فإن الكتاب أود أن أشكر أدرين موسلي وLibuse Jerabek (ستانفورد) للحصول على المساعدة مع تقنية جراحية.

أجريت جميع الدراسات على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان واستخدام UCLA والمعاهد الوطنية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. مدة الإجراء هو موضح أدناه حوالي 45-60 دقيقة من البداية إلى النهاية. 1. إعداد حقل الجراحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ الإجراء في غرفة الجراحة الحيوانية نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعدات: isoflurane ومبخر، Gaymer T مضخة مع سادة التدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدوات معقمة: اثنين ملقط المنحني، مقص غرامة، حامل الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب استخدام القفازات المعقمة أثناء إجراء بأكمله. </li></ol> 2. إعداد الحيوانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اثنين من الفئران الذكور أو الإناث، من نفس الخلفية الوراثية، من وزن وحجم مماثل في نفس القفص ومراقبة لمدة أسبوعين على الأقل لضمان التعايش المتناغم. ويفضل إناث الفئران بسبب سلوكهم أقل عدوانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوانات قبلباستخدام المرذاذ isoflurane و. توصيل مكان الفئران في غرفة التعريفي POSI الختم إلى المرذاذ isoflurane و(4-5٪ ت / ت). مرة واحدة هو فعل التخدير، ونقل الحيوان إلى منطقة الحلاقة الفراء والحفاظ على التخدير في جميع أنحاء الداخلي من خلال مخروط الأنف متصلة isoflurane و(1.5-2٪ ت / ت). تطبيق مرهم للعين مع Q-تلميح لمنع جفاف العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان على موقف ضعيف. بدقة حلق الجانب الأيسر من الفأرة وضعت على اليسار وعلى الجانب الأيمن من الفأرة وضعت على الحق ابتداء من الساعة حوالي 1 سم فوق الكوع الى 1 سم تحت الركبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جو معقم و مطهر المناطق حلق بواسطة المسح بدقة (2-3X) مع مناديل غارقة بتدين تليها مناديل الكحول. وضع الفئران على وسادة ساخنة بواسطة وسادة عقيمة تغطيتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتسكين وإدارة كاربروفين والبوبرينورفين تحت الجلد أو الغشاء البريتونى بجرعة 10 ملغ / كغ و 0.1 ملغم / كغم على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوانات في جانبهم، والعودة إلى الوراء، معdjacent المناطق حلق مواجهة. لتجنب أي تلوث المنطقة الجراحية، وتغطية الفئران مع ثنى العقيمة تعريض منطقة العملية فقط. إنشاء فتح الستارة الصغيرة للبقاء معقمة عند إجراء الجراحة. التي قطعناها على أنفسنا نافذة الستارة الكبيرة لديها رؤية أفضل خلال تصوير بالفيديو. </li></ol> 3. تعايش التصاقي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص حاد، وإجراء شقوق الجلد طولية على الجانبين حلق كل حيوان في البداية 0.5 سم فوق الكوع على طول الطريق إلى 0.5 سم تحت مفصل الركبة (الشكل 1). بعد شق، فصل بلطف الجلد من اللفافة تحت الجلد من خلال عقد الجلد مع زوج من ملقط المنحني وفصل اللفافة مع الزوج الثاني لخلق 0.5 سم من الجلد الحرة. تنفيذ هذا الفصل على طول شق بأكمله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الانضمام عن طريق ربط الزج الأيسر من حيوان واحد إلى الزج حق الآخر. كلا olecranons ومفاصل الركبة بشكل واضح ال تمييزها التاليه شق الجلد. لتسهيل الانضمام، ثني الكوع من الفأرة الأولى وتمرير الإبرة من غير قابل للامتصاص 3-0 خياطة تحت الزج. وبالمثل، ثني الكوع من الفأرة الثانية وتمرير نفس خياطة تحته. نعلق المفاصل بإحكام بواسطة عقدة جراحية مزدوجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط مفاصل الركبة باتباع نفس الإجراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحجز على المفاصل، وربط الجلد من الحيوانات اثنين مع استمرار امتصاص 5-0 VICRYL خياطة بدءا البطني من الكوع نحو الركبة. لمنع تمزق الجلد وفصل إجراء إغلاق خياطة ضيق من الجلد في المنطقة المحيطة المرفقين والركبتين. مرة واحدة وقد تم الانتهاء المرفق الجلد البطني، إجراء العمليات الجراحية عقدة مزدوجة. وضع الفئران في وضعية الانبطاح ومواصلة ظهريا خياطة تنتهي مع عقدة جراحية مزدوجة. التحقق من استمرارية خياطة والتأكد من عدم وجود فتحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدارة 0.5 