המחברים מבקשים להודות לAdriane מוזלי וLibuse ג&#39;רבק (סטנפורד) לקבלת סיוע בטכניקה הניתוחית.

כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות של ועדת הטיפול בבעלי החיים ושימוש של UCLA והמכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. משך הזמן של ההליך המתואר להלן הוא כ 45-60 דקות מהתחלה ועד הסוף. 1. הכנה של שדה כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הליך בחדר ניתוח של בעלי החיים נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד: מאדה isoflurane, Gaymer T משאבה עם כרית חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלים סטריליים: שני מלקחיים מעוקלים, מספריים בסדר, בעל מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפפות סטריליות יש להשתמש במהלך ההליך כולו. </li></ol> 2. הכנת בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שני עכברי זכר או נקבה, מאותו הרקע גנטי, של משקל וגודל דומים באותו הכלוב ולפקח לשבועות לפחות, כדי להבטיח חיים משותפים והרמוניים. נקבות עכברים הם העדיפו בשל ההתנהגות פחות האגרסיבית שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים על ידיבאמצעות אידוי isoflurane. מקום עכברים בPOSI-חותם אינדוקציה הלשכה מחוברים לאידוי isoflurane (4-5% V / V). לאחר ההרדמה מושרה, להעביר את בעלי החיים לאזור גילוח הפרווה ולשמור על ההרדמה בכל ההליך באמצעות חרטומו מחובר לisoflurane (1.5-2% V / V). החל משחת עיניים עם Q-טיפ כדי למנוע יובש בעיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה במצב שכיבה. יסודיות לגלח את צד השמאל של העכבר ממוקם בצד השמאל וצד ימין של העכבר ממוקם בצד הימין מתחיל בכ 1 סנטימטר מעל המרפק עד 1 סנטימטר מתחת לברך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סביבה נקיה מחיידקים להכין את האזורים המגולחים ידי ניגוב יסודי (2-3x) עם מגבונים ספוגים פולידין ואחרי מגבוני אלכוהול. מניחים את העכברים על משטח מחומם המכוסה במשטח סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיכוך כאבים, לנהל Carprofen ועצירות intraperitoneally או תת עורית במינון של 10 מ&quot;ג / קילוגרם ו0.1 מ&quot;ג / קילוגרם בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בעלי חיים בצד שלהם, גב אל גב, עםdjacent אזורים מגולחים פונים כלפי מעלה. כדי להימנע מכל זיהום של אזור הניתוח, לכסות את העכברים עם וילון סטרילי חושף רק את אזור הניתוח. ליצור פתח וילון קטן להישאר סטרילי בעת ביצוע הניתוח. אנחנו עשינו את חלון הווילון גדול שתהיינה לי צפייה טובה יותר בצילום וידאו. </li></ol> 3. Parabiosis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מספריים חדים, לבצע חתכים בעור אורך לצדדים המגולחים של כל התחלה של בעלי חיים ב0.5 סנטימטר מעל המרפק כל הדרך ל0.5 סנטימטר מתחת למפרק הברך (איור 1). בעקבות החתך, בעדינות לנתק את העור מfascia תת עורית על ידי מחזיק את העור עם זוג מלקחיים מעוקלים ולהפריד את fascia עם זוג שני כדי ליצור 0.5 סנטימטר של עור בחינם. לבצע הפרדה זו לכל אורך החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הצטרפותו על ידי הצמדת olecranon השמאלית של חיה אחת לolecranon זכותו של האחר. olecranons ומפרקי הברך שניהם בצורה ברורה ה הבאה להבחיןחתך בעור דואר. כדי להקל על הצטרפותו, לכופף את המרפק של העכבר הראשון ולהעביר את המחט של 3-0 התפר שאינו נספג מתחת olecranon. בדומה לכך, לכופף את המרפק של העכבר השני ולהעביר את אותו התפר מתחתיה. צרף מפרקים בחוזקה על ידי קשר כפול כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מפרקי הברך בעקבות אותו ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות החיבור של המפרקים, לחבר את העור של שתי חיות עם תפר נספג רציף 5-0 Vicryl מתחיל ventrally מהמרפק לכיוון הברך. כדי למנוע קרע בעור והפרדה לבצע סגירת תפר הדוקה של העור באזור שסביב המרפקים והברכיים האזור. ברגע שהקובץ מצורף עור הגחון הושלם, לבצע קשר כפול כירורגית. מקם את העכברים במצב המועדים ולהמשיך dorsally התפר שהסתיימה עם קשר כפול כירורגית. בדוק את ההמשכיות של התפר ולאשר את חוסר פתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל 0.5 מיליליטר של .0.9% NaCl תת עורי לכל עכבר כדי למנוע dehydration. </li></ol> 4. החלמה לאחר ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על חיות על משטח מחומם עד להחלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התאוששות, לספק carprofen משככי כאבים ועצירות. חזור intraperitoneally או תת עורי כל שעה 24 ו12, בהתאמה, עבור 48 שעות באותו המינון שתואר לעיל (שלב 2.5). לפקח על בעלי חיים לסימנים של כאב ומצוקה, כגון טלטול, עייפות, לעיסה של זנב, קימר את גבה, חוסר הטיפוח, וכו &#39;ביום למשך שבועיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prophylactically, טיפול בעכברים עם השעיה אוראלית sulfamethoxazole / Trimethoprim בבקבוק המים שלהם 2 מ&quot;ג סולפה / מיליליטר +0.4 מ&quot;ג לקצץ מיליליטר / ל10 ימים כדי למנוע זיהומים חיידקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בית כל זוג parabiotic בכלוב נקי עם חומר מונוליטי מצעים (מגבת נייר למשל או משטח סטרילי סופג) כדי למנוע שאיפה של חומר מצעים. להחזיר את בעלי החיים לכלוב מצעים מלאים כאשר הם מסוגלים לשמור על עינת חזה עם הראש שלהם למעלה. כדי למזער את המתחלהגיע למזון, תוך התאמה לקיום parabiotic, הנח את כדורי מזון הרטיב על רצפת הכלוב. לספק חומר קינון. ב1-2 שבועות יש עכברים parabiotic יכולת ambulate בדרך כלל על קדמיים ואחורי-גפיים לזווג בניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> chimerism הדם מתרחש 10-14 ימים שלאחר הניתוח. </li></ol> 5. אישור והליך הפוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שבועיים להקיז דם מורידי הזנב של כל עכבר לניתוח הזרימה cytometric כדי לאשר chimerism דם (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד דם לצורך ניתוח התזרים cytometric: לדלל 2-3 טיפות של דם ב500 μl של 10 mM EDTA. הוסף 500 μl של דקסטראן 2% (בדילול מלא PBS), ומערבב היטב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מעביר את supernatant בצינור חדש, ספין על 1,200 סל&quot;ד במשך 5 דקות ו resuspend תאי pelleted ב PBS (או חיץ אחר) לניתוח התזרים cytometric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לתכנון ניסוי, ניתן להפריד את זוג parabiotict נקודות זמן מאוחר יותר. מניסיוננו, יש לנו לשמור זוגות parabiosed לתקופה של עד 9 חודשים ללא כל סיבוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הליך הפוך על משטח כירורגי סטרילי. הרדימי עכברים ידי הצבת אותם בחדר אינדוקציה המחובר לאידוי isoflurane (4-5%) ולשמור על הרדמה עם isoflurane 1.5-2%, כפי שתואר לעיל (שלב 2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר שיער מהאזור המקיף את התפר הראשוני וסביבה נקיה מחיידקים להכין את האזורים המגולחים כפי שתואר לעיל (שלבים 2.3, 2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיכוך כאבים, לנהל Carprofen ועצירות intraperitoneally או תת עורית במינון של 10 מ&quot;ג / קילוגרם ו0.1 מ&quot;ג / קילוגרם, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה אזור ניתוח עם וילון סטרילי כפי שתואר לעיל (שלב 2.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים חדים, להפריד את העכברים דרך חתך אורכים עם התפר לרוחב ועדינות לנתק את fascia שהוקם בין שני העכברים עם זוג מלקחיים מעוקלים. כדי להפריד את המפרקים, לחתוך את קשרים של התפרהקושר אותם. חתוך את העור לאורך החתך כדי להשיג קצוות חלקים ולצרף עור עם תפר נספג רציף 5-0 מצופה Vicryl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת למנוע התייבשות, לנהל 0.5 מיליליטר של .0.9% מתחת לעור NaCl לכל עכבר. לשמור על חיות על משטח מחומם עד להחלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאוששות, חוזר ממשל משכך כאבים, כל (0.1 מ&quot;ג / קילוגרם) 24 שעות ועצירות carprofen (10 מ&quot;ג / קילוגרם) בכל שעות 12 ל48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע זיהומים חיידקיים טיפול בעכברים עם ההשעיה sulfamethoxazole / Trimethoprim אוראלי (2 סולפה מ&quot;ג / מיליליטר +0.4 מ&quot;ג לקצץ / מיליליטר) בבקבוק המים שלהם ל10 ימים. </li></ol>

