Damos las gracias a Mei Ann Lim para la lectura crítica del manuscrito y otros miembros de nuestro laboratorio para sus debates a lo largo del curso de este trabajo. Este trabajo fue financiado por la Fundación Científica Yamada y Royal Society Becas corta visita y la Unión Europea Marie Curie Fellowship GRR Internacional Entrante a KK, y BBSRC Proyecto Grant (BB/H002278/1) y Wellcome Trust Equipo Grant (073228/Z/03/Z) a AH

1. Recolección de larvas por etapas <ol><li> Lugar 15 mujeres y 15 moscas adultas macho en una jaula cilíndrica de metacrilato para poner los huevos en un plato de Petri con agar y jugo de uva complementado con una pequeña cucharada de levadura de pasta durante 3 horas a 25 ° C. Cambie la placa de 3-4 veces al día, y descartar la primera placa (es decir, de la O / N huevo-lay). Deseche también las placas desde el primer día. Desde el segundo día, mantener las placas con los huevos a 25 ° C. Después de 7 días de recolección de huevos, comience con un nuevo montaje de moscas de los padres. </li><li> Después de aproximadamente 24 horas, larvas eclosionan de los huevos. Al conectar las larvas con una brocha o más delgado con un par de pinzas, transferir 35 larvas del agar de uva a un vial que contiene alimentos mosca estándar (10 ml) (Figura 1A). </li><li> Mantener los viales que contienen las larvas durante 3 días (96 horas después de la puesta de huevos, AEL) a 25 ° C. </li></ol> 2. Disección de larvas cordones nerviosos ventrales de Cultura <ol><li> Limpie sernch y manos con 70% de etanol. Remojar 4 bloques de tinción, 2 pares de pinzas y una aguja con 70% de etanol, y dejar secar al aire. </li><li> Preparar a 4 cuadras de tinción con los siguientes medios: uno con agua destilada (DW) para limpiar y para las larvas de la piscina limpia, una segunda con 2 ml de Escudo y Sang medio M3 insecto con 1% de penicilina y estreptomicina, Ecdysone gratuito (M3 PS medio) para diseccionar las larvas, y una tercera con 2 ml de medio M3 PS a la piscina disecados cordones nerviosos ventrales (VNCs), y un cuarto con 2 ml de medio M3 PS para apuñalar a los VNCs. Todos los reactivos deben ser pre-calentó a TA. </li><li> Añadir agua al vial que contiene 96 h AEL larvas. Después, usando una espátula, se extendió suavemente alimentos con larvas del vial sobre una toalla de papel húmeda. Transferir 10 larvas a un bloque de tinción que contiene DW para lavar los alimentos. Reemplace DW 6 veces. Luego reemplazar con M3 medio PS. </li><li> Transferir una de las larvas a un bloque de tinción que contiene 2 ml de medio M3 PS. </li><li> Bajo un microscopio de disección, dissect un cerebro de larvas cuidadosamente usando métodos estándar 12, pero para minimizar el daño tisular, tener especial cuidado al proceder de la siguiente manera. Coloque el lado dorsal larva, y mantenga el lado dorsal en un tercio desde el extremo anterior con 2 pares de pinzas (una en cada mano). Mientras sostiene la sección anterior, alejarse del extremo posterior con las pinzas, y rasgar la epidermis. El cerebro y la VNC debe ser visible desde el borde posterior de la mitad anterior. Cuidadosamente aislar el cerebro y complejo VNC mediante la eliminación de la grasa corporal intestino, y la epidermis. Cuando los VNCs se dañan demasiado, los VNCs degenerará, total o parcialmente, incluso sin lesión punzante. Tome en cuenta los siguientes puntos: </li></ol><ul><li> No tirar o romper los discos imaginales y los nervios periféricos del tórax VNC ya que podría dañar el VNC. Para cortar los nervios periféricos, mantenga los nervios periféricos con dos pares de pinzas colocados cerca uno del otro, y luego tire de los nervios con el deceps. Discos imaginales y piezas bucales se puede dejar conectado al VNC. </li><li> Deja la glándula anillo y la glándula linfática adherida al cerebro. </li><li> Cortar el intestino en el punto más cercano al cerebro, donde se contiene alimentos no mucho. </li></ul><ol start="6"><li> Mediante el uso de un Pipetman P20 con la punta cortada y se abrieron un poco, transfiera el VNC a un bloque que contiene manchas frescas M3 medio PS. Antes de transferir el VNC, primero pipeta arriba y abajo de sólo el medio utilizado para la disección a fin de evitar la VNC se pegue a la punta. </li></ol> 3. Stabbing Lesión en el VNC larvas de Drosophila En esta sección se describe cómo realizar lesión punzante a los VNCs y preparar apuñalado-VNCs para realizar un análisis cronológico y inmunoticción. Punzantes Post-condiciones de cultivo y la duración se describen en la sección 5 (para realizar un análisis cronológico) y en la sección 6 (para inmunoticción). <ol><li> Después de reunir suficientes VNCs (4-5 para time-lapsey más del 24 por inmunoticción), la transferencia de un VNC a un bloque de tinción limpia que contenga M3 PS. </li><li> Oriente el VNC para que el neuropile dorsal está a la vista bajo el microscopio de disección (Figura 1B). Esta es la orientación más natural para VNCs para tumbarse en cuando está unido a los lóbulos ópticos. </li><li> Puñalada manualmente utilizando una aguja de tungsteno bajo el microscopio de disección, desde el lado dorsal prácticamente en ángulo recto y el objetivo para el medio abdominal de la VNC (Figura 1B). </li></ol> Tome una atención particular a lo siguiente: <ul><li> Puñalada sólo una vez. </li><li> Puñalada hasta que la aguja toca el fondo de la copa. Sin embargo, tenga cuidado de no dañar la punta de la aguja. </li><li> El vástago del soporte de la aguja no debe tocar el medio durante punzante. </li><li> La herida no es visible bajo el microscopio de disección. </li></ul> Nota: Puñalada degeneración de la lesión no relacionada El procedimientopuede resultar en la degeneración