Diese Arbeit wurde von der Wellcome Trust und der British Heart Foundation.

Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht anders angegeben. 1. Enukleation und Fixierung der Augen Postnatale <ol><li> Zeigen human getötet Maus Welpe auf seiner Seite, entfernen Sie die Haut über dem Auge mit einer Schere. </li><li> Mit einer Schere und Pinzette, um das Auge entkernen. </li><li> Platz Schere unter dem entkernten Auge, schneiden Sie den Sehnerv und das umgebende Gewebe und heben Sie die Augen. In einen 24-Well-Platte mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in 2x PBS bei Raumtemperatur durchgeführt. </li><li> Lassen Sie jedes Auge für 10 fix - 15 min, dann kalt 2x PBS auf Eis übertragen für 5 - 10 min. Am besten ist es Enukleationen und anschließende Fixierung staffeln, um sicherzustellen, der Grad der Fixierung ist gleich für jedes Auge. </li></ol> 2. Dissektion Postnatale Murine Retinas <ol><li> Transfer-Augen in eine Petrischale mit 2x PBS mit einem Kunststoff-Pasteurpipette, das ausgeschnitten wurde, um die Bohrung und unter einer disse erweiternfesselndes Mikroskop. </li><li> Entfernen Sie das Fett um die Augen mit einer Pinzette und Schere. </li><li> Pierce der Rand der Hornhaut mit einer scharfen Schere und schneiden rund um die Hornhaut und Iris und entsorgen. </li><li> Legen Zange zwischen Netzhaut und Lederhaut und entfernen Sie die Lederhaut kümmert sich nicht um die Netzhaut zu reißen. Die Aderhaut Schicht kann auch entfernt werden, aber, wenn es die Gefahr einer Schädigung der Netzhaut, die während dieser Stufe wird die Aderhaut kann wie es sich nicht signifikant auf die Qualität der Immunfärbung gelassen werden. </li><li> Entfernen Sie die Linse und den Glaskörper mit einer Pinzette. </li><li> Entfernen Sie die hyaloids Schiffe durch das Sammeln von ihnen zusammen in der Mitte des Auges mit feinen Pinzette dann schnell ziehen weg von der Mitte der Netzhaut (alternativ snip an der Basis der hyaloid Schiffe mit einer feinen Schere). </li><li> Spülen Sie die schalenförmigen Netzhaut mit PBS in einer sauberen Petrischale. </li><li> Stellen 4 bis 5 radiale Einschnitte erreicht etwa 2/3 des Radius der Netzhaut durch Federkraft scissors zur Schaffung eines &quot;Blütenblatt&quot; Form. </li><li> Abziehen PBS mit einer Pasteurpipette auf die Netzhaut zu glätten, und dann entfernen Sie überschüssiges PBS mit einem kleinen Stück Löschpapier. </li><li> Langsam Pipette Kälte (-20 ° C) Methanol tropfenweise auf die Oberfläche der Netzhaut bis völlig bedeckt und dann mit zusätzlichen Flut Methanol. Dies wird dazu beitragen, um die Netzhaut zu fixieren und Permeabilisierung erleichtern. Die Netzhaut wird weiß. </li><li> Transfer zu einem 2-ml-Röhrchen mit einem Kunststoff-Pasteurpipette, das ausgeschnitten wurde, um die Bohrung zu erweitern. </li><li> Lassen Netzhaut in kaltem Methanol für mindestens 20 min, bevor Sie mit Immunfärbung. Von den Antikörpern verwendet hier nur VE-Cadherin nicht erfolgreich auf Methanol festen Netzhaut verwendet werden. In diesem Fall Netzhaut müssen gerade gehen Immunfärbung nach Schritt 9. </li><li> Falls erforderlich, kann Netzhaut in Methanol bei -20 ° C gelagert werden für bis zu mehrere Monate vor dem Färben. </li></ol> 3. Immuno / isolectin Färbung des Retinal Vascuschaftsgesetzgeber <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig / Methanol abgießen und vorsichtig abspülen Netzhaut kurz in PBS (in diesem Stadium die Netzhaut ist immer noch in der gleichen 2-ml-Röhrchen aus Schritt 11 oben). </li><li> PBS entfernen und Deckel Netzhaut mit 100 ul Perm / Blocks-Lösung (PBS + 0,3% + 0,2% Triton BSA) + 5% des entsprechenden Serums (siehe Tabelle 1) und leicht schütteln für 1 Stunde. </li><li> Entfernen Perm / Sperren und Inkubation Netzhaut unter leichtem Schütteln über Nacht bei 4 ° C mit 100 ul ausgewählten Primärantikörper (siehe Tabelle 1) und / oder IsolectinB4, alle durch Verdünnen in Perm / Blocks vorbereitet. </li><li> Entfernen Antikörper / isolectin und waschen Netzhaut 4 x 10 min in PBS + 0,3% Triton (PBSTX). </li><li> In einigen Fällen, z. B. nach einer Färbung mit IsolectinB4-Alexa488 oder einem direkt konjugierten primären Antikörper, einen sekundären Antikörper, nicht erforderlich, und Netzhaut kann direkt angebracht werden (Schritt 7). Bei einem nicht konjugierten primären Antikörper in Schritt 3 verwendet wurde, dann wurden 100 ul der entsprechenden fluorescent sekundären Antikörper (verdünnt 1/200 in PBSTX) zugegeben und links nach Inkubation bei 4 ° C oder für 4 h bei Raumtemperatur über Nacht. </li><li> Entfernen sekundären Antikörper und waschen Netzhaut 4 x 15 min in 2 ml PBSTX. </li><li> Übertragen Netzhaut auf Objektträger mit einem breiten Bohrung Kunststoff Pasteurpipette und entfernen Sie überschüssiges PBSTX mit saugfähigen Gewebe. Berg Netzhaut durch Zugabe von 50 ul verlängern Deckfluessigkeit auf einem Deckglas und sanft Position über die Netzhaut. </li><li> Die Objektträger zu Kühlschrank über Nacht bei 4 ° C, so dass sie flach und vor Licht geschützt sind, damit das Verlängern Deckfluessigkeit eingestellt. </li><li> Bild Netzhaut mit einem konfokalen Mikroskop oder eine Epifluoreszenzmikroskop. </li></ol>