<ol>
	<li>Bert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exp&#233;riences+et+consid&#233;rations+sur+la+greffe+animale.">Exp&#233;riences et consid&#233;rations sur la greffe animale.</a> Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 .</li><li>Bunster, E., Meyer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+of+parabiosis.">Improved methods of parabiosis.</a> Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).</li><li>Waskow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+parabiotic+mice+for+the+study+of+DC+and+DC+precursor+circulation.">Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation.</a> Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).</li><li>Finerty, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parabiosis+in+physiological+studies.">Parabiosis in physiological studies.</a> Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).</li><li>Aicher, A., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonbone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells:+what+is+their+exact+location.">Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location.</a> Circ. Res. 101, e102 (2007).</li><li>Abe, S., Boyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+derived+from+the+circulation+contribute+to+the+repair+of+lung+injury.">Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).</li><li>Donskoy, E., Goldschneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymocytopoiesis+is+maintained+by+blood-borne+precursors+throughout+postnatal+life.+A+study+in+parabiotic+mice.">Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice.</a> J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).</li><li>Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+between+Intestinal+epithelial+cells+and+macrophages+in+a+cancer+context+results+in+nuclear+reprogramming.">Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming.</a> Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).</li><li>Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+parabiosis+skin+transplantation+model+in+mice.">A transient parabiosis skin transplantation model in mice.</a> Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).</li><li>Ajami, B., Bennett, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+self-renewal+can+sustain+CNS+microglia+maintenance+and+function+throughout+adult+life.">Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life.</a> Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).</li><li>Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+the+H-Y+antigen:+Requirement+for+male+T+cells,+but+not+B+cells,+to+induce+tolerance+in+neonatal+female+mice.">Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice.</a> Transplantation. 37, 3-6 (1984).</li></ol>

יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

שיטת parabiosis דנה כאן מציגה קשיים מינימאליים טכניים ותוצאות בשיעורי תמותה נמוכות. הקובץ המצורף של מפרקי הברך ומרפק הוא שיפור משמעותי של Bunster והטכניקה מאייר. עם זאת, ההליך נותר פולשני ובכך שמירה על תנאים סטריליים לאורך כל הניתוח היא הכרחית. כדי למנוע זיהום של האתר כירורג?...

