وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 DK091526 (JO)، جبهة الخلاص الوطني 0852416 (DTE)، ومشروع شيكاغو للسكري.

1. إعداد الفشوت ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح C57BL / 6 الفئران وعزل الجزر عن طريق الهضم كولاجيناز وFicoll الفصل المتدرج الكثافة. (راجع المواد المشار إليها في JOVE 2،3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الجزر في المتوسط ​​RPMI-1640 تحتوي على 10٪ FBS، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، و 20 ملي HEPES في أطباق بتري (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2). بعد العزلة، والجزر الثقافة لمدة 24 ساعة قبل استخدامها في التجارب. استخدام الجزر في غضون 1-2 أيام لضمان تحقيق نتائج متسقة. </li></ol> 2. جعل منهاج ميكروفلويديك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد هندستها المجهرية على photomasks الشفافية لكل طبقة الجهاز: 1) مدخل ومخرج، 2) طبقة ميكروفلويديك الجلوكوز مع غرفة perifusion (8 مم × 3 مم، 150 ميكرولتر)، 3) 200 ميكرون الغشاء مع microwells (500 ميكرون القطر، 100 ميكرون عميق)، و 4) طبقات ميكروفلويديك الغاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتلفيق طبقة مدخل ومخرج، صب degassed، PDMS خلط لعلى ارتفاع 1.5 مم في طبق بيتري فارغة والعلاج في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. لكمة 2 مم الإدخال / خارج الموانئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتلفيق طبقة ميكروفلويديك الجلوكوز، وتدور اثنين 350 ميكرون طبقات من SU8-2150 لتشكيل واحدة 700 ميكرون طبقة على 4 في رقاقة السيليكون. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشف ضوء الأشعة فوق البنفسجية من خلال الضوئية المناسبة لنقل نمط متناهية على SU8 بعد التطوير، وانتاج 700 ميكرون سيد طويل القامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب degassed، PDMS خلط على هذا الماجستير إلى ارتفاع 3 ملم وعلاج في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. خفض هذا PDMS لتشكيل بشفرة حلاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكمة 2 مم منافذ الإدخال / الإخراج فضلا عن غرفة قطر 8 مم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الى افتعال غشاء 200 ميكرون مع microwells، وتدور SU8-2100-100 ميكرون. تطبيق نفس الأشعة فوق البنفسجية الطباعة الحجرية لنقل أنماط microwell على هذا 100 ميكرومتر سيد طويل القامة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور degassed، خلط PDMS على هذا الماجستير في 900 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية وعلاج عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. الصبانطبقة نا الثانية على رأس الأولى باستخدام نفس الظروف، مما أدى إلى 200 ميكرون PDMS الغشاء تحتوي على أنماط microwell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكمة 2 مم منافذ الإدخال / الإخراج من خلال هذا الغشاء </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتلفيق طبقة ميكروفلويديك الغاز، وتدور SU8-2100-100 ميكرون. تطبيق نفس الأشعة فوق البنفسجية الطباعة الحجرية لنقل الغاز أنماط ميكروفلويديك على هذا 100 ميكرومتر سيد طويل القامة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب degassed، PDMS خلط على هذا الماجستير إلى ارتفاع 1.5 مم وعلاج في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. قطع PDMS لتشكيل بشفرة حلاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكمة 2 مم منافذ الإدخال / الإخراج من خلال هذه الطبقة </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لسندات طبقات متعددة، إعدادهم عن طريق تنظيف مع الاسكتلندي، وفضح لالاكليل القوس، ومن ثم مواءمة باليد بالترتيب التالي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السندات الغشاء إلى طبقة الغاز أسفل مع microwells مواجهة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السندات وميكروفلويديك الجلوكوز على رأس الغشاء microwell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السندات مدخل ومخرج طبقة سن أعلى جدا، التغليف والتجميع كله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعزيز الترابط بإضافة 1 كجم الوزن على رأس والخبز في 100 درجة مئوية لمدة 3 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسرب اختبار الجهاز الانتهاء من تحميل الماء في الطبقة المائية، ثم غمر الجهاز بأكمله تحت الماء. ثم، وتدفق