ويدعم عملنا على توطين RNA عن طريق منحة من المعاهد الوطنية للصحة (R01GM071049) لKLM.

الجزء 1 : النسخ من مرنا fluorescently المسمى. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصبح خطي DNA البلازميد التي تحتوي على عنصر أو تسلسل الحمض النووي الريبي التعريب الأخرى ذات الصلة وresuspend في 1 ميكروغرام / ميكرولتر مع DEPC المعاملة O. 2 H يجب أن يكون القالب الحمض النووي لديها مواقع المروج المنبع للنسخ التي T7 ، SP6 ، أو T3 بوليميريز الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الكواشف التالية لأنبوب 1.5mL العقيمة : <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> أ. 10X تكساس العازلة (انظر M &amp; M) </td><td> 2 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ب. 20X قبعة / مزيج NTP (انظر M &amp; M) </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ج. 1 ملم اليكسا فلور 546-14 - UTP (Invitrogen) </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> د. UTP ، [α P - 32] (1 μCi / ميكرولتر) (بيركن إلمر) </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ه. DEPC - H 2 O </td><td> 11 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ف. 0.2 M DTT </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ز RNasin (Promega) </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ح. الخطي قالب الحمض النووي </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ط رنا بوليميريز (Promega) </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج بلطف والكواشف الطرد المركزي لفترة وجيزة (10 ثانية. في microcentrifuge). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 2-4 ساعات في 37 درجة مئوية ، وتغطي الأنبوب برقائق الألومنيوم لمنع photobleaching من fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر 1 ملغ / مل ريبونوكلياز خالية الدناز (Promega) للحط من الحمض النووي القالب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 79 ميكرولتر 20 ملي EDTA (الرقم الهيدروجيني 8.0) لوقف التفاعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 ميكرولتر لإزالة أنبوب منفصل ، وصفت بانها &quot;المدخلات&quot; وانقاذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رد الفعل من خلال زيادة ونقصان عمود G50 1 مل (انظر المواد والطرق) ، والتي سوف تشمل النيوكليوتيدات الفردية مع استبعاد كامل مرنا طول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيز الحمض النووي الريبي قبل هطول الأمطار الايثانول : <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، و 10 ميكرولتر 7M COONH CH 3 4 ، 1 ميكرولتر RNA الناقل (الحمض الريبي النووي النقال الخميرة ، و 10 ميكروغرام / ميكرولتر) أو 1 الجليكوجين ميكرولتر (20 ملغ / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتخلط جيدا حتى تجميد الصلبة في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة&gt; أو على الجليد الجاف لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في أقصى سرعة في microcentrifuge لمدة 15 دقيقة ، وطاف صب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع 150 ميكرولتر من الايثانول 75 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لمدة 3 دقائق على السرعة القصوى في طاف ، microcentrifuge صب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف بيليه في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، وضمان أن جميع الايثانول قد تبخرت. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend في 11 ميكرولتر DEPC O 2 - H وإزالة 1 ميكرولتر لأنبوب منفصل ، وصفت بانها &quot;دمج&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد التأسيس في المئة وتخفيف الحمض النووي الريبي إلى 50 نانومتر (انظر المواد وطرق الحساب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي تجميد الحمض النووي الريبي في 5 aliquots ميكرولتر ، لاستخدام مرة واحدة لتجنب تجميد / الذوبان الدورات ويمكن تخزينها لعدة أسابيع في -80 درجة مئوية. </li></ol> الجزء 2 : التحضير لMicroinjection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA التحضير : أذاب an قسامة من الحمض النووي الريبي (50 نانومتر) ، وتفسد الحمض النووي الريبي في 70 دقيقة لمدة 3-5 درجة مئوية. تدور لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة microcentrifuge بأقصى سرعة ممكنة لإزالة أي الجسيمات ، والحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البويضة التحضير : <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المبيض جراحيا من الإناث المورق القيطم (ناسكو). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم قطعة من المبيض المورق القيطم في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 25 مل من محلول كولاجيناز (انظر المواد والطرق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز بلطف عند 18 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، أو حتى يتم فصل واضح البويضات من المبيض. بسبب دفعي لتباين الدفعي ، قد كولاجيناز وقت المعالجة تختلف ، وينبغي رصدها بعناية من خلال الفحص البصري لضمان defoliculation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لتسوية البويضات في أنبوب ، وإزالة حل ويغسل البويضات مع العازلة MBSH (انظر المواد والطرق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار غسل مرتين أكثر من أجل ما مجموعه ثلاثة يغسل. هذا البروتوكول العزلة البويضة هي مماثلة لتلك المفصلة في كوهين وآخرون ، 2009. