وقد تم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم ترست ومؤسسة القلب البريطانية.

يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة، ما لم يرد خلاف ذلك. 1. قلع والتثبيت من العيون بعد الولادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع مؤشر الفأرة قتل إنسانية الجرو على جانبها، وإزالة الجلد الذي يغطي العين مع مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص وملقط لاستأصل العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان مقص تحت العين منزوعة النواة، وقطع العصب البصري والأنسجة المحيطة بها واخراج العين. نقل إلى لوحة 24 أيضا تحتوي على امتصاص العرق 4٪ (PFA) تتكون في 2X PBS في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح كل عين لإصلاح لمدة 10 - 15 دقيقة، ثم نقل إلى 2X الباردة برنامج تلفزيوني على الجليد لمدة 5 - 10 دقيقة. فمن الأفضل لارباك enucleations والتثبيت لاحقة لضمان درجة من التثبيت تساوي لكل عين. </li></ol> 2. تشريح الفئران شبكية العين بعد الولادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عيون نقل إلى طبق بتري تحتوي على 2X PBS باستخدام ماصة باستير البلاستيك التي تم قطع لتوسيع الفتحة ومكان تحت ديسيهcting المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي دهون حول العين باستخدام ملقط ومقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيرس حافة القرنية مع مقص حاد وقطع حول القرنية والقزحية وتجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج ملقط بين شبكية العين والصلبة وإزالة الصلبة مع الحرص على عدم تمزق شبكية العين. ويمكن أيضا أن إزالة طبقة المشيمية، ولكن إذا كان هناك خطر من تلف في الشبكية التي تحدث خلال هذه الخطوة، يمكن أن تترك طبقة المشيمية على ما ينبغي أن لا تؤثر تأثيرا كبيرا على نوعية المناعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العدسة والنكتة الزجاجي باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السفن hyaloids عن طريق جمع بعضهم البعض في وسط العين مع ملقط غرامة ثم سحب بسرعة بعيدا عن مركز الشبكية (بدلا من قص في قاعدة السفن الجسم الزجاجي مع مقص غرامة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف شبكية العين على شكل كوب مع برنامج تلفزيوني في طبق بيتري نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 4-5 شقوق شعاعي التوصل إلى ما يقرب من 2/3 من دائرة نصف قطرها من شبكية العين باستخدام الربيع scissoRS لإنشاء شكل &quot;البتلة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم قبالة PBS باستخدام ماصة باستور لشد شبكية العين، ثم قم بإزالة أي برنامج تلفزيوني الزائدة مع قطعة صغيرة من ورقة ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ببطء ماصة البارد (-20 ° C) قطرة قطرة الميثانول على سطح شبكية العين حتى تغطيها تماما ثم الفيضانات مع الميثانول إضافية. هذا سوف يساعد على إصلاح شبكية العين وسيسهل permeabilization. سوف تتحول شبكية العين البيضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى أنبوب مل 2 باستخدام ماصة باستير البلاستيك التي تم قطع لتوسيع الفتحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك شبكية العين في الميثانول البارد لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الشروع في المناعية. من الأجسام المضادة المستخدمة هنا، لا يمكن أن تستخدم فقط VE كادهيرين بنجاح على شبكية العين الثابتة الميثانول. في هذه الحالة تحتاج إلى شبكية العين والمضي قدما على التوالي لالمناعية بعد الخطوة 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، ويمكن تخزين شبكية العين في الميثانول عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أشهر قبل تلطيخ. </li></ol> 3. المناعية / تلطيخ isolectin من Vascu الشبكيةlature <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية / صب قبالة الميثانول وشطف بلطف شبكية العين لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني (في هذه المرحلة شبكية العين لا يزال في نفس أنبوب 2 مل من الخطوة 11 أعلاه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني وتغطية شبكية العين مع 100 ميكرولتر من بيرم / كتلة الحل (PBS + 0.3٪ تريتون + 0.2٪ BSA) + 5٪ من المصل المناسب (انظر الجدول 1) ويهز بلطف لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بيرم / كتلة واحتضان شبكية العين مع لطيف تهتز بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المحددة (انظر الجدول 1) و / أو IsolectinB4، جميع عن طريق تمييع في بيرم / كتلة استعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجسام المضادة / isolectin وغسل شبكية العين 4 × 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني + 0.3٪ تريتون (PBSTX). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في بعض الحالات، على سبيل المثال تلطيخ التالية مع IsolectinB4-Alexa488 أو الأجسام المضادة الأولية مترافق مباشرة، غير مطلوب الأجسام المضادة الثانوية، ويمكن تركيبه شبكية العين مباشرة (الخطوة 7). عندما تم استخدام الأجسام المضادة الأولية اللامقترن في الخطوة 3، ثم 100 ميكرولتر من فلور المناسبةيتم إضافة الأجسام المضادة الثانوية escent (مخفف 1/200 في PBSTX) وتترك لاحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو لمدة 4 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجسام المضادة الثانوية وغسل شبكية العين 4 × 15 دقيقة في 2 مل PBSTX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل شبكية العين على الشرائح باستخدام البلاستيك تتحمل واسعة باستور ماصة وإزالة الأنسجة الزائدة مع PBSTX ماصة لل. جبل شبكية العين عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من إطالة مرس على ساترة والموقف برفق فوق الشبكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرائح إلى الثلاجة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، وضمان أن تكون مسطحة ومحمية من الضوء، للسماح للإطالة مرس لتعيين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شبكية العين صورة باستخدام مجهر متحد البؤر المجهر أو epifluorescence. </li></ol>