celular dentro de la VNC distinta de la lesión punzante. La degeneración en los agujeros en la neuropile, y de vez en cuando los agujeros se han observado en la corteza de los especímenes no apuñalados. Las muestras con degeneración que afecta a la degeneración neuropile o extendida que afecta también la superficie VNC debe ser desechado. La degeneración puede ser identificado de la siguiente manera: <ul><li> Superficie de fricción, especialmente en el área lateral / ventral del tórax, a las 22 h de la puñalada. En casos extremos, la VNC se ve que sobresale. </li><li> Los agujeros o vacuolas en la neuropile torácica, que puede ser visible como agujeros en la señal de fondo con inmunotinción de fluorescencia. </li></ul> 4. Mantenimiento de la Aguja y Pinzas <ul><li> Rutinariamente comprobar si la punta de la aguja es lo suficientemente nítida. La punta de la aguja puede ser doblada o poco afilada después de usarlo durante varios experimentos. En este caso, afilar la punta usando una piedra de Arkansas o equivalente. </li><li> Las puntas de las pinzas debecumplir perfectamente. Las puntas pueden dañarse con el uso. En este caso, ajuste la punta con una piedra de Arkansas o equivalente. </li></ul> 5. Cultura y time-lapse de grabación de VNCs apuñalado Para visualizar la neuropile axonal en el VNC vivo, una proteína GFP línea de trampas que etiqueta todos los axones G9 - 13 - pueden ser utilizados, y para visualizar todas las células gliales (excepto la glía línea media) el controlador glial repoGAL4 se puede utilizar para expresar la UASdsRed S197Y 14 reportero. Al cruce G9 vuela a UASdsRedS197Y;; repoGAL4 moscas, larvas de VNCs progenie se obtienen con los axones y células gliales rojo verde que se pueden grabar en el tejido vivo. <ol><li> Después de la puesta en común VNCs 4-5, transferencia 1 VNC a un bloque de tinción limpia que contenga 2 ml de M3 PS, y apuñalar a la media abdominal of the VNC como se indica en la sección 3. </li><li> Transferir la apuñaló VNC a un poli-L-lisina recubierto de 3,5 mm de vidrio plato de fondo Petri que contiene 1 ml de M3PS. Coloque el lado dorsal VNCs abajo. Empuje suavemente el VNC usando el lado plano de un par de pinzas para que el VNC para pegarse al plato. </li><li> Suavemente añadir 1 ml de FBS M3 PS 15% hace que la concentración final de FBS al 7,5%. </li><li> Adquirir imágenes mediante microscopía confocal de barrido láser. Escanear la VNC, recogiendo una serie Z-sección a lo largo de todo su espesor. Se utilizó un Leica SP2 confocal microscopio invertido con una temperatura ambiental cámara controlada. Cualquier microscopio confocal equivalente debería funcionar, sin embargo, puede requerir la optimización de la configuración de la exploración. Los ajustes para el tiempo de lapso de microscopía confocal fueron las siguientes: Temperatura de la cámara ambiental: 25 ° C; 20X objetivo con 4 veces el zoom; modo de escaneo xyzt, con una resolución de 512x512 píxeles, z = 1 pasos micras y 1 hora-o 2 - intervalos de una hora. </li></ol><ul><li> El microscopio confocal Leica SP2 tiene una limitación de tamaño de archivo de escaneado. Con estos ajustes, 8-9 puntos de tiempo se pueden escanear. Conotros microscopios confocales, que debería ser posible adquirir pilas de imagen para los puntos de tiempo más largos, es decir, en el lapso de hasta 24 horas. </li></ul> 6. Cultura y inmunotinción de VNCs apuñalado y Fijo <ol><li> Preparar una placa de cultivo tisular de 24 pocillos que contiene 500 l de M3 PS 7,5% de FBS por pocillo. </li><li> Repita la disección de más de 24 VNCs para una placa de cultivo tisular de 24 pocillos. </li><li> Mediante el uso de la Pipetman P20 con la punta de corte, transferir 12 VNCs no apuñalados desde la piscina a la placa de cultivo, utilizando un VNC por pocillo. </li><li> Puñalada el resto de VNCs en la piscina como se describe en la sección 3. Transfiera cada VNC apuñaló a un pozo cada uno. </li><li> Colocar el plato 24-bien en la incubadora de 25 ° C para una duración deseada dependiendo del experimento. Integridad celular se altera por lo menos durante 24 hr. </li><li> Después del cultivo, transferir los 12 VNCs en 250 l de PEM formaldehído 4% en un tubo de 1,5 ml mediante el uso de la Pipetman P20 con la punta de corte. Entonces, la fixatiHe sido cuidadosamente con pipeta a cabo, teniendo cuidado de no dañar los VNCs. Una pequeña cantidad de fijador suficiente para cubrir las muestras deben permanecer en cada tubo. A continuación añadir el fijador fresco, y agitar suavemente durante 50 min a RT. </li><li> Enjuague 2 veces con Triton X 0,3% de PBS, y luego lavar 2 veces durante 10 minutos con 0,3% Triton X PBS a TA. </li><li> VNCs bloque por incubación con suero de cabra normal al 10% en 0,3% de Triton X PBS durante 1 hora a TA. Las muestras se pueden almacenar a 4 ° C durante al menos un mes. </li><li> Incubar VNCs con anticuerpos primarios durante más de 20 horas a 4 ° C. </li><li> Enjuague 2 veces con 0,3% Triton X PBS, luego lavar 3 veces durante 10 minutos con 0,3% Triton X PBS a TA. </li><li> Incubar VNCs con anticuerpos secundarios durante más de 16 horas a 4 ° C. </li><li> Enjuague 2 veces con 0,3% Triton X PBS, luego lavar 3 veces durante 10 minutos con 0,3% Triton X PBS en la sala de RT (en la oscuridad si usando anticuerpos secundarios fluorescentes). </li><li> Reemplazar PBS con 50% de glicerol: 50% de PBS durante por lo menos unhoras. </li><li> Luego reemplazar con 80% de glicerol: 20% de PBS durante al menos una hora. </li><li> Montar un VNC en una ventana hecha en 2 capas de cinta de cello (aproximadamente 0,06 mm) sobre un portaobjetos de vidrio microscopía. Ajuste la orientación, y colocar un cubreobjetos (18x18 mm) a través de la ventana. Dos VNCs se puede montar en un portaobjetos utilizando este método. </li></ol> Usando una variedad de anticuerpos primarios, diferentes respuestas celulares a la lesión se puede analizar (por ejemplo, cambios en el número de células y la forma de la célula). 