<ol>
	<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Staton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+for+assaying+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo.">Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).</li><li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents.">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+retinal+vasculature.">Development of the retinal vasculature.</a> Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).</li><li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses.">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).</li><li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+eye+enucleation+for+remote+high-throughput+phenotyping.">Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping.</a> J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice.">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat. Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li><li>Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+expression+of+TGFbeta+type+II+receptor+is+required+to+maintain+vascular+integrity+during+postnatal+development+of+the+central+nervous+system.">Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system.</a> PLoS One. 7 (9), e39336 (2012).</li><li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+arteriovenous+malformations+in+the+absence+of+endoglin.">Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin.</a> Circ. Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).</li><li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).</li><li>Pi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+connective+tissue+growth+factor+in+the+retinal+vasculature+during+development+and+ischemia.">Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization.">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die hier vorgestellte Methode bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, Bilder von gefärbten whole mount Präparaten von Neugeborenen Maus Netzhaut zu erhalten, so dass es eine leicht quantifizierbar und physiologisch relevanten Modell der Angiogenese. Zunächst wird die Maus Auge kann es ziemlich schwierig zu sezieren aufgrund seiner geringen Größe und Kugelform, so dass einige der Praxis und gute Dissektion Werkzeuge für zuverlässige Ergebnisse erforderlich sind. Präparation der Augen in 2x Konzentration...