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم تحت الجلد لكل فأر لمنع dehydration. </li></ol> 4. الانتعاش بعد العملية الجراحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الحيوانات على لوحة ساخنة حتى الشفاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتعاش، وتوفير المسكنات كاربروفين والبوبرينورفين. تكرار الغشاء البريتونى أو تحت الجلد كل 24 ساعة و 12، على التوالي، لمدة 48 ساعة في نفس الجرعات الموصوفة أعلاه (الخطوة 2.5). مراقبة الحيوانات لعلامات الألم والضيق مثل الهز، والخمول، ومضغ الذيل، وتقوس الظهر، وعدم الاستمالة، الخ يوميا على مدى أسبوعين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقائي، علاج الفئران مع سلفاميثوكسازول / ميثوبريم تعليق عن طريق الفم في زجاجة المياه الخاصة بهم 2 ملغ السلفا / مل +0.4 ملغ تقليم / مل لمدة 10 يوما لمنع العدوى البكتيرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيت كل زوج التعايش الالتصاقي في قفص نظيفة مع المواد الفراش متجانسة (مثل منشفة ورقية أو وسادة ماصة معقمة) لمنع تطلع المواد الفراش. عودة الحيوانات إلى الفراش شغل قفص عندما تكون قادرة على الحفاظ على الاستلقاء القصية مع رؤوسهم فوق. لتقليل الإجهادللوصول للغذاء في حين ضبط لوجود التعايش الالتصاقي، ضع الغذاء الكريات مبلل في الطابق القفص. توفير مواد التعشيش. في 1-2 أسابيع الفئران التعايش الالتصاقي لديها القدرة على تجول عادة على إقران جراحيا الصدارة وهند-أطرافه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخيمرية الدم يحدث 10-14 أيام بعد الجراحة. </li></ol> 5. تأكيد والإجراءات عكسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد رسم أسبوعين الدم من الأوردة ذيل كل فأر لتحليل تدفق cytometric لتأكيد الخيمرية الدم (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجهيز الدم لتحليل تدفق cytometric: تمييع 2-3 قطرات من الدم في 500 ميكرولتر من 10 ملي EDTA. إضافة 500 ميكرولتر من 2٪ ديكستران (المخفف في برنامج تلفزيوني)، تخلط جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. نقل طاف في أنبوب جديد، وتدور في 1،200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق و resuspend الخلايا مكعبات في برنامج تلفزيوني (أو عازلة أخرى) لتحليل تدفق cytometric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على التصميم التجريبي، ويمكن فصل الزوج على التعايش الالتصاقير نقاط وقت لاحق. في تجربتنا، وحرصنا على الحفاظ أزواج parabiosed لمدة تصل إلى 9 أشهر دون أي مضاعفات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ الإجراء العكسي على سطح الجراحية المعقمة. تخدير الفئران عن طريق وضعها في غرفة تحريض متصلة المرذاذ isoflurane و(4-5٪) والحفاظ على التخدير مع 1.5-2٪ isoflurane و، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشعر من المنطقة المحيطة خياطة الأولية وإعداد جو معقم و مطهر المناطق حليق كما هو موضح أعلاه (الخطوات 2.3، 2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتسكين وإدارة كاربروفين والبوبرينورفين تحت الجلد أو الغشاء البريتونى بجرعة 10 ملغ / كغ و 0.1 ملغم / كغم على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية المنطقة الجراحية مع ثنى العقيمة كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص حاد، وفصل الفئران من خلال شق طولي على طول الخيط الجانبي وفصل بلطف اللفافة التي شكلت حديثا بين اثنين من الفئران مع زوج من ملقط المنحني. للفصل بين المفاصل، وخفض عقدة من خياطةربطها. تقليم قبالة الجلد على طول شق لتحقيق حواف ناعمة وأعد الجلد مع امتصاص المستمر 5-0 المغلفة VICRYL خياطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمنع الجفاف، وإدارة 0.5 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم تحت الجلد لكل فأر. إبقاء الحيوانات على لوحة ساخنة حتى الشفاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الشفاء، كرر إدارة مسكن، كاربروفين (10 ملغ / كلغ) كل 24 ساعة والبوبرينورفين (0.1 ملغ / كلغ) كل 12 ساعة لمدة 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمنع العدوى البكتيرية علاج الفئران مع سلفاميثوكسازول / ميثوبريم تعليق عن طريق الفم (2 ملغ السلفا / مل +0.4 ملغ تقليم / مل) في زجاجة المياه الخاصة بهم لمدة 10 يوما. </li></ol>