الهواء من خلال طبقة الغاز مع حقنة فارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الأجهزة تسرب خالية مع الايثانول 70٪ من خلال طبقة مائي ثم مطاردة مع برنامج تلفزيوني العازلة، والتي يتم تخزينها في الجهاز على 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. </li></ol> 3. إعداد Microdispenser <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على 2 microdispensers، 5 V و 20 V إمدادات الطاقة العاصمة، ومجلس I / O الرقمية لبناء خلط الأكسجين والإعداد التسليم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الخيوط سيطرة microdispensers &#39;إلى وحدات السائق المدرجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط السائقين إلى الرقمي الأول / O المجلس في الموانئ المقابلة لضوابط ابفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل إمدادات الطاقة 5 V و 20 V إلى جهات الاتصال على محرك أحادي المقابلةنهاية الخبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الرقمية I / O إلى جهاز كمبيوتر محمول لتنفيذ رموز ابفيف للسيطرة على الغاز (الملحق). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاتصال microdispenser إلى النيتروجين في حين آخر لالهواء المضغوط، سواء مع 5٪ CO 2. تعيين كل الغازات إلى 2 رطل. عقف مخرجات موزعات &#39;في تي تقاطع قبل دخول الجهاز ميكروفلويديك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام جهاز اختبار التسرب، تميز استجابة عابرة التشكيل الأكسجين من قبل ركوب الدراجات في microdispensers بين 5-21٪ من الأكسجين، بينما قياس الأوكسجين المذاب في الماء مع جهاز استشعار الأكسجين الألياف البصرية (انظر قائمة المعدات ونتائج ممثل). </li></ol> 4. إعداد في المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب جهاز لمرحلة ساخنة على مجهر مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاتصال 0٪ و 21٪ O 2 الغازات إلى الجهاز ومعايرة مع مستشعر الاوكسجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط ميناء إخراج على microfluidics الجلوكوز إلى جامع الكسر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد بيكربونات كريبس قارع الأجراسالعازلة (KRB): 129 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 مم 3 NaHCO، 4.7 ملي بوكل، 1.2 ملي KH 2 PO 4، 1 مم CaCl 2 · 2H 2 O، 1.2 ملي MgSO 4 · 7H 2 O، 10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7،35-7،40 ، 2 ملي الجلوكوز القاعدية، و 5٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حلين العازلة التي تحتوي على 2 ملي و 14 ملي الجلوكوز على التوالي في أنابيب مخروطية 50 مل استحم في 37 ° C حمام الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل مضخة تحوي رسم العازلة في 250 ميكرولتر / دقيقة في الأنابيب. تدفق أنابيب على موقد 37 درجة مئوية قبل دخول الجهاز ميكروفلويديك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على الجزر، إضافة FURA-2 صباحا في DMSO وRh123 في الإيثانول بنسبة 100٪ إلى 2 مل من KRB لتصل إلى تركيزات صبغ النهائي من 5 ميكرومتر و 2.5 ميكرومتر، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الجزر مع ماصة 10 ميكرولتر واحتضان في الأصباغ لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل ما يقرب من 20 الجزر في الجهاز عبر مدخل متناهية الجلوكوز. توجيه الجزر في غرفة عازلة بواسطة فتيلة من مأخذ مرة أخرى إلى رانه مدخل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي الجزر في المخزن لمدة 10 دقيقة ليغسل الأصباغ الزائدة. </li></ol> 5. تشغيل الأوكسجين في وقت واحد والجلوكوز تحفيز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسليم نبض التحفيز الجلوكوز مع 5 دقائق من خط الأساس التي وضعتها KRB2، تليها 15 دقيقة من 14 ملي التحفيز، ثم يغسل لمدة 15 دقيقة في KRB2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل 340/380 نانومتر الإثارة الطول الموجي للFURA-2 و 534 الانبعاثات لRh123. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل قياسات النبض الطبيعي (14 ملي normoxic) قبل كل تجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعديل الأكسجين (نقص الأكسجة / نقص الأكسجين متقطعة)، لا تنطبق إلا تدفق العازلة خلال التحفيز وغسل الخطوات وأي تدفق في خطوات أخرى، لتقليل الحمل الحراري الاضطرابات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع النفايات السائلة من منفذ الجلوكوز في فترات 1 دقيقة لفحص ELISA الأنسولين. </li></ol>