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفرز يدويا في المرحلة الثالثة / البويضات الرابع (دومون ، 1972) في MBSH العازلة تحت المجهر القياسية تشريح. المرحلة الثالثة هي البويضات مبهمة تماما لكنها بيضاء ، في حين أن المرحلة الرابعة البويضات هي أكبر قليلا ، وتتخللها الصباغ. البويضات تكون شفافة قليلا جدا من الشباب والبويضات التي المصطبغة كليا أو توزيع يحمل صبغة الاستقطاب قديمة جدا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبرة التحضير : سحب وشطبة الإبر إلى القطر الخارجي من 0.05 ملم ~. (ونحن نستخدم العلم دروموند 3.5 بوصة الشعيرات الدموية (ترتيب # 3 - 000 - 203 - G / X) ، وهو الصك سوتر micropipette مجتذب شركة وشركة beveller WPI). </li></ol> الجزء 3 : Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة الإبرة مع O 2 DEPC - H 2 لتسليم NL في الحقن. نحن لدينا تحميل الجبهة باستخدام إبرة microinjector الغاز يحركها (انظر المواد والطرق) ، وانخفاض حجم معايرة باستخدام ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل RNA في الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان فرز البويضات في طبق يحتوي على حقن MBSH العازلة. نحن microinject على طبق مع طبقة من المطاط الرغوي السوداء. والبويضات شاحب تبرز بشكل جيد على backgrou الأبيضالثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن البويضة مع كل بعناية NL 2 من الحمض النووي الريبي في 50 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرد الجيش الملكي النيبالي ، وشطف مع إبرة DEPC O 2 - H ، وتحميل RNA المقبل للحقن. </li></ol> الجزء 4 : ثقافة سيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البويضات مكان في بئر من 24 لوحة معقمة جيدا (سيغما الدريتش). نحن ثقافة ما يصل الى ألف البويضات لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العازلة واستبدالها مع 400 ميكرولتر O ocyte C M ulture edium (OCM ، انظر المواد و المناهج) لكل بئر. مكان لوحة الثقافة داخل حاوية بلاستيكية محكمة الغلق مع منشفة ورقية مبللة للحفاظ على بيئة رطبة خلال الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البويضات عند 18 درجة مئوية لمدة تتراوح من النقاط الزمنية ما بين 8 و 48 ساعات. </li></ol> الجزء 5 : التثبيت والجفاف وتخزين البويضات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرز البويضات أي ميت على قيد الحياة ومكان البويضات في قوارير زجاجية. نلاحظ بشكل روتيني&gt; البقاء على قيد الحياة 90 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البويضات في مكان مثبت MEMFA (انظر المواد والطرق) والصخور لمدة 20 دقيقة. حماية البويضات من الضوء من خلال تغطية بورق الألمنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البويضات عن طريق إزالة تثبيتي ، والاستعاضة عن حجم مساو من MBSH العازلة. كرر هذا مرة أخرى ليغسل ما مجموعه اثنين من يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البويضات في الميثانول اللامائية : <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة نصف الحجم ، مع استبدال الميثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة &quot;أ&quot; مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جميع من الحل ، مع استبدال الميثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار غسل الميثانول. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين البويضات في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للصورة. </li></ol> الجزء 6 : التصوير RNA التعريب بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التصوير ، إضافة ليالي غرفة متوسطة موراي (2:1 بنزيل بنزوات البنزيل الكحول -) إلى أسفل الزجاج FluoroDish (WPI شركة) لتغطية السطح التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية البويضات من الميثانول إلى FluoroDish ، والتقليل من حجم نقل الميثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصورة على المجهر an مبائر المقلوب (ونحن قد استخدمت بنجاح LSM510 زايس وTCS SP2 لايكا). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1704/1704fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 :.. يقتصر في البداية تصور التعريب بواسطة الحمض النووي الريبي التحت خلوية Microinjection النصوص صفتها Fluorescently ألف microinjection التالية ، RNA المسمى مع فلور اليكسا 546 إلى النواة باء بعد ثماني ساعات من الثقافة ، ويمكن أن ينظر إلى fluorescently المسمى RNA السيطرة بشكل موحد وزعت في سيتوبلازم البويضة. جيم ومع ذلك ، يمكن أن ينظر إلى RNA fluorescently المسمى تحتوي على تسلسل التي تجند أجهزة النقل في عملية توطين التحت خلوية إلى القطب نباتية من البويضة (نحو الأسفل). مقياس بار = 50 ميكرومتر.

