוף תא. זה חושף את הניזק לתאי גלייה neuropile הקשורים (איור 3 ב &#39;). תאי גליה המתנוונת neuropile הקשורים גם נצפו על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים 15. אנטי בקע-caspase 3 + מכתים אפופטוזיס נצפה בתאי neuropile הקשורים גליה 15, מראה שהם עוברים אפופטוזיס על דקירת פציעה. תאי גליה Neuropile קשורים הוצגו גם phagocytose פסולת עצבית 15, וGS2 + אות עשויה גם לחשוף את הבליעה של תאי עצב בתהליכים אפופטוטיים גליה. תאים בקעו-caspase + אפופטוטיים גם נצפים בקליפה, לפחות חלק מהם מתאימים לElav + נוירונים ( <strאונג&gt; האיור 3C). באמצעות דגימות קבועות וimmunostaining גם מאפשר ניתוחים כמותיים של תגובות תאיות לפגיעה, כגון אפקטים בהתפשטות ואפופטוזיס. לשם כך, אנו בכוונה פתחנו שתי ImageJ תוספות, זחל caspase DeadEasy וגליה DeadEasy, כדי לספור את מספר תאי גליה ותאים אפופטוטיים באופן אוטומטי, בהתאמה. הם אומתו לעבוד על VNCs זחל ומאוד מדויקים. באמצעות אלה, ניתן לצפות לעלייה במספר תאי גליה ריפה חיוביים שנגרמו על ידי פציעת דקירה, ב 22 שעות (תרשים 4 א) 15. יש גם עלייה במספר התאים אפופטוטיים אנטי בקעו-caspase-3 של 6 שעות לאחר הדקירה-(איור 4B) 15. עלייה כזו בהתרבות ואפופטוזיס גליה בתגובה לפציעה במערכת העצבים מרכזיים תסיסנית היא מזכירה גם את תגובת פגיעה במערכת עצבים המרכזיים של בעלי החוליות. היבט חיוני של זה הפרtocol היא האיכות של נתיחות VNC. קשה לומר בזמן הנתיחה אם VNCs ניזוקו או לא בתהליך. חשוב לטפל בפרט לבצע ניתוחים עדינים. עם זאת, דגימות באיכות גרועה בהכרח להיות מיוצרות, וזה הכרחי כי אלה מזוהים בשלבים מאוחר יותר ומושלך. בידות שלנו, ניוון VNC נראה שאינם קשור לפציעה, אבל במקום שנגרם על ידי נתיחה מחוספסת. יש לנו לא נצפו גודל קריטי בפצע פציעה, ואנחנו מנתחים את כל דגימות פצועים שאינם מושפלים. כאשר VNCs לשמור על שלמותם, משטח VNC נוטה להיראות חלק ומבריק, ואין חורים בneuropile הם נצפו (5A איור). שפלה של VNCs יכולה להיות מוכרת על ידי נתיחה שלאחר 24 שעות מהמשטח המחוספס של אזורי הגחון ורוחב VNC (5B איור). שפלה של neuropile שאינם הקשור לפציעת דקירה יכולה להתרחש גם, והכרה בו כneuropile holes באות הרקע של דגימות immunostained. דגימות עם אלו סימנים של התנוונות חייבות להיות מושלכות (איור 5 ג). בידות שלנו, שיעור ההצלחה לנתיחה ופגיעה בשליטה שלמה ודקרה (י.ו.) זבובים הם גם סביב 70%. שיעור זה עשוי להשתנות עם המיומנות של האדם שבצע את הניסויים, ועם גנוטיפ. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig1.jpg" /> איור 1. ציור סכמטי של זחל בימוי ודקירת פציעה. (א) ביום 0, זבובים מותרים להטיל ביצים בצלחת פטרי מיץ ענבים ל3 שעות. ביום 1, זחלי instar 1 בקעו (L1) נאספים והניחו בבקבוקונים המכילים מזון שמרים סטנדרטי, שבו הם נשמרים למשך 3 ימים נוספים. ביום 4, זחלים נאספים מבקבוקון מזון, ומשמשים לניסויי הדקירה. (B) נוף צדדי של מערכת העצבים מרכזי הזחל.אזור הבטן של חוט עצב הגחון הוא נדקר במחט מהצד הגבה. קדמי הוא בצד השמאל, ואחורי בצד ימין. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig2.jpg" /> איור 2. התקדמות זמן לשגות של נגע VNC. מיקרוסקופיה confocal על VNCs לחיות עם האקסונים-GFP שכותרת-ותאי גלייה DsRed כותרת-. גנוטיפ:. UASDsRed / +; G9 / +; repoGAL4 / + () הנגע הוא מוכר על ידי העדר פלואורסצנטי על neuropile אקסונלית. לאחר הדקירה, החורים GFP-שליליים מופיעים, לאחר מכן הולכים וגדלו בגודל ובמספר. התחזיות של 5 חלקים אופטיים מכל נקודת זמן לאחר שדקר פציעה. (ב) מתכווצות axonal neuropile הנגעים מ 9 שעות לאחר הדקירה. תמונות אלה הן סעיפים אופטיים בודדים מנקודתי זמן שונות לאחר שדקר פציעה. כדי לזהות תפקידים מקבילים בכל מדגם, ואותו מספר פרוסה מeaנקודת זמן הפרק בערימה של נתוני זמן לשגות נבחרה. על ידי השוואה בין הדפוסים דמיינו בG9 וrepoGAL4&gt; UASmCD8GFP באזור אינו מושפע מהדקירה, את הפרוסות אומתו כמתפקידים מקבילים בציר Z. קווים מקווקווים ב( A, B) מצביעים על היתרון של הפצע. (ג) גדלה גבוהה מפצעיו בneuropile. חורי GFP שליליים היו מלאים בתהליכי גליה DsRed חיוביים, ולאחר מכן נעלמו (ראשי חץ). נוף אופקי. עד קדמי. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig3.jpg" /> איור 3. אפיון תאי של נגע VNC. VNCs נושאות כתב GFP קרום קשור לכל תאי גליה (למעט גליה קו אמצע) מוכתמים אנטי GFP ואנטי GS2, סמן תא גלייה neuropile-משויך. גנוטיפ:. + / +; UASmCD8GFP / +; repoGAL4 / + () VNCs נדקרו מהדורצד סאל, אבל זה גורם שקע ventrally (ראשי חץ). השקפת sagittal של חלקים אופטיים בודדים, שמאל הגבה וקדמי. (A, B) דקירת פציעה משפיעה על תאי גלייה בצורה חמורה יותר neuropile הקשורים מאשר תאים בקליפת מוח ומשטח גליה. תוצאות פגיעה בפסולת סלולרית GS2 החיובית (ראשי חץ בבוקר). (B) נוף אופקי של חלקים אופטיים בודדים, עד קדמי. ראשי חץ מצביעים על GS2 + פסולת תא. (C) Colocalisation של סמן אפופטוטיים אנטי בקע-caspase-3 וסמן העצבי אנטי Elav מראה כי עם פציעת חלק מהתאים המתים בקליפת המוח הוא תאי עצב. נ.פ., neuropile; CX, קליפה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig4.jpg" /> איור 4. ספירה אוטומטית של תאי גליה ותאים אפופטוטיים באמצעות DeadEasy. () דוגמה לשימוש &#39;גליה DeadEasy זחל&#39; לספור ריפיתי חיוביתתאי גליה. משמאל: חצאים VNC גחון מגואלים בנוגדנים נגד ריפו; ביניים: פלט מגליה הזחל DeadEasy מראה תאים שזוהו על ידי תוספת; נכון: מיזוג. מספרים על הזכות הם מספר התאים ריפו חיוביים שנספרו באופן אוטומטי בכל ערימה של חלקי confocal אופטיים בכ 30 שניות. מספר גדל גליה בVNCs נדקר. (ב &#39;) הדוגמא לשימוש&#39; זחל caspase DeadEasy &#39;. תחזיות של 5 חלקים confocal אופטיים מוכתמים עם 3 נוגדנים כנגד בקע-caspase; ביניים:: Left פלט מראה תאים שזוהו על ידי תוספת; נכונות: מיזוג. מספרים על הזכות הם מספר התאים caspase-חיוביים שנספרו באופן אוטומטי בכל ערימה של חלקי confocal אופטיים בכ 30 שניות. מספר התאים אפופטוטיים מגדיל בVNC נדקר. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig5.jpg" /> איור 5. דוגמאות לdegeneratיון. () VNC בריא. אין כל סימנים של התנוונות. (ב) הצד של בית החזה מתנוונת (ראשי חץ) בדגימה נדקרה. כוכבית מציינת אתר נגע. (C) חורים בneuropile החזי (ראש החץ לבן) והקליפה (כתום ראש החץ) בVNC לא דקר. דגימות עם vacuolization neuropile והנרחב פגומים שצריכים להיות מושלכות. הנה VNCs הוכתם נגד איבוני סמן גליה neuropile המשויך. נוף אופקי, עד קדמי.