Die Angiogenese ist ein komplexer Entwicklungsprozess durch die Bildung neuer Blutgefäße aus einem bereits existierenden Schiffes Netzwerk definiert und ist durch mehrere Signalwege reguliert. Der prominenteste von ihnen ist der VEGF-Weg. VEGF wird von ischämischen Zellen und führt zur Einleitung der Angiogenese sprießen in benachbarte Blutgefäße freigesetzt. Die führende Endothelzellen aus einer neuen vaskulären Spross ist eine &quot;Spitze&quot; Zelle, die filopodia dass erreichen, in Richtung der Quelle von VEGF erzeugt und wird durch proliferierende &quot;Stiel&quot; Endothelzellen gefolgt. Auf diese Weise aktivierten Endothelzellen migrieren und proliferieren zu einer avaskuläre Region, wo sie neue Gefäßrohren bilden. Um diese Rohre zu stabilisieren, um den Blutfluss zu unterstützen, interagieren Endothelzellen mit Perizyten und glatte Muskelzellen, die die neuen Blutgefäße 1 umgeben. Angiogenese ist für die Vaskularisierung des Embryos und wachsende Gewebe. Allerdings trägt es auch zu vielen pathologischencal Erkrankungen wie Krebs, während Mängel in der Angiogenese mit ischämischen Erkrankungen. Die Entwicklung effektiver medikamentöser Behandlung, die Angiogenese als Mittel zur Behandlung von Krankheiten zu regulieren ist daher von großem Interesse. Zum Beispiel wird eine wirksame anti-angiogenen Faktoren reduzieren Krebswachstum, während proangiogene Strategien verwendet werden, um Ischämie zu behandeln. Somit sind Modelle der Angiogenese wichtig, ein besseres Verständnis der Regulation der Gefäßneubildung und für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu erhöhen oder zu verringern vaskulären Wachstum. Ein grundlegendes Element der Angiogenese Forschung ist die Wahl eines geeigneten Gefäß-Modell. Viele in vitro Modelle wurden entwickelt, um die grundlegenden Schritte der Angiogenese wie endotheliale Zellmigration, Proliferation und das Überleben 2,3 reproduzieren. Ein häufig in vitro-Assay verwendet wird, ist die Bildung eines verzweigten Netzes von Endothelzellen auf Matrigel Matrix, obwohl tsein ist nicht spezifisch für Endothelzellen, noch übernimmt sie in der Regel übernehmen die Unterstützung von Perizyten oder glatten Muskelzellen. Beurteilung der ex vivo Keimung Angiogenese mit Maus Orgelkultur wie Embryoidkörper Assay, der Aortenring-Assay und der fötalen Mittelfußknochen Assay erlaubt die Analyse von Angiogenese von Endothelzellen im Zusammenhang mit zusätzlichen Stützzellen. Allerdings sind die wichtigsten Einschränkungen dieser Assays die mangelnde Durchblutung und die Regression von Gefäßen im Laufe der Zeit, so dass eine begrenzte Fenster für die Analyse. Deshalb, um die Regulation der Angiogenese genauer zu verstehen, werden in-vivo-Modelle, wie sie in der Maus mit subkutan implantierten Schwämmen oder Matrigel Stecker entwickelt erforderlich, sowie die hinteren Gliedmaßen Ischämie-Modell. Allerdings sind diese Modelle schwierig zu analysieren aufgrund der komplexen 3D-Architektur der neovessels. Im Gegensatz dazu hat der Zebrafisch ein ausgezeichnetes Modell für die Visualisierung der Angiogenese in der ganzen bewährt4 Organismus. Allerdings ist die Maus evolutionär sehr viel enger als die menschliche Zebrafisch verwandt, um die Maus ein bevorzugtes Modell in vielen Fällen. Folglich Angiogenese der postnatalen Maus Netzhaut stellt eine gut charakterisierte Methode der Wahl für die Angiogenese Forschung. Sie ermöglicht nicht nur eine physiologische Umgebung, sondern auch ein 2D Gefäßplexus, die leicht sichtbar gemacht werden können unter Verwendung von geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen. Die Architektur des Schiffes Netzwerk Endothelproliferation, sprießen, perivaskuläre Zellrekrutierung und Gefäß Umbau kann allen untersuchten mit dieser Technik werden. In der Neugeborenen-Maus Netzhaut tritt Entwicklung der Blutgefäße der Netzhaut in der ersten Woche der postnatalen Leben. Mäuse, im Gegensatz zum Menschen, der blind geboren werden und die Netzhaut nur vascularized werden nach der Geburt. Retinal Schiffe ergeben sich aus der Mitte der Netzhaut in der Nähe des Sehnervs bei postnatalen Tag 0 (P0) und die Entwicklung von Angiogenese zur Bildung eines sehr anzuordnen,d Gefäßplexus, die Netzhautperipherie erreicht um etwa 5 P8. Blutgefäßen entwickeln in charakteristischer Weise mit der Kapillarplexus allmählich und ausgehend von der optischen Platte in Richtung der Peripherie ein regelmäßiges alternierendes Muster von Arterien und Venen mit einem dazwischen kapillares Netzwerk zu erzeugen. Das retinale Gefäßsystem ein ideales Modellsystem, um die Angiogenese als die Gefäße leicht identifiziert werden, da sie, was im Wesentlichen in einer 2D-Ebene wachsen zu untersuchen, wodurch es relativ einfach, die retinalen Gefäße in flach-mount Zubereitungen 5 untersuchen. Verfahren zur Isolierung der Maus Neugeborenen Netzhaut zur Analyse der endothelialen Zell-Antworten Spitze über mehrere Stunden ex vivo wurde 6 gemeldet. Alternativ erfordert eine genauere Untersuchung des gesamten Gefäßsystems der Netzhaut und damit verbundene vaskuläre Marker Immunfärbung von festen Proben Netzhaut in verschiedenen Stadien der Entwicklung. Hier bieten wir Ihneneine detaillierte Beschreibung eines zuverlässigen und technisch geradlinig Methode, die wir verwenden für whole mount Färbung des murinen retinalen vaskulären Plexus, von der ersten Enukleation der postnatalen Auge (siehe auch 7) durch die Färbeprotokolle zur endgültigen Bildgebung unter dem Mikroskop.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes 3 ml</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>PIP4210</td>
			<td>Remove tip with scissors to create a wide bore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 24-well plates</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>353226</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select Petri dishes TV 90 mm</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>SLS2002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histobond slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1336</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>501235</td>
			<td>Used for enucleation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td>Used for dissecting retina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td>Used for dissecting retina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crystal clear' tubes 2 ml</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1420-2000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876</td>
			<td>PBS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>PBS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td>PBS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Make up in 2x PBS and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7638</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Vector</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold anti-fade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21413</td>
			<td>Use at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21411</td>
			<td>Use at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Primary Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NG2 (rabbit polyclonal )</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Detects pericytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Detects astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>04-585</td>
			<td>Detects pericytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal )</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Detects vascular basement membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6198</td>
			<td>Detects vascular smooth muscle cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550546</td>
			<td>Detects endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td>Detects endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550548</td>
			<td>Detects endothelial cell junctions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alk1 (goat polyclonal)</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>AF770</td>
			<td>Detects endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Secondary Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-Alexa594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat-Alexa488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat-Alexa594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse-Alexa488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat-Alexa594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11058</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi SV6</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam HRc</td>
			<td>Camera for dissection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioimager with Apotome</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam HRm</td>
			<td>Camera for Axioimager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo

Angiogenese ist der komplexe Prozess der Bildung neuer Blutgefäße durch die Sprossen neuer Blutgefäße aus einem bereits existierenden Schiffes Netzwerk definiert. Angiogenese spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der normalen Entwicklung von Organen und Geweben, sondern auch in vielen Krankheiten, bei denen die Bildung von Blutgefäßen ist dysregulated, wie Krebs, Blindheit und ischämischen Erkrankungen. Im Erwachsenenalter sind die Blutgefäße in der Regel Ruhestrom so Angiogenese ist ein wichtiges Ziel für neuartige Medikamentenentwicklung zu versuchen und zu regulieren Gefäßneubildung gezielt in Krankheit. Um besser zu verstehen, Angiogenese und geeignete Strategien zu regulieren entwickeln werden Modelle benötigt, die genau die verschiedenen biologischen Schritte, die beteiligt sind. Die Maus Neugeborenen Netzhaut bietet ein hervorragendes Modell der Angiogenese, weil Arterien, Venen und Kapillaren zu entwickeln, um eine Gefäßplexus während der ersten Woche nach der Geburt bilden. Dieses Modell hat auch den Vorteil, dass ein zwei-didimensionale (2D)-Struktur-Analyse machen einfach im Vergleich mit der komplexen 3D-Anatomie der anderen vaskulären Netzwerken. Durch die Analyse der retinalen Gefäßplexus zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Geburt, ist es möglich, die verschiedenen Phasen der Angiogenese unter dem Mikroskop zu beobachten. Dieser Artikel beschreibt eine einfaches Verfahren zur Analyse des Gefäßsystems einer Maus Netzhaut unter Verwendung von fluoreszierenden Färbung mit isolectin und vaskuläre spezifische Antikörper.