<ol>
	<li>Bert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exp&#233;riences+et+consid&#233;rations+sur+la+greffe+animale.">Exp&#233;riences et consid&#233;rations sur la greffe animale.</a> Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 .</li><li>Bunster, E., Meyer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+of+parabiosis.">Improved methods of parabiosis.</a> Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).</li><li>Waskow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+parabiotic+mice+for+the+study+of+DC+and+DC+precursor+circulation.">Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation.</a> Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).</li><li>Finerty, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parabiosis+in+physiological+studies.">Parabiosis in physiological studies.</a> Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).</li><li>Aicher, A., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonbone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells:+what+is+their+exact+location.">Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location.</a> Circ. Res. 101, e102 (2007).</li><li>Abe, S., Boyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+derived+from+the+circulation+contribute+to+the+repair+of+lung+injury.">Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).</li><li>Donskoy, E., Goldschneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymocytopoiesis+is+maintained+by+blood-borne+precursors+throughout+postnatal+life.+A+study+in+parabiotic+mice.">Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice.</a> J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).</li><li>Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+between+Intestinal+epithelial+cells+and+macrophages+in+a+cancer+context+results+in+nuclear+reprogramming.">Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming.</a> Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).</li><li>Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+parabiosis+skin+transplantation+model+in+mice.">A transient parabiosis skin transplantation model in mice.</a> Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).</li><li>Ajami, B., Bennett, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+self-renewal+can+sustain+CNS+microglia+maintenance+and+function+throughout+adult+life.">Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life.</a> Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).</li><li>Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+the+H-Y+antigen:+Requirement+for+male+T+cells,+but+not+B+cells,+to+induce+tolerance+in+neonatal+female+mice.">Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice.</a> Transplantation. 37, 3-6 (1984).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

طريقة تعايش التصاقي مناقشتها هنا يقدم الحد الأدنى من الصعوبات الفنية والنتائج في معدلات وفيات منخفضة. المرفق الركبة والكوع المفاصل هو تحسن كبير من Bunster وتقنية ماير. ومع ذلك، لا يزال الإجراء الغازية وبالتالي الحفاظ على ظروف معقمة طوال جراحة أمر حتمي. لمزيد من منع العد...

تعايش التصاقي، والانضمام إلى العمليات الجراحية في اثنين من الكائنات الحية، وكان أول وصف في عام 1864 من قبل بول بيرت باعتبارها وسيلة لتطوير نموذج لدراسة نظم الدورة الدموية المشتركة وتتألف من الانضمام للجلد والعضلات جدران اثنين من الفئران 1. تعايش التصاقي يعزز تشكيل الأوعية الدموية الدقيقة في موقع الالتهاب 3 وكان العديد من التطبيقات في الدراسات الفسيولوجية، مثل الاتصالات الهرمونية بين الغدة النخامية والغدد التناسلية وكذلك دور الكلى في ارتفاع ضغط الدم 4. واستخدمت كذلك للتحقيق في التوظيف ودمج الخلايا الاصلية في اتساع الأوعية الدموية 5، والهجرة من الخلايا الجذعية المكونة للدم 6، والاتجار اللمفاويات 7، وكذلك دور وحركية تعميم الخلايا الالتهابية أو وقف في الورم ورم خبيث 8،9، ومرض الاعصاب 10. واحدة ميزة كبيرة من الأكاذيب تعايش التصاقيفي أن الحيوانات شراكة تقاسم المستضدات الشائعة المتداولة، مما يسمح الهجرة الخلية واتساع الأوعية الدموية دون إحداث رد فعل مناعي. الأهم من ذلك، ويسمان وآخرون أظهرت أن تعايش التصاقي بين الفئران الذكور والإناث لا يؤدي إلى تشكيل الأجسام المضادة المضادة HY 11. في البروتوكول الأصلي التي وصفها بول بيرت وانضم الحيوانات اثنين معا من خلال اتصال الجلد والعضلات الجدران 1. ولكن هذه الطريقة تسبب ضغطا كبيرا على الحيوانات وأسفرت عن ارتفاع معدل الوفيات بسبب إصابة الجرح. منذ ذلك الحين، تم تعديل أسلوب تعايش التصاقي من قبل عدة مجموعات مع أبرزها هو موضوع البروتوكول المقترح من قبل Bunster وماير في عام 1933 2. وشملت طريقتهم الانضمام للمفاصل الكتف، تجاويف الجسم، والجلد، والسماح أفضل الدعم وألم أقل للحيوانات. في نفس الوقت، أدت الطريقة الجديدة في مجال الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية والحد الأدنى من دلالةانخفضت معدلات وفيات آبير. بروتوكول الموصوفة هنا هو تعديل للتقنية Bunster وماير التي هي أقل الغازية ويسمح الانضمام أكثر ثباتا. وهي ترتبط الفئران من خلال مفاصل الكوع والركبة وكذلك الجلد. هذا الانضمام يمنع تمديد الجلد وبالتالي يسبب ألم أقل والمضاعفات. نحن هنا وصف انضمامه من نوع البرية (WT) الماوس الكبار إلى GFP التأسيسي معربا عن الماوس. وتبين لنا أن أسبوعين بعد الجراحة يمكن أن نحقق 50٪ من الخيمرية الدم مما يدل على فعالية هذا الإجراء الجراحي لإنشاء نظام الدورة الدموية المشتركة.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane-Phoenix</td>
			<td>Clipper</td>
			<td>NDC 57319-559-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Seal Induction Chamber</td>
			<td>Molecular Imaging Products</td>
			<td>AS-01-0530-SM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Anesthesia System</td>
			<td>Molecular Imaging Products</td>
			<td>AS-01-0007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaymer T Pump</td>
			<td>Gaymar Industries, Inc</td>
			<td>TP650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming Blanket (Heating pad)</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>TP-22G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>FST 14063-09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>FST 12501-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical shaver</td>
			<td>Oster</td>
			<td>Golden A5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parabiosis in mice: a detailed protocol