Parabiosis, כירורגית הצטרפותו של שני אורגניזמים, תואר לראשונה בשנת 1864 ידי פול ברט כדרך לפתח מודל ללמוד מערכות מחזור הדם משותפות וכללה את הצטרפותו של העור וקירות שריריים של שתי חולדות 1. Parabiosis מקדם היווצרות של נימי דם באתר של דלקת 3 ויש לו כמה יישומים במחקרים פיסיולוגיים, כגון תקשורת הורמונלית בין בלוטת יותרת המוח ובלוטות המין, כמו גם את תפקידו של כליות יתר לחץ דם 4. זה כבר מועסק נוסף כדי לחקור את הגיוס ושילוב של תאי אב בneovascularization 5, הגירה של תאי גזע hematopoietic 6, וסחר הלימפוציטים 7, כמו גם את התפקיד וקינטיקה של מחזורי תאים דלקתיים או תאי גזע בגרורות סרטניים 8,9, ומחלות ניווניות 10. יתרון משמעותי אחד משקרי parabiosisשבחי השותפות לשתף אנטיגנים במחזור משותפים, המאפשרים נדידת תאים וneovascularization בלי לעורר תגובה חיסונית. חשוב לציין, וייסמן ואח&#39;. הראו parabiosis שבין עכברי זכרים ונקבה אינו מביא להיווצרות של ח.י. אנטי נוגדני 11. בפרוטוקול המקורי שתואר על ידי פול ברט שני בעלי החיים חוברו יחדיו באמצעות חיבור של העור ושרירים קירות 1. שיטה זו לעומת זאת, גרמה למתח משמעותי לבעלי החיים וגרמה לתמותה גבוהה עקב זיהום של הפצע. מאז טכניקת parabiosis תוקן על ידי מספר קבוצות עם השולט ביותר להיות הפרוטוקול שהוצע על ידי Bunster ומאייר ב -1933 2. השיטה שלהם כללה הצטרפות של מפרקי עצם השכם, חללים בגוף, ועור, ומאפשר תמיכה טובה יותר ופחות כאב לבעלי החיים. במקביל, השיטה החדשה הביאה לטיפול שלאחר ניתוח מינימאלי ומובהקcantly ירידה בשיעורי תמותה. הפרוטוקול המתואר כאן הוא שינוי של טכניקת Bunster והמאיירת שהיא פחות פולשני ומאפשרת הצטרפות מוצקה יותר. כלומר, מחוברים עכברים דרך מפרקי מרפק והברך, כמו גם את העור. הרחבה זו מצטרפת מונעת מהעור ולכן גורמת פחות כאבים וסיבוכים. כאן אנו מתארים את הצטרפותו של סוג בר עכבר בוגר (ט &#39;) לGFP מכונן המבטא עכבר. אנו מראים כי שבועיים לאחר ניתוח אנחנו יכולים להשיג 50% מchimerism הדם הממחישים את היעילות של פרוצדורה כירורגית זו כדי ליצור מערכת דם משותפת.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane-Phoenix</td>
			<td>Clipper</td>
			<td>NDC 57319-559-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Seal Induction Chamber</td>
			<td>Molecular Imaging Products</td>
			<td>AS-01-0530-SM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Anesthesia System</td>
			<td>Molecular Imaging Products</td>
			<td>AS-01-0007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaymer T Pump</td>
			<td>Gaymar Industries, Inc</td>
			<td>TP650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming Blanket (Heating pad)</td>
			<td>Kent Scientific Corp</td>
			<td>TP-22G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>FST 14063-09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>FST 12501-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical shaver</td>
			<td>Oster</td>
			<td>Golden A5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parabiosis in mice: a detailed protocol

