هذا البروتوكول يولد بيانات عالية الإنتاجية النسخ من خلايا الجزر البشرية الفردية، والتي يمكن استخدامها لدراسة عدم تجانس الخلايا الأنتشروم، وتحديد نوع الخلية النادرة، وتنظيم الجينات في المرض. هذه التقنية يولد أكبر نطاق بيانات خلية واحدة ، وسهلة الاستخدام ، ولها وقت معالجة قصيرة إلى حد ما. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على الجزر من الأنواع الأخرى، وعلى التعريف الأنسجة المعزولة حديثا أخرى.
ومع ذلك، يجب تحسين البروتوكول ليناسب إجراءات الانفصام الخاصة بالأنسجة. من المهم إعداد خلايا منفصلة عالية الجودة. QC من تعليق الخلية قبل تقسيم خلية واحدة هو المفتاح، كما هو التعامل مع مستحلب بعناية وبسرعة.
بعض نقاط التفتيش الجودة مثل معرفة ما إذا كان قد انسداد رقاقة هي أفضل ينظر إليها من القراءة. بعد الحصول على الجزر البشرية والاحتضان بين عشية وضحاها، عد وانتقاء 200 إلى 300 الجزر باستخدام ماص P200. نقل الجزر إلى أنبوب مخروطي 15 ملليمتر يحتوي على خمسة ملليمترات من وسائل الإعلام جزيرة كاملة، قبل warmed إلى 37 درجة مئوية.
ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي بمعدل 200 مرة من G لمدة دقيقتين. pirate بلطف عظمى دون إزعاج بيليه على الجزء السفلي. إضافة ملليمتر واحد من محلول تفكك الخلية قبل الدافئة وتعطيل بيليه عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا.
احتضان الجزر في 37 درجة مئوية لمدة 9 إلى 11 دقيقة. كل ثلاث دقائق، ماصة صعودا وهبوطا ببطء لمدة 10 ثوان لفك الخلايا في خلايا واحدة. مرة واحدة في خلايا جزيرة منفصلة بشكل جيد والحل يصبح غائما، إضافة تسعة ملليلتر من وسائل الإعلام جزيرة كاملة وتصفية من خلال مصفاة خلية 30 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد 15 ملليلتر.
جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 400 مرة G لمدة خمس دقائق. التعرق وإعادة تعليق بيليه الخلية في 200 إلى 300 ميكرولترس من 1X برنامج تلفزيوني 04٪ BSA الحل. الآن ، مزيج 10 ميكرولترات من ثقافة الخلية مع 0.5 ميكرولترات من AO / DAPI.
الماصات صعودا وهبوطا لخلط شامل. تحميل 10.5 ميكرولتررس على شريحة وتشغيل فحص عدد الخلايا على عداد خلية تلقائية تستند إلى الفلوريس لتحديد عدد و قابل للاستمرارية. ضع شريحة ميكروفليدي في حقيبة رقاقة.
توجيه حقيبة رقاقة، وضمان آبار النفط هي الأقرب إلى الشخص الذي يقوم بإجراء التجربة. استخدام ماصة لإضافة حجم محسوبة من الخلايا في شرائط أنبوب المعدة. الماصات لخلط خمس مرات.
دون تجاهل نصائح ماصة، نقل 90 ميكرولترات من خليط الخلية إلى صف واحد من رقاقة. انتظر لمدة 30 ثانية ، ثم الماصات ببطء شديد لتحميل 40 ميكرولترات من حبات هلام إلى الصف الثاني. الاستغناء عن 270 ميكروليتر من تقسيم النفط إلى آبار الصف الثالث.
ربط طوقا رقاقة على علامات التبويب من حامل رقاقة. ضع حامل الشريحة المجمعة في جهاز تقسيم الخلايا المفردة واضغط على زر التشغيل. عند الانتهاء من التشغيل، وإزالة طوقا رقاقة من حامل، وفتح علبة رقاقة في زاوية 45 درجة، ونقل 100 ميكرولترات من المستحلب من رقاقة إلى بئر في البلاستيك الأزرق 65 لوحة جيدا.
الاستغناء 125 ميكرولترات من مستحلب وردي كسر الكواشف في كل مستحلب. الانتظار لمدة دقيقة واحدة، ثم نقل كامل حجم كل بئر في كل أنبوب 0.2 ملليلتر. تأكد من وجود طبقة واضحة وطبقة من اللون الوردي في شريط الأنبوب.
مع ماصة، وإزالة 125 ميكرولترات من طبقة الوردي من الجزء السفلي من شريط أنبوب دون إزعاج طبقة واضحة. فمن الطبيعي لحجم صغير من 15 ميكرولترات تقريبية من طبقة الوردي أن تبقى في أنبوب. ثم إضافة 200 ميكرولترات من تنظيف مزيج إلى كل من شرائط أنبوب واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
نقل شرائط أنبوب إلى موقف مغناطيسي وانتظر لمدة دقيقتين للسماح للحل لمسح. إزالة ناظر وتجاهل. ثم غسل الخرز مع 80٪ الإيثانول مرتين.
السماح للخرز لتجف لمدة دقيقة واحدة. إزالة شرائط أنبوب من المغناطيس وإضافة 35.5 ميكرولترات من محلول elution إلى الخرز. ماصة لإعادة تعليق الخرز في الحل واحتضان لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
نقل شرائط أنبوب إلى موقف مغناطيسي والسماح للحل لمسح. نقل الحمض النووي التكميلي المنقى من شرائط أنبوب لتنظيف 0.2 ملليلتر شرائط أنبوب. لتضخيم الحمض النووي التكميلي، أولا إضافة 65 ميكرولترات من المزيج الرئيسي تضخيم الحمض النووي التكميلي لكل عينة.