تعايش التصاقي هو اتحاد الجراحية اثنين من الكائنات السماح تقاسم الدورة الدموية. ربط الجلد من حيوانين يعزز تشكيل الأوعية الدموية الدقيقة في موقع الالتهاب. شركاء التعايش الالتصاقي مشاركة مستضدات المتداولة، وبالتالي خالية من رد فعل جهاز المناعة السلبية. وصف لأول مرة من قبل بول بيرت في عام 1864 1، وقد تم صقل الجراحة تعايش التصاقي بواسطة Bunster وماير في عام 1933 لتحسين البقاء على قيد الحياة الحيوانية 2. في البروتوكول الحالي، وانضم اثنين من الفئران جراحيا بعد تعديل Bunster وتقنية ماير. ترتبط الحيوانات من خلال مفاصل الكوع والركبة تليها مرفق من الجلد يمكن دعم قوي يحول دون الضغط على الجلد خياطة. هنا، نحن تصف بالتفصيل التعايش الالتصاقي الانضمام من كل مكان معربا عن GFP الماوس إلى البرية من نوع (WT) الماوس. بعد أسبوعين من الإجراء، يتم فصل زوج، ويمكن الكشف عن الخلايا GFP إيجابية من خلال تحليل تدفق cytometric في circulat الدمايون من الفأرة WT. والخيمرية الدم يسمح احد لدراسة إسهام الخلايا المنتشرة من حيوان واحد في الآخر.

نتائج المتوقعة للتعايش التصاقي اثنين من الكائنات هو مساهمة متساوية من نظام الدورة الدموية كل حيوان إلى الدورة الدموية شيوعا (الشكل 2). يمكن للمرء أن تحقق بسهولة موازنة ناجحة من دم الفئران WT وGFP إيجابية parabiosed عن طريق تحليل تدفق cytometric. هنا، تم الحصول على الدم ال...

Watch this Scientific Journal Video about Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol at JoVE.com

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

التعايش الالتصاقي انضمام اثنين من الكائنات الحية يؤدي إلى تطوير نظام الدورة الدموية المشتركة. في هذا البروتوكول، ونحن تصف الخطوات الجراحية لتشكيل التعايش الالتصاقي اتصال بين الماوس من النوع البري والتأسيسية، معربا عن GFP الماوس.

تعايش التصاقي في الفئران: بروتوكول مفصل

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

74.0K Views.  University of California, Los Angeles.  التعايش الالتصاقي انضمام اثنين من الكائنات الحية يؤدي إلى تطوير نظام الدورة الدموية المشتركة. في هذا البروتوكول، ونحن تصف الخطوات الجراحية لتشكيل التعايش الالتصاقي اتصال بين الماوس من النوع البري والتأسيسية، معربا عن GFP الماوس. 