Nach Präparation der Netzhaut sollte wie eine flache Blume (Abbildung 1) zu suchen. Durch die Verwendung des Protokolls skizzierten können Endothelzellen gesehen mit isolectin B4-Alexa488 Färbung und Unterstützung vaskulären Muskelzellen visualisiert mit anti-alpha Glattmuskelaktin (Abbildung 2). Die Low-Power-Ansicht mit einem 5X Ziel in 2 ermöglicht einen Überblick über das vaskuläre Organisation der Netzhaut. Auch indem Sie eine andere Kombination von Antik?...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo at JoVE.com

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine erlaubt<em&gt; In vivo</em&gt; Kontext. Immunfluoreszenzfärbung genau visualisieren die Gefäßplexus ist entscheidend für den Erfolg dieser Art von Studien.

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

whole-mount-immunofluorescent-staining-neonatal-mouse-retina-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

45.5K Aufrufe.  Newcastle University. Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine erlaubt In vivo Kontext. Immunfluoreszenzfärbung genau visualisieren die Gefäßplexus ist entscheidend für den Erfolg dieser Art von Studien.

Serie: Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DiI-Markierung von DRG-Neuronen zu Study Axonal Branching in einer Whole Mount Vorbereitung von embryonalen Maus-Spinal Cord

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Beurteilung der Gefäß Regeneration im ZNS Verwenden der Maus Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-Mount-Imaging von Mouse Embryo Sinnes Axon Projektionen

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

Ganze Berge Kennzeichnung von Cilia im Hauptriechsystem der Mäuse

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Patch-Clamp-Aufzeichnung von Starburst-Amakrinzellen in einer Wohnung Montage Herstellung von Deafferentated Maus Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells communicate with nerve fibers that carry this information to the brain. Because taste-transducing cells continuously die and are replaced throughout adulthood, the taste-bud environment is both complex and dynamic, requiring detailed analyses of its cell types, their locations, and any physical relationships between them. Detailed analyses have been limited by tongue-tissue heterogeneity and density that have significantly reduced antibody permeability. These obstacles require sectioning protocols that result in splitting taste buds across sections so that measurements are only approximated, and cell relationships are lost. To overcome these challenges, the methods described herein involve collecting, imaging, and analyzing whole taste buds and individual terminal arbors from three taste regions: fungiform papillae, circumvallate papillae, and the palate. Collecting whole taste buds reduces bias and technical variability and can be used to report absolute numbers for features including taste-bud volume, total taste-bud innervation, transducing-cell counts, and the morphology of individual terminal arbors. To demonstrate the advantages of this method, this paper provides comparisons of taste bud and innervation volumes between fungiform and circumvallate taste buds using a general taste-bud marker and a label for all taste fibers. A workflow for the use of sparse-cell genetic labeling of taste neurons (with labeled subsets of taste-transducing cells) is also provided. This workflow analyzes the structures of individual taste-nerve arbors, cell type numbers, and the physical relationships between cells using image analysis software. Together, these workflows provide a novel approach for tissue preparation and analysis of both whole taste buds and the complete morphology of their innervating arbors.

This paper describes methods for tissue preparation, staining, and analysis of whole fungiform, circumvallate, and palate taste buds that consistently yield whole and intact taste buds (including the nerve fibers that innervate them) and maintain the relationships between structures within taste buds and the surrounding papilla.

Färbung, Visualisierung und Analyse von Fungiform-, Circumvallate- und Gaumengeschmacksknospen

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...