<ol>
	<li>Lo, J. F., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Preconditioning+via+Multimodal+Microfluidic+Modulation+of+Intermittent+Hypoxia.">Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).</li><li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pancreatic+Islet+Isolation:+Part+I:+Digestion+and+Collection+of+Pancreatic+Tissue.">Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue.</a> J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).</li><li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pancreatic+Islet+Isolation:+Part+II:+Purification+and+Culture+of+Human+Islets.">Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets.</a> J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).</li><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Transplantation+in+Seven+Patients+with+Type+1+Diabetes+Mellitus+Using+a+Glucocorticoid-Free+Immunosuppressive+Regimen.">Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen.</a> N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).</li><li>Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-Parametric+Islet+Perifusion+System+within+a+Microfluidic+Perifusion+Device.">A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device.</a> J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).</li><li>Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+device+for+multimodal+characterization+of+pancreatic+islets.">Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets.</a> Lab Chip. 9, 97-106 (2009).</li><li>Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Effects+Of+Intermittent+Hypoxia+In+Mice:+Steady+Versus+High+Frequency+Applied+Hypoxia+Daily+During+The+Rest+Period.">Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period.</a> AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).</li><li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+changes+in+glucose+and+insulin+regulation+during+intermittent+hypoxia+and+continuous+hypoxia.">Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia.</a> Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).</li><li>Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-specific+functional+studies+in+a+microfluidic+array+of+primary+mammalian+hepatocytes.">Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes.</a> Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).</li><li>Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+aerobic+and+anaerobic+bacteria+and+mammalian+cells+with+a+microfluidic+differential+oxygenator.">Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator.</a> Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).</li><li>Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+temporal+control+of+the+medium+gas+content+and+acidity+and+on-chip+generation+of+series+of+oxygen+concentrations+for+cell+cultures.">Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures.</a> Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).</li><li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly(dimethylsiloxane)+bioreactors+during+cell+culture.">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).</li><li>Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+integrated+microfluidic+platform+for+dynamic+oxygen+sensing+and+delivery+in+a+flowing+medium.">Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium.</a> Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions.">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).</li><li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates.">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

طرائق متعددة متكاملة في هذا الأسلوب جزيرة نقص الأكسجة الحاضر عدة نقاط لاحظ هنا لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. أول مواصلة الجزر المعزولة أن تتحلل وتتفكك في الثقافة بسبب الانزيمات الهاضمة من خلايا عنيبية. توحيد التجارب ل1-2 أيام بعد جزيرة العزلة وبالتالي حاسما في الحصول ع?...