7. Analizar datos usando ImageJ y una serie de Plugins Si el VNC no tiene punzante degeneración no relacionado, la muestra debe ser contado en el análisis, independientemente del tamaño de la lesión. Como punzante se realiza manualmente, el tamaño de la lesión difiere cada vez. Por lo tanto es importante analizar estadísticamente el efecto de apuñalamiento, siempre que sea posible. <ol><li> Heridas medición del tamaño. El tamaño de la herida es un indicador de reparación 15.La lesión punzante es visible como carente de expresión GFP. Área de lesión se puede medir utilizando los datos de lapso software ImageJ libremente disponible, como sigue: <ol><li> Uso ImageJ, abra una pila de imágenes confocal de menú &quot;Archivo&quot;, seleccione &quot;Importar&quot; y desde allí seleccionar &quot;secuencia de imágenes&quot;. Esto a su vez la colección de imágenes individuales en una pila. </li><li> Siguiente cambiar la &quot;pila&quot; en un &quot;HyperStack&quot;, vaya a &quot;Imagen&quot; del menú, seleccione &quot;HyperStack&quot;, luego seleccione &quot;Stack para HyperStack&quot;. </li><li> Ajuste el tamaño de voxel mediante el uso de &quot;Propiedades&quot; del menú &quot;Imagen&quot;. En los datos adquiridos utilizando el microscopio confocal Leica SP2, el tamaño de vóxel se puede obtener a partir de la exploración de software, y desde el archivo de metadatos de texto guardado junto con las imágenes. En nuestro medio, como se describe en la Sección 3, dimensiones en píxeles son XY = 0,366211 m y Z = 0,99709 micras. </li><li> Mediante el examen de todas las rebanadas en un punto de tiempo, dibuja el contorno máximo de la zona de la lesión con la herramienta de polígono de selección en la barra de herramientas. Este es elRegión de interés (ROI). </li><li> Agregue el retorno de la inversión ROI con el gerente, vaya a &quot;Analizar&quot; del menú, desplácese hacia abajo y seleccione &quot;Herramientas&quot;, luego &quot;Administrador de retorno de la inversión&quot;, luego &quot;añadir&quot;. </li><li> Repita este proceso para los todos los puntos de tiempo. </li><li> Haga clic en la &quot;Medida&quot; en el administrador de retorno de la inversión para obtener el tamaño del área de cada ROI. </li></ol></li><li> Corrección de movimiento VNC durante las grabaciones time-lapse. &quot;Stackreg&quot; y &quot;plugins&quot; Turboreg 16 (desde el sitio web ImageJ <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ): estos plugins permiten corregir los movimientos pequeños de la muestra durante el lapso de tiempo. Construir una pila con una sección equivalente óptico representante a través de todos los puntos de tiempo y aplicar los plugins. Esto ayuda a visualizar cómo cambia la lesión con el tiempo. Los detalles sobre estos métodos y el manual de instrucciones están disponibles en el grupo de investigación que ha desarrollado estos plugins. ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/" target="_blank">http://bigwww.epfl.c</a>h / Thevenaz / stackreg /). </li><li> Recuento automático de células gliales. &quot;Glia DeadEasy&quot; plugin ( <a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html</a> ): este fue diseñado para contar el número de REPO-positivas las células gliales en el VNC Drosophila larval y para examinar el cambio en glial número de lesiones causadas por arma blanca 17. El plug-in funciona con precisión, con un error de 0,1% de falsos positivos y falsos negativos 4,3% 17. Para utilizar este plug-in, la primera etiqueta toda la glia (excepto la línea media) en la muestra utilizando inmunofluorescencia con anticuerpos anti-REPO. A continuación, instale el plug-in en ImageJ, abra una pila de imágenes confocal y ejecutar plug-in. Cuenta células gliales automáticamente en unos 30 segundos. </li><li> Recuento automático de células apoptóticas. &quot;Larvas caspasa DeadEasy&quot; plug-in ( <a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.bioscienc</a>es-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Este fue diseñado para contar el número de células marcadas con anti-troceados-Caspase3, y una nueva versión fue adaptado para las VNCs larvales. Stabbing lesión provoca un aumento en la muerte celular programada 11. Para utilizar este plug-in, las células apoptóticas primera etiqueta en la muestra mediante inmunofluorescencia con anti-troceados-caspasa-3 anticuerpos. A continuación, instale el plug-in en ImageJ, abra una pila de imágenes confocal y ejecutar plug-in. Cuenta células apoptóticas automáticamente en unos 30 segundos. </li></ol> 8. Reactivos <ol><li> Medio de cultivo: Shield y Sang medio de insecto M3, 7,5% de suero bovino fetal, 1% de penicilina y estreptomicina al 1%. </li><li> 0,01% de poli-L-lisina en estéril DW. </li><li> Fijador: 4% de formaldehído, Ultra puro en PEM (0,1 TUBOS M, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO 4) solución. </li><li> Solución de bloqueo para la inmunotinción: 10% de suero normal de cabra en 0,3% de Triton X PBS. </li><li> Anti-glutamina sintetasa2 anticuerpos: 1:250 en solución de bloqueo. </li><li> Los anticuerpos anti-GFP: 1:1,000 en solución de bloqueo. </li><li> Anticuerpos anti-REPO: 1:250 en solución de bloqueo. </li><li> Elav anti-anticuerpos: 1:250 en solución de bloqueo. </li><li> Lucha contra exfoliados caspasa 3 anticuerpos: 1:1000 en solución de bloqueo. </li><li> Anticuerpos secundarios: 1:250 en solución de bloqueo. </li></ol>