Parabiosis הוא איחוד כירורגית של שני אורגניזמים המאפשרים שיתוף של זרימת הדם. מצרף את העור של שתי חיות מקדם היווצרות של נימי דם באתר של דלקת. שותפי Parabiotic לשתף אנטיגנים במחזור שלהם ולכן הם חופשיים של תגובה חיסונית שלילית. תואר לראשונה על ידי פול ברט בשנת 1864 1, ניתוח parabiosis היה מעודן על ידי Bunster ומאייר ב -1933 כדי לשפר את ההישרדות של בעלי החיים 2. בפרוטוקול הנוכחי, שני עכברים בניתוח הצטרפו הבא שינוי של Bunster והטכניקה מאייר. בעלי חיים מחוברים באמצעות מפרקי המרפק והברך ואחרי חיבור של העור ומאפשר תמיכה איתנה המונעת עומס על העור נתפר. בזאת, אנו מתארים בפירוט את parabiotic הצטרפותו של ה-GFP בכל מקום להביע את העכבר לסוג בר עכבר (WT). שבועיים לאחר ההליך, הזוג מופרד וניתן לאתר תאי GFP החיוביים על ידי ניתוח התזרים cytometric בcirculat הדםיון של עכבר WT. Chimerism הדם מאפשר לבחון את תרומתם של התאים במחזור מחיה אחת בשנייה.

התוצאה הצפויה של parabiosis של שני אורגניזמים היא התרומה שווה של מערכת הדם של כל חיה לזרימת דם נפוצה (איור 2). אפשר בקלות לאמת את האיזון המוצלח של דמם של העכברים החיוביים parabiosed WT וה-GFP על ידי ניתוח התזרים cytometric. הנה, דם ורידים הושג מהזנבות של שני parabionts ב2 שבועות לאחר ה...

Watch this Scientific Journal Video about Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol at JoVE.com

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabiotic הצטרפותו של שני אורגניזמים מוביל להתפתחותה של מערכת דם משותפת. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הצעדים כירורגית כדי ליצור חיבור בין parabiotic עכבר wild-type ועכבר-GFP-לבטא מכונן.

Parabiosis בעכברים: פרוטוקול מפורט

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

73.5K Views.  University of California, Los Angeles.  Parabiotic הצטרפותו של שני אורגניזמים מוביל להתפתחותה של מערכת דם משותפת. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הצעדים כירורגית כדי ליצור חיבור בין parabiotic עכבר wild-type ועכבר-GFP-לבטא מכונן. 

Video: Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

מבחן הלחץ החברתי טרייר פרוטוקול גרימת לחץ פסיכולוגי

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body temperature that is observed during fever. The use of hyperthermia as an adjuvant has emerged as a promising procedure for tumor regression in the field of cancer biology. For this purpose, the most important requirement is to have reliable and uniform heating protocols. We have developed a protocol for hyperthermia (whole body) in mice. In this protocol, animals are exposed to cycles of hyperthermia for 90 min followed by a rest period of 15 min. During this period mice have easy access to food and water. High body temperature spikes in the mice during first few hyperthermia exposure cycles are prevented by immobilizing the animal. Additionally, normal saline is administered in first few cycles to minimize the effects of dehydration. This protocol can simulate fever like conditions in mice up to 12-24 hr. We have used 8-12 weeks old BALB/Cj female mice to demonstrate the protocol.

This paper describes a protocol for whole body hyperthermia in mice that can stimulate fever like conditions up to 12-24 hr.