<ol>
	<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Staton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+for+assaying+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo.">Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).</li><li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents.">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+retinal+vasculature.">Development of the retinal vasculature.</a> Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).</li><li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses.">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).</li><li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+eye+enucleation+for+remote+high-throughput+phenotyping.">Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping.</a> J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice.">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat. Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li><li>Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+expression+of+TGFbeta+type+II+receptor+is+required+to+maintain+vascular+integrity+during+postnatal+development+of+the+central+nervous+system.">Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system.</a> PLoS One. 7 (9), e39336 (2012).</li><li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+arteriovenous+malformations+in+the+absence+of+endoglin.">Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin.</a> Circ. Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).</li><li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).</li><li>Pi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+connective+tissue+growth+factor+in+the+retinal+vasculature+during+development+and+ischemia.">Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization.">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

الطريقة المعروضة هنا يوفر وسيلة بسيطة وفعالة للحصول على صور من التحضيرات الملون جبل بأكمله من شبكية العين الماوس حديثي الولادة، مما يجعلها نموذجا للقياس الكمي بسهولة وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من الأوعية الدموية. في البداية، يمكن للعين الماوس يكون من الصعب ?...

الأوعية الدموية هي عملية معقدة التنموية التي حددها تشكيل الأوعية الدموية الجديدة من شبكة الأوعية الموجودة مسبقا ويتم تنظيمها من قبل عدة مسارات الإشارات. وأبرز هذه هو الطريق VEGF. يتم تحريرها من قبل خلايا VEGF الدماغية ويؤدي إلى بدء عائية تنتشر في الأوعية الدموية المجاورة. الخلية البطانية الرائدة من الأوعية الدموية الجديدة تنبت هو &#39;غيض&#39; الخلية، التي تنتج أرجل كاذبة خيطية التي تصل إلى نحو مصدر VEGF، وتبعتها تكاثر الخلايا البطانية &quot;ساق&quot;. في هذه الطريقة، تنشيط الخلايا البطانية وتهاجر تتكاثر نحو المنطقة اوعائية حيث أنها تشكل أنابيب الأوعية الدموية الجديدة. من أجل تحقيق الاستقرار في هذه الأنابيب لدعم تدفق الدم، والخلايا البطانية التفاعل مع pericytes وخلايا العضلات الملساء، التي تحيط الأوعية الدموية الجديدة 1. تكوين الأوعية الدموية ضروري لالأوعية الدموية للجنين والأنسجة المتنامية. ومع ذلك، فإنه يساهم أيضا في العديد من pathologiاضطرابات كال مثل السرطان، في حين ترتبط عيوب في الأوعية الدموية مع الأمراض الدماغية. وبالتالي فإن تطوير علاجات فعالة المخدرات لتنظيم الأوعية الدموية كوسيلة لعلاج المرض هو من مصلحة كبيرة. على سبيل المثال، سوف العوامل المضادة للعائية فعالة لحد من نمو السرطان، في حين استراتيجيات الموالية للعائية يمكن أن تستخدم لعلاج الأمراض الدماغية. وهكذا، ونماذج من الأوعية الدموية ضرورية لفهم أفضل لتنظيم تشكيل سفينة جديدة وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة لتعزيز نمو الأوعية الدموية أو نقصان. ومن العناصر الأساسية للبحث الأوعية الدموية هو اختيار نموذج الأوعية الدموية المناسبة. وقد تم العديد من نماذج في المختبر يهدف إلى إعادة إنتاج الخطوات الأساسية لتكوين الأوعية الدموية مثل هجرة الخلايا البطانية، وانتشار وبقاء 2،3. A المستخدمة بشكل متكرر في المختبر فحص هو تشكيل شبكة متفرعة من الخلايا البطانية على مصفوفة Matrigel، على الرغم من ربلاده ليست محددة لخلايا بطانة الأوعية الدموية، كما أنها لا تتضمن عادة بدعم من pericytes أو خلايا العضلات الملساء. تقييم تنتشر الأوعية الدموية خارج الجسم باستخدام الماوس ثقافة الجهاز مثل فحص الجسم مضغي الشكل، ومقايسة حلقة الأبهر وفحص مشط القدم الجنين يسمح للتحليل من الأوعية الدموية من الخلايا البطانية في سياق خلايا داعمة إضافية. ومع ذلك، فإن القيود الرئيسية من هذه المقايسات تشمل نقص تدفق الدم والانحدار من السفن على مر الزمن، وإعطاء نافذة محدودة للتحليل. لذلك، لفهم تنظيم الأوعية الدموية على نحو أدق، في النماذج الحية مطلوبة مثل تلك التي وضعت في الماوس باستخدام الإسفنج مزروع تحت الجلد أو المقابس matrigel، وكذلك هند أطرافهم نموذج نقص التروية. ومع ذلك، فإن هذه النماذج تشكل تحديا لتحليل ويرجع ذلك إلى بنية معقدة 3D من neovessels. في المقابل، فقد ثبت أن الجنين الزرد نموذجا ممتازا لتصور الأوعية الدموية في كاملالكائن الحي 4. ومع ذلك، فإن الفأر هو متعلق تطويريا أكثر من ذلك بكثير عن كثب إلى الإنسان من الزرد، مما يجعل الماوس على النموذج المفضل في كثير من الحالات. وبالتالي تكوين الأوعية الدموية في شبكية العين الماوس بعد الولادة يمثل طريقة تتسم جيدا من خيار للأبحاث الأوعية الدموية. لأنه لا يوفر بيئة الفسيولوجية، ولكن أيضا 2D الضفيرة الوعائية التي يمكن