<ol>
	<li>Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Drosophila+model+of+nerve+injury+reveals+an+essential+role+of+Nmnat+in+maintaining+axonal+integrity.">A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity.</a> Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J. 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No existe conflicto de interés declarado.

Hemos establecido un protocolo para apuñalar lesión en el SNC de Drosophila de larvas para investigar las respuestas celulares a las lesiones, la reparación y la regeneración. VNCs larvas se diseccionaron y apuñalado, tras lo cual se filmó con microscopía de time-lapse o fijada para la inmunotinción de fluorescencia para visualizar la glía y neuronas, la apoptosis o la división celular. La progresión de la lesión con el tiempo se puede medir. Este método está acompañado por el software desarrollado a propósito para el análisis cuantitativo y estadístico de los cambios en el número de células después de la lesión y durante la reparación. Nos apuñaló 96 horas larvas AEL (y estos se fijaron bien o permitido desarrollar otra forma), una etapa de desarrollo antes de la transición a pupa y luego mosca adulta. A las 96 h, VNCs son lo suficientemente grandes para punzante, que están en el medio de tercera etapa instar, y por lo tanto no están sometidos a la pupación todavía, y el sistema nervioso ya es totalmente funcional similar a la de la adULT. Podría ser posible para apuñalar a un poco más tarde en las larvas y el momento preciso debe ser elegido para satisfacer la pregunta de investigación. Sin embargo, en función de las preguntas planteadas, generalmente será necesario cultivar los VNCs durante algún tiempo para observar las respuestas celulares a la lesión. Algún tiempo después de 120 aperturas pupación hr AEL, un período en el SNC es remodelado y por lo tanto es mejor evitar. Así, la ventana de tiempo para apuñalar a la cultura más en la larva es bastante restringido. Uso de las larvas aún tiene una gran ventaja técnica sobre el uso de los adultos: mientras que, de manera similar a la de adultos, el sistema nervioso es ya completamente funcional, el análisis de la respuesta a la lesión es considerablemente más fácil y más rápido en las larvas. Al comparar el tamaño y la morfología de los cerebros y VNCs disecados y se cultivaron en una placa a VNCs que se hayan diseccionado en un punto de tiempo equivalente más tarde sin cultivar en un plato, parece que el desarrollo es más lento en su cultivo que in vivo. En otros aspectos,desarrollo lleva a cabo normalmente en la cultura, la integridad del tejido se conserva y las células están vivas mostrando múltiples respuestas. Expansión de heridas, la reparación y la proliferación glial neuropile tener lugar dentro de 22 horas después de la puñalada. Esto muestra que las respuestas celulares a lesiones tienen lugar en la cultura y hay más probabilidades hay necesidad de mantener los explantes durante más de un día. Si la cultura a largo plazo se desea, el protocolo puede requerir una mayor optimización, tales como el uso de un inserto de placa de cultivo 5. Es importante para identificar las muestras de buena calidad de los degeneración. Optimización de este protocolo tiene cierta habilidad y degeneración inevitablemente se producirá en algunos ejemplares. El VNC puede adquirir un &#39;coliflor&#39; apariencia que refleja una ruptura de la integridad del tejido (Figura 5B). Degeneración también es reconocido por la vacuolización de la VNC independientemente del apuñalamiento, que puede estar presente en intacta, no apuñalados muestras (Figura 5C </strong&gt;). Estas muestras deben ser desechados. La degeneración es muy probablemente causado por la disección áspera, que puede romper los nervios y la capa protectora de las células de la superficie. Así, la atención se debe tener mucho para diseccionar con cuidado. Otros factores que influyen son el medio de cultivo, que debe mantenerse limpio y con antibióticos, apegándose estrictamente a los lavados y los horarios indicados en el protocolo. Por último, la longitud del soporte de la aguja y la aguja, el tamaño y la nitidez de la aguja son muy importantes. El soporte de aguja puede contaminar el medio de cultivo y una aguja roma puede causar un daño grande que no puede repararse a sí mismo y conducir a la degeneración. Es importante mantener rutinariamente la aguja afilada. En este protocolo, que se aprovechó de una línea de trampas de moscas de la proteína para visualizar el neuropile en paralelo a la visualización de los procesos gliales utilizando el tradicional GAL4-UAS sistema. Estas herramientas también se podría combinar con otros sistemas binarios de expresión tales como la LexA 19 y Q-sistema 20, que son independientes de GAL4. Esto permitiría el análisis de las interacciones, por ejemplo entre los axones y procesos gliales, en respuesta a una lesión. Por más que la combinación con otras herramientas genéticas como reporteros de dendritas 21 o la entrada de calcio 22, este método proporciona una gran oportunidad para analizar la biología de las células detrás de la respuesta lesión de las células gliales, axones y dendritas neuronales en el sistema nervioso central. Finalmente, este método se puede combinar con la genética estándar, las mutaciones y la sobre expresión de genes, para probar la función de genes en respuesta a una lesión y regeneración. Este protocolo ha dirigido con éxito para el descubrimiento de un gen de red subyacente en la respuesta regenerativa glial a la lesión del SNC 11. En vista de la conservación evolutiva de la función de genes, desentrañando los eventos celulares y las funciones de genes en moscas de la fruta puede proporcionar importantes conocimientos sobre la comprensión de la maCNS mmalian respuesta a la lesión y regeneración.