פרוטוקול ליפרתרמיה הארוכה משך כל גוף בעכברים

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

Collection Protocol for Human Pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation of pancreas recovered from cadaveric organ donors. The pancreas is divided into 3 main regions (head, body, tail) followed by serial transverse sections throughout the medial to lateral axis. Alternating sections are used for fixed paraffin and fresh frozen blocks and remnant samples are minced for snap frozen sample preparations, either with or without RNAse inhibitors, for DNA, RNA, or protein isolation. The overall goal of the pancreas dissection procedure is to sample the entire pancreas while maintaining anatomical orientation.
Endocrine cell heterogeneity in terms of islet composition, size, and numbers is reported for human islets compared to rodent islets 1. The majority of human islets from the pancreas head, body and tail regions are composed of insulin-containing &beta;-cells followed by lower proportions of glucagon-containing &alpha;-cells and somatostatin-containing &delta;-cells. Pancreatic polypeptide-containing PP cells and ghrelin-containing epsilon cells are also present but in small numbers. In contrast, the uncinate region contains islets that are primarily composed of pancreatic polypeptide-containing PP cells 2. These regional islet variations arise from developmental differences. The pancreas develops from the ventral and dorsal pancreatic buds in the foregut and after rotation of the stomach and duodenum, the ventral lobe moves and fuses with the dorsal 3. The ventral lobe forms the posterior portion of the head including the uncinate process while the dorsal lobe gives rise to the rest of the organ. Regional pancreatic variation is also reported with the tail region having higher islet density compared to other regions and the dorsal lobe-derived components undergoing selective atrophy in type 1 diabetes4,5.
Additional organs and tissues are often recovered from the organ donors and include pancreatic lymph nodes, spleen and non-pancreatic lymph nodes. These samples are recovered with similar formats as for the pancreas with the addition of isolation of cryopreserved cells. When the proximal duodenum is included with the pancreas, duodenal mucosa may be collected for paraffin and frozen blocks and minced snap frozen preparations.

This video demonstrates a dissection procedure for processing human pancreas into multiple storage formats. Anatomical orientation is maintained throughout the pancreatic regions to allow definition of regional islet composition and density.

אוסף פרוטוקול לבלב אנוש

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

חליטות עורק הראשי לpharmacokinetic וpharmacodynamic ניתוח של taxanes בעכברים

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

דגם פגם עצם הירך קריטית בגודל פשוט בעכברים

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Heterotopic Renal Autotransplantation in a Porcine Model: A Step-by-Step Protocol

Kidney transplantation is the treatment of choice for patients suffering from end-stage renal disease. It offers better life expectancy and higher quality of life when compared to dialysis. Although the last few decades have seen major improvements in patient outcomes following kidney transplantation, the increasing shortage of available organs represents a severe problem worldwide. To expand the donor pool, marginal kidney grafts recovered from extended criteria donors (ECD) or donated after circulatory death (DCD) are now accepted for transplantation. To further improve the postoperative outcome of these marginal grafts, research must focus on new therapeutic approaches such as alternative preservation techniques, immunomodulation, gene transfer, and stem cell administration.
Experimental studies in animal models are the final step before newly developed techniques can be translated into clinical practice. Porcine kidney transplantation is an excellent model of human transplantation and allows investigation of novel approaches. The major advantage of the porcine model is its anatomical and physiological similarity to the human body, which facilitates the rapid translation of new findings to clinical trials. This article offers a surgical step-by-step protocol for an autotransplantation model and highlights key factors to ensure experimental success. Adequate pre- and postoperative housing, attentive anesthesia, and consistent surgical techniques result in favorable postoperative outcomes. Resection of the contralateral native kidney provides the opportunity to assess post-transplant graft function. The placement of venous and urinary catheters and the use of metabolic cages allow further detailed evaluation. For long-term follow-up studies and investigation of alternative graft preservation techniques, autotransplantation models are superior to allotransplantation models, as they avoid the confounding bias posed by rejection and immunosuppressive medication.

Porcine models of organ transplantation provide an important platform to study mechanisms of organ preservation. This article describes a heterotopic porcine renal autotransplantation model, which allows investigating new approaches to improve the outcome of transplantation using marginal kidney grafts.

Heterotopic כליה Autotransplantation במודל חזירי: פרוטוקול צעד-אחר-צעד

Kidney transplantation is the treatment of choice for patients suffering from end-stage renal disease. It offers better life expectancy and higher quality ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

צעד אחר פרוטוקול שלב לכירורגיה subretinal בארנבונים

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Creation of Abdominal Adhesions in Mice

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or intraabdominal infection. The precise mechanisms underlying adhesion formation are poorly understood. Many compounds and physical barriers have been tested for their ability to prevent adhesions after surgery with varying levels of success. The mouse and rat are important models for the study of abdominal adhesions. Several different techniques for the creation of adhesions in the mouse and rat exist in the literature. Here we describe a protocol utilizing abrasion of the cecum with sandpaper and sutures placed in the right abdominal sidewall. The mouse is anesthetized and the abdomen is prepped. A midline laparotomy is created and the cecum is identified. Sandpaper is used to gently abrade the surface of the cecum. Next, several figure-of-eight sutures are placed into the peritoneum of the right abdominal sidewall. The abdominal cavity is irrigated, a small amount of starch is applied, and the incision is closed. We have found that this technique produces the most consistent adhesions with the lowest mortality rate.