Video: Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

اختبار الإجهاد ترير الاجتماعي بروتوكول لإحداث الضغط النفسي

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body temperature that is observed during fever. The use of hyperthermia as an adjuvant has emerged as a promising procedure for tumor regression in the field of cancer biology. For this purpose, the most important requirement is to have reliable and uniform heating protocols. We have developed a protocol for hyperthermia (whole body) in mice. In this protocol, animals are exposed to cycles of hyperthermia for 90 min followed by a rest period of 15 min. During this period mice have easy access to food and water. High body temperature spikes in the mice during first few hyperthermia exposure cycles are prevented by immobilizing the animal. Additionally, normal saline is administered in first few cycles to minimize the effects of dehydration. This protocol can simulate fever like conditions in mice up to 12-24 hr. We have used 8-12 weeks old BALB/Cj female mice to demonstrate the protocol.

This paper describes a protocol for whole body hyperthermia in mice that can stimulate fever like conditions up to 12-24 hr.

بروتوكول لونغ ارتفاع الحرارة المدة الجسم الجامع في الفئران

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

Collection Protocol for Human Pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation of pancreas recovered from cadaveric organ donors. The pancreas is divided into 3 main regions (head, body, tail) followed by serial transverse sections throughout the medial to lateral axis. Alternating sections are used for fixed paraffin and fresh frozen blocks and remnant samples are minced for snap frozen sample preparations, either with or without RNAse inhibitors, for DNA, RNA, or protein isolation. The overall goal of the pancreas dissection procedure is to sample the entire pancreas while maintaining anatomical orientation.
Endocrine cell heterogeneity in terms of islet composition, size, and numbers is reported for human islets compared to rodent islets 1. The majority of human islets from the pancreas head, body and tail regions are composed of insulin-containing &beta;-cells followed by lower proportions of glucagon-containing &alpha;-cells and somatostatin-containing &delta;-cells. Pancreatic polypeptide-containing PP cells and ghrelin-containing epsilon cells are also present but in small numbers. In contrast, the uncinate region contains islets that are primarily composed of pancreatic polypeptide-containing PP cells 2. These regional islet variations arise from developmental differences. The pancreas develops from the ventral and dorsal pancreatic buds in the foregut and after rotation of the stomach and duodenum, the ventral lobe moves and fuses with the dorsal 3. The ventral lobe forms the posterior portion of the head including the uncinate process while the dorsal lobe gives rise to the rest of the organ. Regional pancreatic variation is also reported with the tail region having higher islet density compared to other regions and the dorsal lobe-derived components undergoing selective atrophy in type 1 diabetes4,5.
Additional organs and tissues are often recovered from the organ donors and include pancreatic lymph nodes, spleen and non-pancreatic lymph nodes. These samples are recovered with similar formats as for the pancreas with the addition of isolation of cryopreserved cells. When the proximal duodenum is included with the pancreas, duodenal mucosa may be collected for paraffin and frozen blocks and minced snap frozen preparations.

This video demonstrates a dissection procedure for processing human pancreas into multiple storage formats. Anatomical orientation is maintained throughout the pancreatic regions to allow definition of regional islet composition and density.

بروتوكول لجمع البنكرياس الإنسان

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

الحقن الشريان السباتي لوأضافا الدوائية وتحليل Taxanes في الفئران

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

بسيطة الحرجة الحجم فخذي عيب النموذجي في الفئران

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals. This article introduces a standard protocol used to induce aortic aneurysms via subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) from implanted osmotic pumps. This protocol includes calculation of AngII amount and dissolution, osmotic pump filling, implantation of osmotic pumps subcutaneously, observation after pump implantation, and harvest of aortas to visualize aortic aneurysms in mice. Subcutaneous infusion of AngII through osmotic pumps following this protocol is a reliable and reproducible technique to induce both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice. Infusion durations range from a few days to several months based on the purpose of the study. AngII 1,000 ng/kg/min is sufficient to provide maximal effects on abdominal aortic aneurysmal formation in male hypercholesterolemic mouse models such as apolipoprotein E deficient or low-density lipoprotein receptor deficient mice. Incidence of abdominal aortic aneurysms induced by AngII infusion via osmotic pumps is 5 - 10 times lower in female hypercholesterolemic mice and also lower in both genders of normocholesterolemic mice. In contrast, AngII-induced thoracic aortic aneurysms in mice are not hypercholesterolemia or gender-dependent. Importantly, multiple features of this mouse model recapitulate those of human aortic aneurysms.