Watch this Scientific Journal Video about An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila at JoVE.com

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

הפרדיגמה פציעה באמצעות כבל עצב גחון תסיסנית הזחל לחקור התחדשות במערכת עצבים מרכזיות ותיקון מתואר. דקירה ואחרי סריקת הליזר מיקרוסקופיה confocal בדגימות זמן לשגות וקבועים, בשילוב עם ניתוח הכמותי עם תוכנה שפותחה בתכליתיות וגנטיקה, משמשת כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של התחדשות ותיקון מערכת עצבים מרכזיים.

פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב<em&gt; דרוזופילה</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

an-injury-paradigm-to-investigate-central-nervous-system-repair

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

13.2K Views.  University of Birmingham. הפרדיגמה פציעה באמצעות כבל עצב גחון תסיסנית הזחל לחקור התחדשות במערכת עצבים מרכזיות ותיקון מתואר. דקירה ואחרי סריקת הליזר מיקרוסקופיה confocal בדגימות זמן לשגות וקבועים, בשילוב עם ניתוח הכמותי עם תוכנה שפותחה בתכליתיות וגנטיקה, משמשת כדי לחקור את המנגנונים המולקו...

Video: An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

אנטומיה השראה תלת מימדי מיקרו רקמות מתוכנן רשתות עצביות עבור שחזור מערכת העצבים, אפנון, דוגמנות

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Quantifying Acute Changes in Renal Sympathetic Nerve Activity in Response to Central Nervous System Manipulations in Anesthetized Rats

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are limited resources directing scientists in the techniques for measuring and analyzing these variables. This protocol describes the methods for measuring RSNA and mean arterial pressure in anesthetized rats. The protocol also includes the approaches for accessing the brain during RSNA recordings for central nervous system (CNS) manipulations. The RSNA recording technique is compatible with pharmacologic, optogenetic, or electrical stimulation of the CNS. The approach is useful when an investigator will measure short-term (min to h) autonomic responses in non-survival experiments to correlate anatomically with CNS nuclei. The approach is not intended to be used to obtain chronic (survival) recordings of RSNA in rats. Discharges in RSNA, averaged rectified RSNA, and mean arterial pressure can be quantified and analyzed further using parametric statistical tests. Methods for obtaining venous access, recording mean arterial pressure telemetrically, and brain fixation for future histological analysis are also described in the article.

Methods for measuring sympathetic and cardiovascular responses to central nervous system (CNS) manipulations are important for advancing neuroscience. This protocol was developed to assist scientists with measuring and quantifying acute changes in renal sympathetic nerve activity (RSNA) in anesthetized rats (non-survival).

לכימות שינויים חריפה בפעילות העצבים הסימפתטית כליות בתגובה מניפולציות במערכת העצבים המרכזית בחולדות מורדם

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are ...