تصور بسهولة باستخدام البقع الفلورسنت المناسب. الهندسة المعمارية للشبكة سفينة، وانتشار البطانية، تبرعم، تجنيد خلية حول الأوعية وإعادة عرض السفينة يمكن لجميع يتم التحقيق باستخدام هذه التقنية. في شبكية العين الماوس حديثي الولادة، وتطوير الأوعية الدموية في شبكية العين يحدث في الأسبوع الأول من الحياة بعد الولادة. الفئران، على عكس البشر، ولدوا مكفوفين وشبكية العين تصبح أوعية دموية فقط بعد الولادة. تنشأ الأوعية الشبكية من وسط إغلاق الشبكية إلى العصب البصري في يوم ما بعد الولادة 0 (P0)، وتطوير من قبل الأوعية الدموية لتشكيل تنظيم للغايةد الضفيرة الوعائية التي تصل إلى محيط الشبكية بنحو P8 5. الأوعية الدموية تطوير بطريقة مميزة مع الضفيرة الشعرية متزايد تدريجيا نحو الخارج من القرص البصري نحو المحيط الخارجي لتوليد نمط بالتناوب العادية من الشرايين والأوردة مع شبكة الشعرية التدخل. يوفر الأوعية الدموية في شبكية العين وهو نموذج مثالي لدراسة الأوعية الدموية والأوعية ويمكن التعرف عليها بسهولة لأنها تنمو في ما هو في الأساس طائرة 2D، مما يجعل من السهل نسبيا لفحص الأوعية الدموية في شبكية العين في الاستعدادات مسطحة جبل 5. وتم الإبلاغ عن طريقة لعزل شبكية العين الولدان الماوس لتحليل استجابات الخلايا البطانية طرف على مدى عدة ساعات خارج الجسم 6. بدلا من ذلك، تحقيقا أكثر تفصيلا من الأوعية الدموية في شبكية العين بأكملها وعلامات الأوعية الدموية المرتبطة بها يتطلب المناعية من العينات الشبكية الثابتة في مراحل مختلفة من التنمية. هنا نقدموصفا مفصلا لطريقة موثوقة وتقنيا على التوالي إلى الأمام التي نستخدمها لكامل تلطيخ جبل من الفئران الشبكية الوعائية الضفيرة، من قلع الأولي من العين بعد الولادة (انظر أيضا 7) من خلال بروتوكولات تلطيخ إلى التصوير النهائية تحت المجهر.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes 3 ml</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>PIP4210</td>
			<td>Remove tip with scissors to create a wide bore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 24-well plates</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>353226</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select Petri dishes TV 90 mm</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>SLS2002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histobond slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1336</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>501235</td>
			<td>Used for enucleation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td>Used for dissecting retina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td>Used for dissecting retina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crystal clear' tubes 2 ml</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1420-2000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876</td>
			<td>PBS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>PBS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td>PBS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Make up in 2x PBS and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7638</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Vector</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold anti-fade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21413</td>
			<td>Use at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21411</td>
			<td>Use at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Primary Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NG2 (rabbit polyclonal )</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Detects pericytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Detects astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>04-585</td>
			<td>Detects pericytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal )</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Detects vascular basement membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6198</td>
			<td>Detects vascular smooth muscle cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550546</td>
			<td>Detects endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td>Detects endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550548</td>
			<td>Detects endothelial cell junctions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alk1 (goat polyclonal)</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>AF770</td>
			<td>Detects endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Secondary Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-Alexa594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat-Alexa488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat-Alexa594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse-Alexa488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat-Alexa594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11058</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi SV6</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam HRc</td>
			<td>Camera for dissection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioimager with Apotome</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam HRm</td>
			<td>Camera for Axioimager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo

الأوعية الدموية هي عملية معقدة من جديد تشكيل الأوعية الدموية التي يحددها تنتشر الأوعية الدموية الجديدة من شبكة الأوعية الموجودة من قبل. الأوعية الدموية تلعب دورا رئيسيا ليس فقط في التطور الطبيعي للأعضاء وأنسجة، ولكن أيضا في كثير من الأمراض التي تشكل الأوعية الدموية هو dysregulated، مثل السرطان والعمى والأمراض الدماغية. في حياة الكبار، والأوعية الدموية هي هادئة عموما حتى الأوعية الدموية هو هدف هام لتطوير العقاقير الرواية في محاولة لتنظيم تشكيل السفينة الجديدة وتحديدا في المرض. من أجل فهم أفضل الأوعية الدموية، ووضع استراتيجيات ملائمة لتنظيم ذلك، يطلب من النماذج التي تعكس بدقة الخطوات البيولوجية المختلفة التي ينطوي عليها. يوفر شبكية العين حديثي الولادة الماوس نموذجا ممتازا من الأوعية الدموية بسبب الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية تطوير لتشكيل الضفيرة الوعائية خلال الأسبوع الأول بعد الولادة. يحتوي هذا النموذج أيضا الاستفادة من وجود اثنين من ديmensional (2D) هيكل صنع تحليل بسيط مقارنة مع التشريح المعقدة 3D من شبكات الأوعية الدموية الأخرى. من خلال تحليل الشبكية الوعائية الضفيرة في أوقات مختلفة بعد الولادة، فمن الممكن لمراقبة مراحل مختلفة من الأوعية الدموية تحت المجهر. توضح هذه المقالة إجراءات واضحة لتحليل الأوعية الدموية من شبكية العين باستخدام الماوس تلطيخ الفلورسنت مع الأجسام المضادة المحددة isolectin والأوعية الدموية.