<ol>
	<li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes.">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li><li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+transport+in+ovo:+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs.">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li><li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes.">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li><li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTB/hnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes.">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li><li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes.">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li><li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes.">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li><li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin.">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li></ol>

وقد أجريت التجارب باستخدام الحيوانات المخبرية وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها جامعة براون.

هنا قدمنا ​​مشروع بروتوكول لتصور التعريب مرنا في القيطم البويضات. هذا الأسلوب ، وذلك باستخدام الحمض النووي الريبي fluorescently المسمى النصوص وأعلى إشارة إلى نسبة الضوضاء من الحصول مسبقا مع digoxigenin المسمى النصوص وأبسط وأسرع من الوضع الطبيعي في النهج القائمة (موري ومي...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

10X تكساس العازلة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 60 ملم MgCl 2 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 ملم تريس ، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.5) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 ملي سبيرمدين - حمض الهيدروكلوريك </li></ul> 20X قبعة / NTP مزيج <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ملي CTP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ملي ATP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 9 ملم UTP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 مم GTP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 ملي G (PPP) G رسملة تماثلي (نيو إنجلاند Biolabs) </li></ul> G - 50 عمود <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> منزوع الأيونات هيدرات 5 ز Sephadex G - 50 حبات (سيغما الدريتش) في 100 مل من H 2 O. لمدة 30 دقيقة DEPC علاج. والأوتوكلاف. تخزين الأوراق المالية غير مكتملة في درجة حرارة الغرفة. قبل الاستخدام ، إضافة التالية ريبونوكلياز خالية من الحلول : </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 مل 0.2 M EDTA </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 مل 1 تريس M الرقم الهيدروجيني 8.0 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 مل SDS 20 ٪ </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزن كاملة G - 50 درجة مئوية في حل 4 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وتجاهل المكبس من المحاقن مل 3 دينار بحريني (العلوم البيولوجية) ، ومكان للبرميل من الحقنة في أنبوب 15 مل المخروطية (كورنينج). سد المحاقن مع كمية صغيرة من الصوف الزجاجي (قابس حول حجم نصف بنس واحد). </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة كاملة G - 50 حل لresuspend الخرز. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل G - 50 حل للعمود فارغ. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لمدة 1 دقيقة في ز س 1000 جهاز طرد مركزي في الفوق. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 DEPC المعاملة منزوع الأيونات ميكرولتر H 2 O إلى كل عمود. زيادة ونقصان. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار غسل مرتين أكثر من أجل ما مجموعه ثلاثة يغسل. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> حقنة لإزالة برميل أنبوب جديد 15 مل المخروطية. </li></ul> كولاجيناز الحل <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 75 ملغ من نسج كلوستريديوم كولاجيناز (سيغما الدريتش) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 مل 0.1 م 3 + KPO (الرقم الهيدروجيني 7.4) </li></ul> MBSH العازلة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 88 مم كلوريد الصوديوم </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 ملم بوكل </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.4 ملي NaHCO 3 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.82 ملي MgSO 4 X 7H 2 O </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.33 ملي كا (NO 3) 2 X 4H 2 O </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.41 ملي CaCl 2 X 6H 2 O </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 HEPES ملم (7.6 درجة الحموضة) </li></ul> البويضة مستنبت <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 ٪ L15 المتوسطة </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 HEPES ملم (7.6 درجة الحموضة) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 ملغ / مل الأنسولين </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 ملغ / مل جنتاميسين </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 U / مل النيستاتين </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 U / مل البنسلين </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 ملغ / مل الستربتوميسين </li></ul> MEMFA الحل <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1 اجتماعات الأطراف M (الرقم الهيدروجيني 7.4) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 مم EGTA </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 ملم MgSO 4 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 3.7 ٪ الفورمالدهيد </li></ul> الحوسبة RNA العائد <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> الاجتماع التحضيري للمؤتمر في تحديد &quot;الإدخال&quot; و &quot;دمج&quot; العينات باستخدام عداد التلألؤ القياسية. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> التأسيس = (&quot;دمج&quot;) / (10 س &quot;الإدخال&quot;) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> إدماج القيم النموذجية تتراوح ما بين 0.03 و 0.10 ~. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> نظرية الحد الأقصى للغلة polymerases مختلفة : T7 ، T3 ، SP6 -- 2.64 ميكروغرام </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> رد الفعل في ميكروغرام العائد = (الغلة القصوى من بوليميريز المستخدمة) X (التأسيس) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع RNA إلى 50 نانومتر = (RNA ميكروغرام) / 320 / (طول الحمض النووي الريبي في قواعد) / (5X10 -8) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> رد الفعل عادة غلات ~ 5-10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي في 50 نانومتر. </li></ul>