Abdominal adhesions that form after surgery are a major cause of pain, infertility, and hospitalization and reoperation for small bowel obstruction. Our surgical procedure for creating abdominal adhesions in mice is a reliable tool to study the mechanisms underlying the formation of adhesions.

יצירת הידבקויות בטן עכברים

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the patients are unaware of such disorders or are having difficulty expressing their symptoms. Until now, several devices for perspiration monitoring have been developed; however, such devices tend to have a relatively large exterior, considerable power consumption, and/or less sensitivity.
Recently, we developed a small, wireless device for perspiration monitoring. The device consists of a temperature/relative humidity (T/RH) sensor, battery-driven small data logger, and silica gel as a desiccant in a small cylindrical exterior. The T/RH sensor is placed between the detection windows (through which the water vapor from the skin enters) and the silica gel. The underlying principle of the perspiration monitoring device is based on Fick&#39;s law of diffusion, which means that water vapor flux from the skin to the silica gel (i.e.&#160;transepidermal water loss and perspiration) can be captured by change in humidity at the T/RH sensor. In addition, a baseline subtraction method was adopted to distinguish perspiration and transepidermal water loss.
As shown in the previous report, the developed device can monitor the perspiration at any sites of the body in an easy, wireless manner. However, detailed methods of how to use the device have not been disclosed yet. In this article, therefore, we would like to show the point-by-point tutorials of how to use the device for perspiration monitoring, by showing the sympathetic activity test with the sympathetic skin response monitoring as an example.

Recently, we developed a small wireless device for perspiration monitoring. In this article, we present detailed protocols on how to use the device for perspiration monitoring with an example of the sympathetic activity test.

פרוטוקול מפורט עבור ניטור זיעה באמצעות רומן, קטן, מכשיר אלחוטי

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...

A Detailed Protocol for Physiological Parameters Acquisition and Analysis in Neurosurgical Critical Patients

Intracranial pressure (ICP) monitoring is now widely used in neurosurgical critical patients. Besides mean ICP value, the ICP derived parameters such as ICP waveform, amplitude of pulse (AMP), the correlation of ICP amplitude and ICP mean (RAP), pressure reactivity index (PRx), ICP and arterial blood pressure (ABP) wave amplitude correlation (IAAC), and so on, can reflect intracranial status, predict prognosis, and can also be used as guidance of proper treatment. However, most of the clinicians focus only on the mean ICP value while ignoring these parameters because of the limitations of the current devices. We have recently developed a multimodality monitoring system to address these drawbacks. This portable, user-friendly system will use a data collecting and storing device to continuously acquire patients&#39; physiological parameters first, i.e., ABP, ICP, and oxygen saturation, and then analyze these physiological parameters. We hope that the multimodality monitoring system will be accepted as a key measure to monitor physiological parameters, to analyze the current clinical status, and to predict the prognosis of the neurosurgical critical patients.

Recently, we have developed a portable multimodality monitoring system for the monitoring of various physiological parameters in neurosurgical critical patients. Detailed protocols on how to use this multimodality monitoring system are presented here.

פרוטוקול מפורט עבור פרמטרים פיזיולוגיים של רכישת ניתוח בחולים קריטיים הנוירוכירורגית

Intracranial pressure (ICP) monitoring is now widely used in neurosurgical critical patients. Besides mean ICP value, the ICP derived parameters such as ...