نقص الأكسجة ديناميكية المهم في البيولوجيا، وتحديدا لزرع جزيرة نقص الأكسجة ديناميكية هو الفسيولوجية الهامة وكذلك المعلمة المرضية في جسم المريض في العديد من الأنسجة البيولوجية. التغيير في الأكسجين، على سبيل المثال، هو إشارة قوية التنموية في الأوعية الدموية. علاوة على ذلك، الأنماط المكانية والزمانية في نقص الأكسجة تعدل HIF1 ألفا وتلعب دورا في أمراض مثل سرطان البنكرياس. نقص الأكسجين هو أيضا عامل التباس مؤثرة على نتائج زرع جزيرة. في الآونة الأخيرة، وقد أثبتت زمنيا التذبذبات من نقص الأكسجة، أو نقص الأكسجة متقطعة (IH) الفوائد في &quot;شروط مسبقة&quot; الجزر 1. ومع ذلك، آثار نقص الأكسجين على حد سواء ثابتة وعابرة على جزيرة علم وظائف الأعضاء لديها حتى الآن يجب أن يفهم جيدا أو درس، ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود الأدوات المناسبة للسيطرة على جزيرة في المكروية. وأوعية دموية الجزر بشكل جيد في الجسم الحي الجزر البنكرياسية هي 50-400<html> المجاميع م كروي من خلايا الغدد الصماء، بما في ذلك خلايا بيتا وألفا الخلايا التي هي المسؤولة عن توازن الجلوكوز؛ 56. عندما تتعرض الجزر إلى الجلوكوز تنشيطية في الدم، وامتصاص تحلل يؤدي إلى إنتاج ATP، والذي يفتح البوتاسيوم ATP-الحساسة (K ATP) القنوات والنتائج في تدفق الكالسيوم الذي يقوم بتشغيل إيماس من حبيبات الأنسولين. الأكسجين مهم لدفع هذه العملية الأيضية بشكل كبير ويتأثر افراز الانسولين بشكل كبير من قبل ديناميكية تدفق الدم والأوكسجين، بالإضافة إلى تدرجات الجلوكوز. الجزر أداء بسهولة هذا الرد على الأنسولين الجلوكوز في الجسم الحي كما و perfused غاية في البنكرياس، كل في طول خلية واحدة من وعاء الشعرية. ومع ذلك، تتم إزالة شبكة كثيفة من الشعيرات الدموية intraislet بواسطة كولاجيناز خلال جزيرة العزلة 2،3. بالتالي، مقيدة سواء الأوكسجين والمغذيات الإمدادات إلى 100 ميكرومتر محيط بسبب القيود نشرها. خطوة &quot;&gt; التقنيات الحالية حدت النجاح في إعادة جزيرة المكروية الأوكسجين والجلوكوز ديناميات إعادة جزيرة في الأم، المفتاح لنمذجة الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض، من الصعب تحقيق مع الغرف ميتة القياسية التي تتطلب تدفق تفصيلا ويفتقر الرصد المستمر للوظائف جزيرة. علاوة على ذلك، علاجات زرع للنوع الأول من مرض السكري فضح الجزر المعزولة لنقص الأكسجين في النظام البابي الكبدي 4 التي لديها أقل بكثير ص 2 (&lt;2٪، 5-15 ملم زئبقي) مقابل البنكرياس الفسيولوجية (5.6٪، 40 مم زئبق). بعد الزرع، الطعوم جزيرة يستغرق أسبوعين أو أكثر إلى أن revascularized. وقد ثبت أن التعرض ميتة يضعف الجلوكوز الأنسولين آلية اقتران جزيرة ل. من بين العوامل تحفيز إفراز اقتران، إشارات الكالسيوم وإمكانات الميتوكوندريا، والأنسولين حركية يمكن بسهولة رصدها باستخدام على microfluidics. أظهرت أسلوبنا ميكروفلويديك السابقة هذا إعادةمراقبة آل الوقت مع التشكيل الدقيق للالمكروية مائي حول جزيرة واحدة 5،6. ومع ذلك، يتم وضع حرج الكمي من ضعف ميتة جزيرة عن طريق عدم وجود التحفيز ورصد التقنيات في وقت واحد. وبالتالي، والجمع بين السيطرة ميكروفلويديك الأكسجين ورصد جزيرة يمكن أن تحسن الدراسات نقص الأكسجة جزيرة. يمكن على microfluidics إعادة وتعدل المكروية المائية والأكسجين وقد استند تقنية قياسية للأنسجة والثقافة نقص الأكسجة دراسات عن غرف ميتة. بشكل عام، غرف ميتة توفر تركيزات الأكسجين واحدة مع موازنة مرات في ~ 10-30 دقيقة، تتعارض مع تحجيم دقيقة نقص الأكسجة الحيوية. استخدام اثنين من الدراسات الحديثة غرف مخصصة صغيرة لنقص الأكسجة التعرض المتقطع على الفئران كله، وكانت النتائج متضاربة بشأن الناجم عن استجابة الأنسولين الجلوكوز 7،8. نضع في اعتبارنا أنه في مستوى الحيوان كله، والأكسجين متنفس ليس تران مباشرةمن المقرر أن جزيرة بو الشعرية 2، وذلك بسبب التحكم في الجهاز التنفسي. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الدراسات لم يكن لديك مستويات الأكسجين موحدة، كما أنها لا توفر تدابير في الوقت الحقيقي على مستوى الأنسجة من الجزر. من ناحية أخرى، يمكن على microfluidics الأكسجين تجاوز هذه القيود عن طريق التحكم الأكسجين عبر شبكات قناة الغاز. علاوة على ذلك، على microfluidics متوافق مع التصوير الحي خلال التشكيل الأكسجين، وهو انجاز غير ممكن حاليا مع الغرف ميتة القياسية. وهناك عدد من هذه الرواية على microfluidics نهج الاستفادة من نفاذية الغاز من polydimethylsiloxane بحل تركيزات الأكسجين في microchannels التي تتدفق عبر وسائل الاعلام الخلايا المستهدفة 9-14. هذه الأجهزة أيضا دمجت عدة تركيزات الأكسجين منفصلة، ​​مضان مقرها أجهزة الاستشعار الأوكسجين، وحتى