La regeneración en animales revelan que las células detectan cuando el crecimiento del organismo se ordena y completa, y cómo la integridad estructural de un organismo se logra y se mantiene. La comprensión de estas habilidades misteriosas de las células es de gran interés en la biología. Promover la regeneración es una de las metas principales para el uso médico neurociencia. En los seres humanos, el dañado sistema nervioso central (SNC) no se regenera. Modelos de roedor de lesión de la médula espinal se utilizan para entender cómo las células responden a la lesión. Sin embargo, las preocupaciones éticas, los altos costos y el ciclo de vida de los animales lento limitan el progreso. La mosca de la fruta Drosophila es un organismo modelo ampliamente utilizado en la biología del desarrollo y la neurociencia. Gracias a sus poderosas herramientas genéticas y ciclo de vida corto, la Drosophila ha recurrentemente llevó al descubrimiento de funciones de genes y redes de genes con relevancia para la comprensión de los seres humanos y la enfermedad. Hay abundante evidencia de la evolución conconservación de la función de genes de las moscas a los humanos. Durante los últimos años, varios paradigmas de lesiones del sistema nervioso han sido establecidas en Drosophila. Algunos consisten en daños en los nervios periféricos que se ejecutan a lo largo del ala o axotomía de los nervios periféricos, incluyendo sensorial y motor axones 1 2. Sin embargo, los sistemas nerviosos periférico y central difieren en muchos aspectos, y es bien sabido que en muchos animales del sistema nervioso periférico pueden regenerarse mientras que el SNC no puede. Por lo tanto, para entender la regeneración del SNC, daño directo al sistema nervioso central es más apropiado. Daño punzante con una aguja ha sido aplicado con éxito al cerebro adulto Drosophila para investigar la respuesta a la lesión 3,4. Con otro enfoque, Ayaz et al. Cercenadas axones del sistema nervioso central en los cerebros adultos cultivadas con microdissector Piezo poder, y analizaron su regeneración durante 4 días 5. La ventaja de estos u grupo experimental despuésps es que se centran en el cerebro, que es sin duda de gran interés. La desventaja es que el cerebro es mucho más complejo que el VNC, que trata sólo con el motor y el control sensorial. Trabajo en el cerebro adulto es también más tiempo. La larva está listo para experimentos en 4 días, mientras que se tarda unos 10 días para la eclosión de adultos, y luego otros 5 días para su maduración. El cerebro adulto es también más difícil de manejar, ya que está encapsulado en cutícula gruesa, que es difícil de quitar. El VNC tiene la atracción adicional de ser funcionalmente equivalente a la médula espinal de vertebrados. La larva de Drosophila se utiliza ampliamente como un organismo modelo para la neurociencia 6-9. Aunque en sentido estricto la larva se encuentra en una fase de desarrollo, sino que también puede ser considerado un animal completamente funcional. La larva tiene locomoción, múltiples sentidos, incluyendo el olfato, el gusto y la nocicepción y el aprendizaje y la memoria. Por lo tanto, la larva VNC wcomo escogido como el modelo ideal para la lesión del SNC. VNCs mortalidad de las larvas puede ser diseccionado y se cultivaron en una placa, que conserva la integridad celular durante un máximo de 24 horas 10. Esto sugiere que la lesión podría ser aplicado a la VNC, que entonces podrían ser registrados en intervalos de tiempo para durante este período de tiempo, o se cultivan y se fija en cualquier punto de tiempo deseado dentro de este período. A continuación, presentamos un paradigma experimental de lesión del SNC utilizando la Drosophila larval VNC. El VNC es primero disecados de la larva y la lesión punzante se aplica manualmente con una aguja de tungsteno. El VNC se coloca entonces sobre un cubreobjetos de vidrio de fondo, y filmada con láser de lapso de tiempo microscopía confocal de barrido. Alternativamente, los VNCs pueden cultivarse durante un período de tiempo deseado, y los efectos celulares de la lesión pueden ser analizados en las muestras fijadas mediante inmunotinción y microscopía confocal. El área de la herida puede ser medida, y el análisis cuantitativo de células numbre (proliferación celular y la muerte celular) puede llevarse a cabo con el software desarrollado a propósito. Muestras de gran tamaño se pueden manejar fácilmente, resultando en resultados estadísticamente validados. Estos métodos se han combinado con éxito con la genética de Drosophila poderosas para descubrir una red de genes subyacentes de la respuesta glial regenerativa a una lesión del SNC 11.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipo </td></tr><tr><td> La tinción bloque </td><td> Brunel Microscopio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinzas N º 5 </td><td> por ejemplo, herramientas de la ciencia Artes </td><td> por ejemplo 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Aguja de tungsteno: diámetro de la varilla de 0,5 mm, tamaño de la punta, 1 m, longitud, 2 cm </td><td> Roboz Surgical Instrument </td><td> RS-6065 </td><td></td></tr><tr><td> Soporte de la aguja </td><td> Roboz Surgical Instrument </td><td> RS-6060 </td><td></td></tr><tr><td> Arkansas piedras: Kit de reparación para Dumont Pinzas </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 29000-00 </td><td></td></tr><tr><td> 35 mm placa de Petri con base de vidrio 27 mm </td><td> Iwaki </td><td> 3930-035 </td><td></td></tr><tr><td> Leica SP2 AOBS confocal microscopio invertido con cámara de ambiente </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivo </td></tr><tr><td> Escudo y Sang M3 insecto medio (ecdisona gratis) </td><td> Sigma </td><td> S3652-500 ml </td><td></td></tr><tr><td> La penicilina y estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Salina tamponada con fosfato (PBS) </td><td> Véase la sección 12 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Sigma </td><td> F7524 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P1399-25mg </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehído, 10%, libre de metanol, Ultra Pure </td><td> Polysciences </td><td> 04018-1 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Ratón anti-glutamina sintetasa anticuerpos </td><td> Millipore </td><td> MAB302 </td><td></td></tr><tr><td> Conejo anti-GFP anticuerpos </td><td> Tecnologías de la vida </td><td> A11122 </td><td></td></tr><tr><td> Ratón anti-anticuerpos REPO </td><td> Estudios del Desarrollo hibridoma banco </td><td> 8D12 </td><td></td></tr><tr><td> Rata elav anti-anticuerpos </td><td> Estudios del Desarrollo hibridoma banco </td><td> 7E8A10 </td><td></td></tr><tr><td> Conejo anti-caspasa 3 activa anticuerpos </td><td> Abcam </td><td> ab13847 </td><td></td></tr><tr><td> Suero normal de cabra </td><td> Vector Laboratories </td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-conejo Alexa Fluor 488 </td><td> Tecnologías de la vida </td><td> A11034 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-ratón Alexa Fluor 647 </td><td&gt; Vida tecnologías </td><td> A21236 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rat Alexa Fluor 647 </td><td> Tecnologías de la vida </td><td> A21247 </td><td></td></tr></tbody></table>