visualizing rna localization in xenopus oocytes

RNA الترجمة هي آلية الحفظ إنشاء خلية قطبية. Vg1 مرنا يموضع إلى القطب نباتية من البويضات القيطم المورق ويعمل على تقييد مكانيا التعبير الجيني للVg1 البروتين. مطلوب رقابة مشددة من Vg1 التوزيع بهذه الطريقة المناسبة لمواصفات طبقة الجرثومية في الجنين النامية. تسلسل الحمض النووي الريبي العناصر في UTR 3 &#39;من مرنا ، وتوطين عنصر Vg1 (VLE) هي المطلوبة والكافية لنقل المباشر. لدراسة الاعتراف ونقل Vg1 مرنا في الجسم الحي ، قمنا بتطوير تقنية التصوير التي تسمح للتحليل واسعة من العوامل عبر آليات النقل الموجهة عبر قراءات بصرية بسيطة. الحمض النووي الريبي لتصور التعريب ، ونحن توليف fluorescently المسمى VLE RNA وهذا نص في microinject البويضات الفردية. ثقافة البويضة بعد للسماح بنقل الحمض النووي الريبي حقن ، البويضات يتم إصلاحها والمجففة قبل التصوير بواسطة المجهر مبائر. تصور أنماط توطين مرنا يتيح قراءة لرصد المسار الكامل لنقل الحمض النووي الريبي وتحديد الأدوار في توجيه نقل الحمض النووي الريبي لرابطة الدول المستقلة المفعول عناصر داخل النص ، والعوامل التي تعمل عبر ربط VLE (لويس وآخرون ، 2008 ، Messitt وآخرون ، 2008). لقد قدمنا ​​من خلال هذه التقنية بالتعاون مع التعريب الرناوات إضافية والبروتينات (غانيون وموري ، 2009 ، Messitt وآخرون ، 2008) ، وبالاشتراك مع تعطل المحرك والهيكل الخلوي البروتينات و(Messitt وآخرون ، 2008) إلى التحقيق الآليات الكامنة وراء توطين مرنا.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

تصور<em&gt; في الجسم الحي</emويتم إنجاز&gt; RNA النقل microinjection النصوص الحمض النووي الريبي في fluorescently المسمى<em&gt; القيطم</em&gt; البويضات ، تليها المجهري متحد البؤر.

تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

visualizing-rna-localization-in-xenopus-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

11.5K Views.  Brown University. تصور في الجسم الحي RNA النقل microinjection النصوص الحمض النووي الريبي في fluorescently المسمى القيطم البويضات ، تليها المجهري متحد البؤر.

Video: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection من البويضات المورق القيطم

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

تسميد البويضات القيطم باستخدام أسلوب نقل المضيف

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

في المختبر، والسد النسخ من مرنا luciferase المراسل Gaussia تلاه ترنسفكأيشن الخلية هيلا

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

قياس الكاتيونات النقل من نا، K-H و، K-أتباز في<em&gt; القيطم</em&gt; البويضات بواسطة الامتصاص الذري الطيفي: بديل لفحوصات النظائر المشعة

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

زرع الوجه في<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأجنة

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery (References 2 - 3, and references therein). A characteristic that makes the oocyte attractive for foreign channel expression is the poor abundance of endogenous ion channels4. This expression system has proven useful for the characterization of many proteins, among them ligand-gated ion channels.
The expression of GABAA receptors in Xenopus oocytes and their functional characterization is described here, including the isolation of oocytes, microinjections with cRNA, the removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments. The procedures were optimized in this laboratory5,6 and deviate from the ones routinely used7-9. Traditionally, denuded oocytes are prepared with a prolonged collagenase treatment of ovary lobes at RT, and these denuded oocytes are microinjected with mRNA. Using the optimized methods, diverse membrane proteins have been expressed and studied with this system, such as recombinant GABAA receptors10-12, human recombinant chloride channels13, Trypanosome potassium channels14, and a myo-inositol transporter15, 16.
The methods detailed here may be applied to the expression of any protein of choice in Xenopus oocytes, and the rapid solution change can be used to study other ligand-gated ion channels.

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

القيطم البويضات: طرق الأمثل ل microinjection، إزالة طبقات الخلية مسامي، والتغييرات الحل السريع في التجارب الكهربية

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

تشيب-Seq: التنميط Epigenome الخلية-نوع معين

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.