توليد الأوكسجين الكيميائي على رقاقة. على microfluidics القائم على انذياب السائل يجدون صعوبة في الحفاظ على الاستقرار، التدرجات مستمر كما قلتر يعتمد على خلط الحمل الحراري وهي حساسة في التدفق الظروف. في المقارنة، والتقنية التي نستخدمها هنا يركز على خفض مسار انتشار تسليم الأوكسجين. يتم القضاء على انذياب الغاز وتدفق القص عن طريق نشرها مباشرة الأكسجين عبر غشاء المصنف مع الخلايا أو الأنسجة جزيرة. هذا يزيل على microfluidics الإضافية المطلوبة للسيطرة على انذياب ويمنع إجهاد القص لا لزوم لها على الجزر، والتي يمكن أن تؤدي في حد ذاته إفراز الأنسولين. وقد استخدم هذا المنبر لإظهار أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) يصل التنظيم في كلا النقيضين مفرط التأكسج ونقص الأوكسجين (2-97٪ O 2) في خلية ثقافة 1،15. بسبب التسليم المباشر من الأكسجين وإزالة تدفق القص، وبرنامجنا القائم على نشر يوفر الحل الأمثل لدراسة ميكروفلويديك جزيرة نقص الأكسجة. التحفيز متعدد الوسائط والرصد يجلب على microfluidics القائم على نشر أيضا فوائد إضافية عند تكييفها لدراسة ميل جزيرةcrophysiology. باستخدام غشاء كحاجز نشرها، السائل يمكن أن تكون معزولة من التحويرات الأكسجين، مما يتيح التحكم من التحفيز الجلوكوز مائي مستقل من التحفيز ميتة. وهذا يخلق مثل شطيرة التحفيز المتزامنة التي مكانيا التسليم نقطة دبوس إلى الجزر. علاوة على ذلك، كما هو التضمين الغاز زمنيا عبر microinjectors المحوسبة، يمكننا أن تعدل تركيز الأكسجين 21-0٪ رقميا مع الوقت عابر أقل من 60 ثانية. عناصر التحكم الديناميكي من الأكسجين والجلوكوز المكروية في المجهر تسمح في الوقت الحقيقي بروتوكول المتعدد الوسائط التي لن يكون من الممكن أو مرهقة للغاية باستخدام غرف ميتة القياسية. باستخدام هذا الجهاز، تم رصد إشارات الكالسيوم (FURA-AM)، إمكانات الميتوكوندريا (رودامين 123)، وحركية الأنسولين (ELISA) لتوفير صورة كاملة للاستجابة الديناميكية الجلوكوز الأنسولين تحت نقص الأكسجين.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU8-2150/SU8-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Hotplate</td>
			<td>PMC Dataplate</td>
			<td>722A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Curing Lamp</td>
			<td>OmniCure</td>
			<td>S1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMDS</td>
			<td>Dow Chemical</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corona Wand</td>
			<td>ETP</td>
			<td>BD-20AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Chamber</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>420220000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdispensers</td>
			<td>The Lee Company</td>
			<td>IKTX0322000A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 V and 20 V DC Power</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI USB</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>NI USB-6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Omega Engineering, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipulse 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Sensor</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>NeoFox</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Collector</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Finnpipette II 100&#956;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Epifluorescence Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 4000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 Fluorescence Dye</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123 Fluorescence Dye</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 in Silicone Tubings</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/16 in x 1/8 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Eppendorf Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connectors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/16 in and 4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Connectors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>female Luer plug 1/16 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Connectors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/16 in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>1/16 in</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level