ضع شرائط الأنبوب في دراجة حرارة و قم بتشغيل البرنامج وفقًا للمخطوطة. يمكن تخزين العينات عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة. بعد تطبيع الحمض النووي التكميلي إلى 15 جناس و 20 ميكرولتر، aliquot 30 ميكرولترات من مزيج اطالة لكل عينة الحمض النووي التكميلية على الجليد.
وضع العينات في الترموستر وتشغيل بروتوكول اغضاد في 55 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، وتنخفض إلى 10 درجة مئوية وعقد. ثم إضافة 60 microliters من عينة مؤشر PCR ماجستير ميكس و 10 ميكرولترات من 20-micromolar مؤشر عينة ل30 ميكرولتر تنقية عينة الحمض النووي التكميلية. إعادة الأنابيب إلى ثيرموستر لتضخيم المنتج المكتبة النهائية.
تطبيع كل عينة بالماء إلى اثنين من نانوغرام لكل ميكرولتر وسحب ثلاثة ميكرولترات من كل عينة تطبيع معا في أنبوب 1.5 ملليلتر. تمييع تجمع مع عازلة elution إلى 0.25 نانوغرام لكل ميكرولتر. قم بعزل المسبح عن طريق الجمع بين 12 ميكرولترات من عينة المسبح المخففة، وميكر واحد من واحد أو مراقبة الحمض النووي، واثنين من ميكرولترات من عازلة elution، وخمسة ميكرولترات من هيدروكسيد الصوديوم العادي 0.4.
احتضان الخليط لمدة خمس دقائق، ثم إضافة 10 ميكرولترات من 200 ملليمتر تريس في pH8، وتحميل 4.05 ميكرولترات من الخليط إلى 1345.95 ميكرولترات من HTA-1. بعد ذلك، قم بتحميل 1.3 ملليلتر في خرطوشة المنظم وتشغيلها وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة باستخدام وصفة تسلسلية. على الكمبيوتر، قم بتشغيل Cell Ranger إلى ملفات الاستدعاء الأساسية الأولية de-multiplex التي تم إنشاؤها بواسطة التسلسل في ملفات FASTQ.
محاذاة ملفات FASTQ إلى تجميع الجينوم البشري b37.3 واستخدام نموذج جين CSC للحصول على كم التعبير. دراسة مخطط رتبة الباركود للتأكد من فصل الباركود الخلوي المرتبطة والخلفية. للتحكم في جودة الخلايا، استبعاد الخلايا التي تحتوي على أقل من 500 جينات تم اكتشافها، وأقل من 3000 عدد إجمالي من المعرفات الجزيئية الفريدة وأكبر من 0.2 درجة صلاحية.
ضبط القطع وفقا لأنواع الأنسجة والخلايا. بعد ذلك، استخدم mclust حزمة R لإزالة الخلايا التي تعبر عن أكثر من جين هرمون واحد. استخدام R حزمة seurat لتطبيع التعبير الجيني من قبل مجموع معرفات الجزيئية فريدة من نوعها وضرب من قبل عامل مقياس من 10،000 على مستوى الخلية.
ثم الكشف عن الجينات المتغيرة باستخدام التعبير المتوسط وتشتت جميع الخلايا. ضبط القطع وفقا لأنواع الأنسجة والخلايا. إجراء تحليل المكون الرئيسي مع الجينات المتغيرة.
خلايا نظام المجموعة مع عدد محدد من المكونات الرئيسية. اشتقاق الجينات العنقودية الخلية المخصب من خلال مقارنة كتلة خلية واحدة مع بقية الخلايا. في هذا البروتوكول تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة، تم فصل الجزر البشرية المكتسبة أولا كما تم التحقق من قبل خلايا ألفا وبيتا في الفلوريسينس RNA و C2 التهجين.
مثال ناجح من المستحلب بعد خطوة التقسيم يظهر موحد شاحب، حل غائم مع الحد الأدنى من تقسيم النفط فصل من حبات هلام. في المقابل، يمكن أن يكون مستحلب نوعية رديئة مع فصل مرحلة واضحة بين الخرز هلام والنفط بسبب تسد أثناء تشغيل رقاقة. بعد تضخيم الحمض النووي التكميلي، يظهر توزيع تمثيلي بحجم جزء الذروة النموذجية لعينة حمض نووي تكميلية ذات نوعية جيدة كانت قريبة من 1000 إلى 2000 زوج أساسي.
وكان الارتفاع بالقرب من 600 زوج من أزواج القاعدة خاص بالحمض النووي التكميلية. وكان التوزيع بحجم جزء لمكتبات تسلسل RNA بين 300 و500 زوج من أزواج القاعدة. كشف تحليل التجميع عن 12 نوعًا من الخلايا في مساحة أبعاد تضمين الجوار العشوائي الموزعة T.
تم الكشف عن ثلاثة مجموعات فرعية في خلايا ألفا وأربعة في خلايا بيتا. هذه التقنية تسمح للباحثين لبناء جزر الخلايا الشاملة للجليدات البشرية. مع المزيد من البيانات من المتبرعين غير السكري والسكري، ويستخدم للموارد لاكتشاف الهدف العلاجي.