an injury paradigm to investigate central nervous system repair in drosophila

Un método experimental ha sido desarrollado para investigar las respuestas celulares a sistema nervioso central (CNS) lesión utilizando la mosca de la fruta Drosophila. Entendimiento reparación y regeneración de los animales es una cuestión clave en la biología. El SNC humanos dañados no se regenera, y la comprensión de cómo promover la regeneración es una de las metas principales de la medicina neurociencia. El potente conjunto de herramientas genética de Drosophila se puede utilizar para hacer frente al problema de la regeneración del SNC. Una lesión de la médula nervio del SNC ventral (VNC, equivalente a la médula espinal vertebrado) se aplica manualmente con una aguja de tungsteno. El VNC posteriormente puede ser filmado en intervalos de tiempo mediante microscopía láser confocal de barrido para un máximo de 24 horas para seguir el desarrollo de la lesión con el tiempo. Alternativamente, puede obtenerse un cultivo, después se fijaron y se tiñeron mediante inmunofluorescencia para visualizar las neuronas y las células gliales con microscopía confocal. Usando marcadores apropiados, changes en la morfología celular y estado de la célula como resultado de la lesión puede ser visualizada. Con ImageJ y desarrollado a propósito plug-ins, los análisis cuantitativos y estadísticos pueden llevarse a cabo para medir los cambios en el tamaño de la herida en el tiempo y los efectos de las lesiones en la proliferación celular y la muerte celular. Estos métodos permiten el análisis de muestras de gran tamaño. Se pueden combinar con la genética de Drosophila poderosos para investigar los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración y reparación del SNC.