الأوكسجين في وقت واحد ورصد العوامل اقتران تحفيز إفراز الجلوكوز في تقنية واحدة هو أمر حاسم لنمذجة الدول المرضية في جسم المريض من جزيرة نقص الأكسجة، وخاصة في بيئات زرع. تقنيات غرفة ميتة قياسي لا يمكن أن تعدل كل من التحفيز في نفس الوقت ولا توفر مراقبة الوقت الحقيقي من العوامل اقتران تحفيز إفراز الجلوكوز. لمعالجة هذه الصعوبات، طبقنا تقنية ميكروفلويديك متعدد الطبقات لدمج كلا مائي والتحويرات المرحلة الغاز عبر غشاء نشرها. وهذا يخلق شطيرة التحفيز في جميع أنحاء الجزر microscaled داخل polydimethylsiloxane شفافة (PDMS) الجهاز، مما يتيح رصد العوامل المذكورة آنفا عن طريق اقتران مضان المجهري. بالإضافة إلى ذلك، يتم التحكم في إدخال الغاز بواسطة زوج من microdispensers، وتوفير، التحويرات دقيقة الفرعية الكمية من الأوكسجين بين 0-21٪. يتم تطبيق هذا نقص الأكسجين متقطع للتحقيق في ظاهرة جديدة من جزيرةر شروط مسبقة. وعلاوة على ذلك، مسلحة مع المجهري المتعدد الوسائط، استطعنا أن ننظر إلى الكالسيوم مفصلة وديناميات قناة K ATP خلال هذه الأحداث ميتة. نحن نتصور نقص الأكسجة ميكروفلويديك، وخاصة المرحلة المزدوجة هذه التقنية في وقت واحد، وأداة قيمة في دراسة الجزر فضلا عن العديد من أنسجة الجسم الحي السابقين.