Subcutaneous implantation of osmotic pumps provides a convenient approach for prolonged and consistent delivery of compounds. This approach has been used extensively to study both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice.

تحت الجلد أنجيوتنسين II تسريب باستخدام الأسموزي مضخات يقنع الأورطي تمدد الأوعية الدموية في الفئران

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

خطوة بالبروتوكول الخطوة لجراحة تحت الشبكية في الأرانب

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Creation of Abdominal Adhesions in Mice

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or intraabdominal infection. The precise mechanisms underlying adhesion formation are poorly understood. Many compounds and physical barriers have been tested for their ability to prevent adhesions after surgery with varying levels of success. The mouse and rat are important models for the study of abdominal adhesions. Several different techniques for the creation of adhesions in the mouse and rat exist in the literature. Here we describe a protocol utilizing abrasion of the cecum with sandpaper and sutures placed in the right abdominal sidewall. The mouse is anesthetized and the abdomen is prepped. A midline laparotomy is created and the cecum is identified. Sandpaper is used to gently abrade the surface of the cecum. Next, several figure-of-eight sutures are placed into the peritoneum of the right abdominal sidewall. The abdominal cavity is irrigated, a small amount of starch is applied, and the incision is closed. We have found that this technique produces the most consistent adhesions with the lowest mortality rate.

Abdominal adhesions that form after surgery are a major cause of pain, infertility, and hospitalization and reoperation for small bowel obstruction. Our surgical procedure for creating abdominal adhesions in mice is a reliable tool to study the mechanisms underlying the formation of adhesions.

إنشاء البطن التصاقات في الفئران

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or ...

A Repetitive Concussive Head Injury Model in Mice

Despite the concussion/ mild traumatic brain injury (mTBI) being the most frequent occurrence of traumatic brain injury, there is still a lack of knowledge on the injury and its effects. To develop a better understanding of concussions, animals are often used because they provide a controlled, rigorous, and efficient model. Studies have adapted traditional animal models to perform mTBI to stimulate mild injury severity by changing the injury parameters. These models have been used because they can produce morphologically similar brain injuries to the clinical condition and provide a spectrum of injury severities. However, they are limited in their ability to present the identical features of injuries in patients. Using a traditional impact system, a repetitive concussive injury (rCHI) model can induce mild to moderate human-like concussion. The injury degree can be determined by measuring the period of loss of consciousness (LOC) with a sign of a transient termination of breathing. The rCHI model is beneficial to use for its accuracy and simplicity in determining mTBI effects and potential treatments.

Concussion presents the most common type of traumatic brain injury. Therefore, a repetitive concussive animal model, which replicates the important features of an injury in patients, may provide a means to study concussion in a rigorous, controlled, and efficient manner.

والمتكرر الارتجاج إصابات الرأس النموذجي في الفئران

Despite the concussion/ mild traumatic brain injury (mTBI) being the most frequent occurrence of traumatic brain injury, there is still a lack of ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the patients are unaware of such disorders or are having difficulty expressing their symptoms. Until now, several devices for perspiration monitoring have been developed; however, such devices tend to have a relatively large exterior, considerable power consumption, and/or less sensitivity.
Recently, we developed a small, wireless device for perspiration monitoring. The device consists of a temperature/relative humidity (T/RH) sensor, battery-driven small data logger, and silica gel as a desiccant in a small cylindrical exterior. The T/RH sensor is placed between the detection windows (through which the water vapor from the skin enters) and the silica gel. The underlying principle of the perspiration monitoring device is based on Fick&#39;s law of diffusion, which means that water vapor flux from the skin to the silica gel (i.e.&#160;transepidermal water loss and perspiration) can be captured by change in humidity at the T/RH sensor. In addition, a baseline subtraction method was adopted to distinguish perspiration and transepidermal water loss.
As shown in the previous report, the developed device can monitor the perspiration at any sites of the body in an easy, wireless manner. However, detailed methods of how to use the device have not been disclosed yet. In this article, therefore, we would like to show the point-by-point tutorials of how to use the device for perspiration monitoring, by showing the sympathetic activity test with the sympathetic skin response monitoring as an example.

Recently, we developed a small wireless device for perspiration monitoring. In this article, we present detailed protocols on how to use the device for perspiration monitoring with an example of the sympathetic activity test.

بروتوكول مفصل لرصد العرق عن طريق رواية والصغيرة، جهاز لاسلكي

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...