Aquí mostramos cómo realizar lesión punzante al VNC larvas de Drosophila y analizar las respuestas celulares a la lesión utilizando time-lapse microscopía de fluorescencia y confocal inmunotinción. Para los datos de lapso de tiempo, la lesión es visualizada como una zona GFP-negativa dentro de la neuropile de especímenes que llevan el marcador G9 axonal (Figura 2). Poco después de apuñalar, GFP-negativos pequeñas áreas que se ven como agujeros o vacuolas, empiezan a aparecer (Figura 2A). Tal GFP-negativos áreas generalmente ampliar hasta alrededor de 6 a 8 horas después de apuñalar (Figura 2A). Posteriormente, las áreas negativas GFP-retráctil y puede incluso desaparecer (Figura 2B). Por 22 hr después de apuñalar, el área ocupada por la herida es generalmente más pequeña que el área máxima fue de 6 a 8 horas después de la punzante (Figuras 2A, B). Del mismo modo el área de DsRed-negativo en los procesos gliales inicialmente aumenta demasiado, pero Shrinks por 22 horas después del apuñalamiento. Curiosamente, a menudo DsRed-positivas procesos gliales llenar los agujeros GFP-negativos en la neuropile antes de su desaparición (Figura 2C). Usando inmunoticción en muestras fijadas, finas procesos gliales y su respuesta a la lesión puede ser visualizado con mejor resolución que las imágenes time-lapse. Esto puede hacerse, por ejemplo, utilizando el controlador de repoGAL4 glial para inducir la expresión de un reportero membrana anclada (por ejemplo UAS-mCD8GFP) en moscas para visualizar todas las células gliales (excepto la glía línea media). Esto también se puede combinar con otros marcadores gliales, tales como anti-GS2, que las etiquetas de neuropile asociadas a las células gliales (figuras 3A, B). Aquí nos muestran que a pesar de que el cordón nervioso ventral es apuñalado por el lado dorsal, punzante lesión resulta en un hueco ventral (Figura 3a, puntas de flecha). Stabbing parece afectar más severamente el día glial neuropile y neuropile asociada a las célulasuna superficie de células de la corteza y gliales (Figura 3B). Procesos gliales parecen desorganizados en el neuropile, mientras que todavía mantiene su malla como organización en la corteza. Lesión resulta en GS2-positivo restos celulares, que es distinta de las células normales como fragmentos de desechos son mucho más pequeños y no conectado a un cuerpo de la célula. Esto revela daño neuropile asociados a células gliales (Figura 3B). Degenerando neuropile asociadas a las células gliales, también se observaron por microscopía electrónica 15. Anti-troceados-caspasa 3 + tinción apoptosis se observa en neuropile asociadas a las células gliales 15, demostrando que someterse a la apoptosis a puñaladas lesión. Neuropile células gliales asociadas también se muestra a fagocitar los desechos neuronal 15, y GS2 + señal también podría revelar el entrampamiento de neuronas apoptóticas por procesos gliales. Cleaved-caspasa + células apoptóticas se observan también en la corteza, al menos, algunas de las cuales corresponden a Elav + neuronas ( <strong&gt; Figura 3C). Uso de muestras fijas y inmunotinción también permite el análisis cuantitativo de las respuestas celulares a las lesiones, tales como efectos en la proliferación y la apoptosis. Para ello, hemos desarrollado a propósito ImageJ dos plug-ins, Larva caspasa DeadEasy y Glia DeadEasy, a contar automáticamente el número de células gliales y las células apoptóticas, respectivamente. Ellos han sido validados para trabajar en VNCs larvas y son muy precisos. El uso de estos, es posible observar un aumento en el número de REPO-positivas las células gliales causado por lesión punzante, por 22 hr (Figura 4A) 15. También hay un aumento en el número de anti-troceados-caspasa-3 células apoptóticas por 6 horas después de la punzante (Figura 4B) 15. Tal incremento en la proliferación glial y la apoptosis en respuesta a una lesión en el SNC de Drosophila es una reminiscencia de la respuesta de lesión en el SNC de vertebrados. Un aspecto crucial de esta protocol es la calidad de la disecciones VNC. Es difícil decir en el momento de la disección si los VNCs han sido dañados o no en el proceso. Es importante tener especial cuidado en realizar disecciones suaves. Sin embargo, las muestras de mala calidad, inevitablemente se producirá, y es esencial que estos están identificados en las etapas posteriores y se desecha. En nuestras manos, la degeneración VNC no parece estar relacionada a la lesión, pero en cambio causado por la disección áspera. No hemos observado un tamaño crítico en la herida lesión, y se analizan todas las muestras de heridas que no se degradan. Cuando VNCs mantener su integridad, la superficie tiende a VNC un aspecto liso y brillante, y sin agujeros en la neuropile se observó (Figura 5A). La degradación de VNCs puede ser reconocido por 24 horas después de la disección de la superficie rugosa de las áreas VNC ventral y lateral (Figura 5B). La degradación de la neuropile no relacionado con lesiones punzante también puede ocurrir, y se reconoce como neuropile holes en la señal de fondo de las muestras inmunoteñidas. Las muestras con estos signos de degeneración debe ser desechado (Figura 5C). En nuestras manos, la tasa de éxito para la disección y lesiones en el control intacto y apuñalado (yw) las moscas están en torno al 70%. Esta tasa variará con la habilidad de la persona que realiza los experimentos, y con el genotipo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig1.jpg" /> Figura 1. Dibujo esquemático de las larvas de estadificación y punzante lesión. (A) En el día 0, las moscas se permite que ponen huevos en una placa de Petri zumo de uva durante 3 horas. Al día 1, las larvas eclosionadas primera estadio (L1) se recogen y se colocan en viales que contienen alimentos de levadura estándar, donde se mantienen durante otros 3 días. Al día 4, las larvas se recogen de vial de alimentos, y se utiliza para los experimentos agudos. (B) Vista lateral de la larva del sistema nervioso central.La región abdominal del cordón nervioso ventral es apuñalado con una aguja desde el lado dorsal. Anterior es a la izquierda, y posterior a la derecha. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig2.jpg" /> Figura 2. Time-lapse progresión de la lesión VNC. Microscopía confocal en vivo con VNCs axones GFP-etiquetados y DsRed-etiquetados células gliales. Genotipo:. UASDsRed / +; G9 / +; repoGAL4 / + (A) La lesión es reconocido por la falta de fluorescencia en el neuropile axonal. Después de apuñalar, GFP-negativos aparecen agujeros, a partir de entonces cada vez mayor en tamaño y número. Proyecciones de 5 secciones ópticas de cada punto de tiempo después de apuñalar a una lesión. (B) Las lesiones axonales encoge neuropile de 9 horas después de la puñalada. Estas imágenes son únicas secciones ópticas de diferentes puntos de tiempo después de apuñalar a una lesión. Para identificar posiciones equivalentes en cada muestra, el número mismo segmento de eapunto ch tiempo en la pila de datos de lapso de tiempo fue elegido. Mediante la comparación de los patrones visualizados con G9 y repoGAL4&gt; UASmCD8GFP en la zona no afectada por el apuñalamiento, las rodajas se verificado como de las posiciones equivalentes en el eje Z. Las líneas de trazos en (A, B) indicar el borde de la herida. (C) de alta magnificación de las heridas en la neuropile. GFP-negativos agujeros estaban llenos de DsRed-positivas procesos gliales, y posteriormente desaparecido (puntas de flecha). Vista horizontal. Hasta anterior. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig3.jpg" /> Figura 3. Caracterización celular de lesión VNC. VNCs provistos de una membrana reportero GFP tethered para todas las células gliales (excepto las células de la línea media) teñidas con anti-GFP y anti-GS2, un marcador neuropile asociada a células gliales. Genotipo:. + / +; UASmCD8GFP / +; repoGAL4 / + (A) VNCs fueron apuñalados de la dorlado sal, pero esto hace mella ventralmente (puntas de flecha). Vista sagital de secciones ópticas individuales, dorsal izquierda y anterior. (A, B) Stabbing lesión afecta más severamente neuropile asociada a las células gliales que las células de la corteza y la superficie gliales. Lesión resulta en GS2-positivo restos celulares (puntas de flecha en B). (B) Vista horizontal de secciones ópticas individuales, hasta anterior. Las puntas de flecha apuntan a GS2 + restos celulares. (C) colocalización del marcador anti-apoptótica troceados-caspasa-3 y el marcador neuronal anti-Elav que muestra que después de la lesión algunas de las células que mueren en la corteza son neuronas. np, neuropile; cx, corteza. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig4.jpg" /> Figura 4. Recuento automático de células gliales y las células apoptóticas utilizando DeadEasy. (A) Ejemplo de uso de &#39;glia DeadEasy larval&#39; contar REPO positivolas células gliales. Izquierda: VNC mitades ventral teñidas con anti-anticuerpos; REPO media: salida de la glía DeadEasy larvas que muestra células identificadas por el plug-in; derecha: se fusionan. Los números de la derecha son el número de células positivas REPO contados de forma automática en una pila completa de ópticas secciones confocales en unos 30 segundos. Aumenta el número de células gliales en los VNCs apuñalado. (B) Ejemplo de uso de &#39;larva caspasa DeadEasy&#39;. Proyecciones de las 5 secciones ópticas confocales teñidas con anti-cleaved caspasa-3 anticuerpos; medias: Salida izquierda que muestra células identificadas por el plug-in; derecha: Merge. Los números de la derecha son el número de la caspasa-positivas células contadas automáticamente en una pila entera de ópticas secciones confocales en unos 30 segundos. El número de células apoptóticas aumenta en la apuñalado VNC. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig5.jpg" /> Figura 5. Ejemplos de degeneration. (A) Un saludable VNC. No hay señales de degeneración. (B) El lado del tórax está degenerando (puntas de flecha) en una muestra apuñalado. El asterisco indica lugar de la lesión. (C) Los agujeros en la neuropile torácica (punta de flecha blanca) y la corteza (naranja punta de flecha) en un no-apuñaló VNC. Las muestras con vacuolización dañado neuropile y extenso debe ser desechada. Aquí VNCs se tiñeron con la neuropile marcador asociado anti-glial Ebony. Vista horizontal, hasta anterior.