المركزية إلى هذا الأسلوب جزيرة نقص الأكسجة هو القدرة على تعديل المائي والغازي التحفيز المرحلة في نفس الغرفة ميكروفلويديك مع العابرين دقيقة الحجم. الشكل 1 هو نتيجة ممثل أ) التحفيز المزدوج وب) التحويرات بسرعة تقاس داخل غرفة جزيرة. التشكيل المائي، كما هو موضح م...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level at JoVE.com

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

السيطرة الأكسجين ميكروفلويديك يمنح أكثر من مجرد الراحة والسرعة على غرف ميتة لإجراء تجارب بيولوجية. خصوصا عندما نفذت عبر نشر عبر غشاء، يمكن توفير الأكسجين السائل ميكروفلويديك المتزامن والتحويرات المرحلة الغاز على مستوى الميكروسكيل. هذه التقنية تتيح ديناميكية تجارب متعددة حدودي الحرجة لدراسة جزيرة الفيزيولوجيا المرضية.

التحكم الكمي والزمني للأكسجين المكروية في جزيرة واحدة المستوى

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

quantitative-temporal-control-oxygen-microenvironment-at-single-islet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.1K Views.  University of Michigan-Dearborn.  السيطرة الأكسجين ميكروفلويديك يمنح أكثر من مجرد الراحة والسرعة على غرف ميتة لإجراء تجارب بيولوجية. خصوصا عندما نفذت عبر نشر عبر غشاء، يمكن توفير الأكسجين السائل ميكروفلويديك المتزامن والتحويرات المرحلة الغاز على مستوى الميكروسكيل. هذه ا...

Video: Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

A فخ هيدرودينامي ميكروفلويديك المستندة للجسيمات واحدة

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

المكانية والزمانية التلاعب من نشاط GTPase الصغيرة على المستوى التحت خلوية وعلى المقياس الزمني من ثانية في الخلايا الحية

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in vivo. An area of research that holds promise in regenerative medicine is the combinatorial use of novel biomaterials and stem cells. A fundamental strategy in the field of tissue engineering is the use of three-dimensional scaffold (e.g., decellularized extracellular matrix, hydrogels, micro/nano particles) for directing cell function. This technology has evolved from the discovery that cells need a substrate upon which they can adhere, proliferate, and express their differentiated cellular phenotype and function 2-3. More recently, it has also been determined that cells not only use these substrates for adherence, but also interact and take cues from the matrix substrate (e.g., extracellular matrix, ECM)4. Therefore, the cells and scaffolds have a reciprocal connection that serves to control tissue development, organization, and ultimate function. Adipose-derived stem cells (ASCs) are mesenchymal, non-hematopoetic stem cells present in adipose tissue that can exhibit multi-lineage differentiation and serve as a readily available source of cells (i.e. pre-vascular endothelia and pericytes). Our hypothesis is that adipose-derived stem cells can be directed toward differing phenotypes simultaneously by simply co-culturing them in bilayered matrices1. Our laboratory is focused on dermal wound healing. To this end, we created a single composite matrix from the natural biomaterials, fibrin, collagen, and chitosan that can mimic the characteristics and functions of a dermal-specific wound healing ECM environment.

This protocol focuses on utilizing the inherent ability of stem cells to take cue from their surrounding extracellular matrix and be induced to differentiate into multiple phenotypes. This methods manuscript extends our description and characterization of a model utilizing a bilayered hydrogel, composed of PEG-fibrin and collagen, to simultaneously co-differentiate adipose-derived stem cells1.

مع تدبير هيدروجيل Bilayered التحكم ASC التمايز

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation من واحدة RNA الجزيئات بواسطة الملقط البصرية

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

تقنية تسمية خالية لتصوير المكانية والزمانية لإفرازات خلية واحدة

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

الاعتراف الجزيئية والهندسة مع البوليمرات الحيوية المحاكاة على واحدة المسورة الكربون الأنابيب النانومترية

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass substrate, that precisely controls the generation of tandem bubbles and individual cells patterned nearby with well-defined locations and shapes. We then demonstrate the generation of tandem bubbles by using two pulsed lasers illuminating a pair of gold dots with a few-microsecond time delay. We visualize the bubble-bubble interaction and jet formation by high-speed imaging and characterize the resultant flow field using particle image velocimetry (PIV). Finally, we present some applications of this technique for single cell analysis, including cell membrane poration with macromolecule uptake, localized membrane deformation determined by the displacements of attached integrin-binding beads, and intracellular calcium response from ratiometric imaging. Our results show that a fast and directional jetting flow is produced by the tandem bubble interaction, which can impose a highly localized shear stress on the surface of a cell grown in close proximity. Furthermore, different bioeffects can be induced by altering the strength of the jetting flow by adjusting the standoff distance from the cell to the tandem bubbles.

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&amp;#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

نظام ميكروفلويديك مع الزخرفة السطحية للتحقيق فقاعة التجويف (ق) التفاعل -Cell وBioeffects الناتجة على مستوى وحيدة الخلية

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

منصة موائع جزيئية أولتراهيغ الإنتاجية لتسلسل جينوم خلية واحدة

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

زخرفه هندسه مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية علي ركائز متوافقة للتحكم في ميكانيكا مستوي الانسجه

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.