بعد تشريح الشبكية يجب أن تبدو وكأنها زهرة شقة (الشكل 1). باستخدام بروتوكول، المشار إليها أعلاه، يمكن اعتبار الخلايا البطانية باستخدام isolectin تلطيخ B4-Alexa488 ودعم خلايا العضلات الوعائية هي تصور استخدام الألغام المضادة للأكتين العضلات الملساء ألفا (الشكل 2).</st...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo at JoVE.com

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

يوفر شبكية العين الفئران حديثي الولادة نموذجا الفسيولوجية تتميز كذلك من الأوعية الدموية، والذي يسمح التحقيقات عن دور الجينات المختلفة أو الأدوية التي تعدل الأوعية الدموية في<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; السياق. تلوين مناعي لتصور بدقة الضفيرة الوعائية هي محوريا في نجاح هذه الأنواع من الدراسات.

كله جبل تلوين مناعي للشبكية الفأر حديثي الولادة المعنية بالتحقيق في الأوعية الدموية<em&gt; في الجسم الحي</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

whole-mount-immunofluorescent-staining-neonatal-mouse-retina-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

45.3K Views.  Newcastle University. يوفر شبكية العين الفئران حديثي الولادة نموذجا الفسيولوجية تتميز كذلك من الأوعية الدموية، والذي يسمح التحقيقات عن دور الجينات المختلفة أو الأدوية التي تعدل الأوعية الدموية في في الجسم الحي السياق. تلوين مناعي لتصور بدقة الضفيرة الوعائية هي محوريا في نج...

Video: Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

التصور الجهاز العصبي الجنينية في جبل لالجامع ذبابة الفاكهة الأجنة

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

تشريح العين ماوس لجبل الجامعة للصبغات الظهارة الشبكية

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

كله جبل التصوير من جنين فأر التوقعات الحسية أكسون

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

التصحيح المشبك تسجيل من خلايا النجمي عديم الاستطالات في جبل شقة إعداد Deafferentated شبكية العين الفأر

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أدمغة

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

تصوير الفوتون عبر الحدقة في الجسم الحي لشبكية العين الفأرية

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells communicate with nerve fibers that carry this information to the brain. Because taste-transducing cells continuously die and are replaced throughout adulthood, the taste-bud environment is both complex and dynamic, requiring detailed analyses of its cell types, their locations, and any physical relationships between them. Detailed analyses have been limited by tongue-tissue heterogeneity and density that have significantly reduced antibody permeability. These obstacles require sectioning protocols that result in splitting taste buds across sections so that measurements are only approximated, and cell relationships are lost. To overcome these challenges, the methods described herein involve collecting, imaging, and analyzing whole taste buds and individual terminal arbors from three taste regions: fungiform papillae, circumvallate papillae, and the palate. Collecting whole taste buds reduces bias and technical variability and can be used to report absolute numbers for features including taste-bud volume, total taste-bud innervation, transducing-cell counts, and the morphology of individual terminal arbors. To demonstrate the advantages of this method, this paper provides comparisons of taste bud and innervation volumes between fungiform and circumvallate taste buds using a general taste-bud marker and a label for all taste fibers. A workflow for the use of sparse-cell genetic labeling of taste neurons (with labeled subsets of taste-transducing cells) is also provided. This workflow analyzes the structures of individual taste-nerve arbors, cell type numbers, and the physical relationships between cells using image analysis software. Together, these workflows provide a novel approach for tissue preparation and analysis of both whole taste buds and the complete morphology of their innervating arbors.

This paper describes methods for tissue preparation, staining, and analysis of whole fungiform, circumvallate, and palate taste buds that consistently yield whole and intact taste buds (including the nerve fibers that innervate them) and maintain the relationships between structures within taste buds and the surrounding papilla.

كامل جبل تلطيخ، والتصور، وتحليل الفطريات، Circumvallate، وبراعم طعم الحنك

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...