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An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Un paradigma de lesión utilizando el cable de Drosophila larval nervio ventral para investigar la regeneración del sistema nervioso central y la reparación es descrito. Stabbing seguido por microscopía confocal de barrido láser en especímenes de lapso de tiempo y fijo, combinada con el análisis cuantitativo con el software desarrollado a propósito y la genética, se utilizan para investigar los mecanismos moleculares de la regeneración del SNC y reparación.

Un paradigma de Lesiones de investigar reparación del sistema nervioso central en<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

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Research

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Neuroscience

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

13.2K vistas.  University of Birmingham. Un paradigma de lesión utilizando el cable de Drosophila larval nervio ventral para investigar la regeneración del sistema nervioso central y la reparación es descrito. Stabbing seguido por microscopía confocal de barrido láser en especímenes de lapso de tiempo y fijo, combinada con el análisis cuantitativo con el software desarrollado a propósito y la genética, se utilizan para investigar los mecanismos moleculares de la regeneración del SNC y reparación.

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Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Visualización del sistema nervioso embrionario en Todo el montaje Drosophila Los embriones

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Investigación

Neurociencias

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

La producción de vectores lentivirales de células transductoras del Sistema Nervioso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Entrega intraventricular directa de medicamentos al roedor Sistema Nervioso Central

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

En Interrogatorio vivo del Sistema Nervioso Central Translatome por Polyribosome Fraccionamiento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing óptico del sistema nervioso central del ratón Utilizando CLARITY pasiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

Anatomía Inspirada Tridimensional Micro-tejido Ingeniería de Redes Neuronales para la Reconstrucción del Sistema Nervioso, Modulación y Modelado

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Quantifying Acute Changes in Renal Sympathetic Nerve Activity in Response to Central Nervous System Manipulations in Anesthetized Rats

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are limited resources directing scientists in the techniques for measuring and analyzing these variables. This protocol describes the methods for measuring RSNA and mean arterial pressure in anesthetized rats. The protocol also includes the approaches for accessing the brain during RSNA recordings for central nervous system (CNS) manipulations. The RSNA recording technique is compatible with pharmacologic, optogenetic, or electrical stimulation of the CNS. The approach is useful when an investigator will measure short-term (min to h) autonomic responses in non-survival experiments to correlate anatomically with CNS nuclei. The approach is not intended to be used to obtain chronic (survival) recordings of RSNA in rats. Discharges in RSNA, averaged rectified RSNA, and mean arterial pressure can be quantified and analyzed further using parametric statistical tests. Methods for obtaining venous access, recording mean arterial pressure telemetrically, and brain fixation for future histological analysis are also described in the article.

Methods for measuring sympathetic and cardiovascular responses to central nervous system (CNS) manipulations are important for advancing neuroscience. This protocol was developed to assist scientists with measuring and quantifying acute changes in renal sympathetic nerve activity (RSNA) in anesthetized rats (non-survival).

Cuantificación de los cambios agudos en la actividad nerviosa simpática Renal en respuesta a las manipulaciones del sistema nervioso Central en ratas anestesiadas

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are ...